资源与环境科学现代农业科技圆园15年第24期一株巨大芽孢杆菌及其发酵培养基的优化李丽刘露闫红雪张鹏鹏梁文辉赵宏涛*渊青岛明月海藻集团有限公司海藻活性物质国家重点实验室袁山东青岛266000冤摘要以一株巨大芽孢杆菌为研究对象袁分别通过正交试验和单因素试验优化了其最佳发酵培养基及最适发酵条件遥结果表明院优化后的培养基配方为葡萄糖10g/L尧酵母膏5g/L和硫酸镁1g/L曰确定的最适发酵条件为温度30益袁初始pH值为8.0袁接种量5%袁装液量20mL/250mL袁发酵时间16h遥优化后的培养基及培养条件能够有效提高巨大芽孢杆菌M03的活菌数袁为其工业化生产提供理论基础遥关键词巨大芽孢杆菌曰培养基优化曰单因素试验曰正交试验中图分类号S144文献标识码A文章编号1007-5739渊2015冤24-0202-03渊QingdaoBrightMoonBlueOceanBiologicalTechnologyCo.袁Ltd.袁QingdaoShandong266000冤AbstractTheonefactortestandtheorthogonaltestwereusedfortheoptimizationofaliquidculturemediumforBacillusmegaterium.Theresultsshowedthatwhentheculturemediumcontainingglucose10g/L袁yeastextract5g/L袁MgSO41.0g/L袁andwithinitialpHvalueof8.0袁quantityof5%袁fluidvolume20mL/250mL袁after16hourgrowthundertemperature30益袁thebacillussubtilisgrowthcouldreachpeakvalue.TheoptimizedculturemediumcouldeffectivelyimproveBacillusmegateriumgrowth.KeywordsBacillusmegaterium曰culturemediumoptimization曰singlefactorexperiment曰orthogonalexperimentOptimizationofaCultureMediumforBacillusmegateriumLILiLIULuYANHong-xueZHANGPeng-pengLIANGWen-huiZHAOHong-tao*在现代农业生产过程中袁由于化肥和农药长期过量使用袁造成土壤酸化板结尧次生盐渍化加重尧肥力下降袁导致农药污染严重尧农产品的品质降低遥近年来袁随着人们环保和食品安全意识的增强袁生态农业和绿色食品受到广泛推崇袁使现代农业向绿色生态农业发展袁对环境友好型农资产品袁即生物有机肥尧微生物菌剂尧新型肥料等产品需求快速增剂的推广使用袁以实现我国农业的可持续发展[1]遥鉴定和保存遥培养基院种子培养基和初始培养基均为LB培养基曰主要试剂院葡萄糖尧玉米淀粉尧可溶性淀粉尧蔗糖尧麦芽糖尧牛肉膏尧蛋白胨尧酵母粉尧硫酸铵尧硫酸锰尧硫酸镁尧硫酸亚铁尧磷酸二氢钾尧磷酸氢二钾和碳酸钙遥仪器设备院超净工作台渊苏州净化冤尧高压蒸气灭菌锅渊太仓市试验设备厂冤尧pH测定仪渊梅特勒-托利多冤尧紫外分光光度计渊上海美普达有限公司冤尧电子天平渊赛多利斯冤尧控温摇床渊太仓市试验设备厂冤遥1.2试验方法1.2.1培养方法遥淤菌种活化及种子液制备院将实验室保存的巨大芽孢杆菌接种到LB斜面培养基上进行活化袁32益培养24h袁用接种环挑取一环接入装液量为50mL的250mL三角瓶中袁180r/min袁32益培养16h遥于摇瓶培养院按2%的接种量袁取1mL种子液接入盛有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中袁32益尧180r/min袁振荡培养16h袁进行发酵培养基及发酵条件优化的研究遥1.2.22%接种量接种至液体LB培养基中袁32益袁180r/min振荡培养30h遥培养过程每隔2h取一次样袁测定发酵液的吸光度发酵培养基的优化遥淤菌株生长曲线的测定院按照长遥目前袁人类面临各种能源尧环境压力袁迫切需要微生物菌.com.cn. All Rights Reserved.解磷细菌主要是土壤中的一类具有较强的溶解磷酸化合物能力的细菌的总称遥我国的土壤中含磷较多袁但绝大部分是以植物不能直接利用的不溶性的无机磷和有机磷形式存在袁而解磷细菌可以通过生化反应将植物不能利用的磷化物转变为可供作物利用的磷肥[2]遥研究证明袁解磷细菌对大豆尧水稻尧小麦等农作物以及多种果树的生长具有促进作用[3]遥巨大芽孢杆菌渊Bacillusmegatherium冤是农业上最常用的解磷细菌袁俗称为野大芽孢冶磷细菌袁具有很好的降解土壤中有机磷的功效[4]袁是生产生物有机肥及微生物菌剂的常用菌种遥该文以一株从植物体内分离的内生巨大芽孢杆菌为研究对象袁通过单因素试验和正交试验优化其发酵培养基及发酵条件袁并对其进行小试试验袁以期为大规模工业化发酵提供基础数据参考遥1材料与方法1.1试验材料菌种院于2013年8月青岛明月海藻集团有限公司海藻活性物质国家重点实验室从青岛胶南市大棚菠菜体内分离得到巨大芽孢杆菌渊Bacillusmegatherium冤M03袁并对其进行基金项目海洋经济创新发展区域示范项目野绿色农用生物产品多功能海藻肥项目冶遥作者简介李丽渊1986-冤袁女袁山东潍坊人袁硕士袁从事海洋活性物质相关研究工作遥*通讯作者收稿日期2015-11-04值渊OD600冤遥于最佳碳源的选择院分别用1%蔗糖尧葡萄糖尧麦芽糖尧可溶性淀粉和玉米淀粉作为培养基的碳源袁其他成分同初始培养基袁配制发酵培养基[5]遥32益尧180r/min袁振荡培养16h袁测定发酵液中的活菌数量遥盂最佳氮源的选择院分别用1%胰蛋白胨尧酵母粉尧牛肉膏尧硫酸铵尧胰蛋白胨+酵母膏渊1颐1冤尧胰蛋白胨+酵母膏+硫酸铵渊2颐2颐1冤作为培养基的氮源袁葡萄糖作为碳源袁其他成分同初始培养基袁配制发酵培养基[6]遥32益尧180r/min袁振荡培养16h袁测定发酵液中的活菌量遥榆最佳无机盐的选择颐以1%葡萄糖为碳源袁1%酵母膏+蛋白胨+硫酸铵渊2颐2颐1冤为氮源袁以不加无机盐的培养基为空白袁在此基础上分别加入0.4%的硫酸镁尧硫酸锰尧硫酸亚铁尧0.4%磷酸二氢钾和磷酸氢二钾复合盐渊1颐1冤尧碳酸钙袁配制发酵培养基袁32益尧转速180r/min袁振荡培养16h袁测定202李丽等院一株巨大芽孢杆菌及其发酵培养基的优化发酵液中的活菌量袁研究不同无机盐对菌株M03菌落数的影响遥虞正交试验设计及优化院选用L9渊33冤正交表进行试验[7]袁将上面获得的最佳碳源尧氮源和无机盐做进一步优化袁正交试验因素及试验水平设计见表1遥表1正交试验水平因素渊%冤水平1葡萄糖酵母浸出物MgSO20.5渊A冤0.5渊B冤0.14渊C冤31.01.51.01.50.31.2.3发酵条件的优化遥固定其他发酵条件袁采用正交试验0.5优化后的最佳发酵培养基袁对接种量尧发酵温度尧发酵时间及装液量进行优化[8]遥1.2.4发酵优化结果验证遥以初始培养基为对照袁采用优化后的发酵培养基和发酵条件袁对巨大芽孢杆菌M03进行摇床发酵袁测定其发酵液中的活菌数遥1.2.5数据处理遥采用SPSS10.0对正交试验结果进行方差分析[9]遥2结果与分析2.1发酵培养基优化2.1.1最佳碳源的选择遥不同碳源对巨大芽孢杆菌发酵液菌数的影响如图1所示袁可以看出袁巨大芽孢杆菌的生长在葡萄糖10尧蔗糖尧麦芽糖为碳源是比较好袁其活菌数均高于5伊8菌数CFU/mL袁说明巨大芽孢杆菌利用单糖和二糖的能力优于多糖袁明显超过利用可溶性淀粉和玉米淀粉时的活遥试验结果表明巨大芽孢杆菌生长的最佳碳源是葡萄糖袁其次是蔗糖遥9876543210葡萄糖麦芽糖蔗糖可溶性淀粉玉米淀粉图1碳源对巨大芽孢杆菌生长的影响2.1.2最佳氮源的选择遥不同氮源对巨大芽孢杆菌M03生长的影响如图2所示袁可以看出袁巨大芽孢杆菌在有机氮源上较好袁其最适氮源是酵母膏袁综合考虑发酵成本袁硫酸铵尧酵母膏尧胰蛋白胨组成的复合氮源较为合适遥2.1.3无机盐遥无机盐对菌株M03生长的影响结果如图3所示袁可以看出袁镁离子尧锰离子尧钙离子尧磷酸二氢钾和磷酸氢二钾渊1颐1冤复合组和对巨大芽孢杆菌M03的生长有一定的促进作用袁其生长量分别为对照组的1.20尧1.02尧1.13尧1.03倍遥其中锰离子和磷酸二氢钾和磷酸氢二钾渊1颐1冤复合组和对巨大芽孢杆菌的生长促进作用不明显袁但锰离子对其转芽孢率有明显作用遥铁离子则抑制巨大芽孢杆菌的生长袁其菌的生长量仅为对照的68.1%遥2.1.4碳源尧氮源和无机盐的正交优化遥从表2可知袁试验条件下优化水平的最佳组合为A2B1C2遥但由于MgSO4对菌121086420酵母膏牛肉膏胰蛋白胨硫酸铵组合一组合二图2氮源对巨大芽孢杆菌生长的影响876543210图3无机盐对巨大芽孢杆菌生长的影响数影A响不显著袁故结合生产成本调整培养基的组合为2酸镁B1C1袁即最佳培养基配方为葡萄糖1%尧酵母膏0.5%和硫0.1%遥极差分析表明袁对活菌数含量影响大小次序为酵母膏>葡萄糖>硫酸镁袁其中酵母膏和葡萄糖为极显著差异渊表3冤遥表2发酵培养基正交优化培养结果试验编号葡萄糖1渊酵母提取物MgSO渊420.5A冤渊0.1C冤108CFU/mL活菌数30.50.5B冤0.36.9740.51.00.56.8751.01.50.36.7461.00.50.57.4371.01.00.17.1281.51.50.57.0191.50.51.51.01.50.17.26表3正交试验方差分析0.37.046.83因素均方F值P>F葡萄糖0.05287778679.860.0015酵母提取物MgSO0.13640.000544011441110.0002.2发酵条件试验0.14755.570.875602.2.1生长曲线的测定遥由图4可知袁发酵培养0耀4h为巨大芽孢杆菌的生长停滞期袁细菌数量增加缓慢曰从4h开始进入对数生长期袁菌体数量呈对数生长曰10耀20h为巨大芽孢杆菌生长的稳定期袁菌体生长缓慢袁在16h达到生长高峰期6耀12曰20h后进入生长衰亡期袁菌体数量开始减少遥2.2.2h时的菌液作为种子液初始pH值的选择遥pH遥因此袁采用值主要通过影响菌体细胞膜203.com.cn. All Rights Reserved.资源与环境科学1.00.80.60.40.200510时间椅h152025图4巨大芽孢杆菌生长曲线电荷尧膜渗透性及营养物质离子化程度袁从而影响菌体对养分的吸收遥因此袁将研究发酵液的初始pH值对发酵液含菌数的影响[10]遥在配制了最佳培养基后袁将初始pH值分别调至5.0尧5.5尧6.0尧6.5尧7.0尧7.5尧8.0尧8.5尧9尧9.5尧10.0袁在摇瓶发酵培养条件下培养12h袁用分光光度计测其OD值遥由图5可知袁巨大芽孢杆菌的最适生长pH值为8.0袁在初始pH值7耀9范围内巨大芽孢杆菌均可良好生长pH值的适应性较宽曰但在pH值臆5.5袁说明巨大芽孢杆菌对下袁活菌数下降趋势明显袁说明巨大芽孢杆菌对强酸碱条件和pH值逸9.5条件耐性差遥1.00.80.60.40.20567初始pH8值9102.2.3发酵温度的选择图5pH值对巨大芽孢杆菌生长的影响遥酶对温度的反应呈现双重性袁酶反应速率会随着温度的升高而加快袁但如果温度过高袁酶会失去活性袁从而影响最终产量[11]遥由图6可知袁巨大芽孢杆菌生长的最适温度为1.030益袁在25耀35益范围内均可良好生长遥0.80.60.40.202025温度30椅益35402.2.4装液量的选择图6温度对巨大芽孢杆菌生长的影响遥测定不同装液量对发酵液活菌数的影响遥利用250mL的摇瓶袁选取20尧30尧40尧50尧60mL5个装液量袁培养12h后用比浊法测定活菌数[12]遥由图7可知袁装204现代农业科技圆园15年第24期液量为20mL时袁巨大芽孢杆菌的活菌数最大袁巨大芽孢杆菌的发酵是高需氧性发酵袁培养过程中应减少装液量袁同时提高通气量和转速袁以满足巨大芽孢杆菌的菌体生长需要遥1.00.80.60.40.2020253035装液量40椅mL455055602.2.5接种量的选择图7装液量对巨大芽孢杆菌生长的影响遥选取1%尧3%尧5%尧7%和9%5个接种量OD袁在摇瓶发酵培养条件下培养孢杆菌活菌数的影响很小值遥由图8可知袁在1%耀9%袁巨大芽孢杆菌生长的最适接种范围内时12h袁用分光光度计测其袁接种量对巨大芽量为5%遥1.00.80.60.40.2013接种量5椅%79图8接种量对巨大芽孢杆菌生长的影响2.3发酵优化结果的验证M03发酵液中的活菌数为选择优化后的发酵培养基和发酵条件袁巨大芽孢杆菌个/mL提高了8.08倍袁证实了正交试验和单因素试验对发97亿个/mL袁较初始培养基12亿酵培养基和发酵条件优化具有可行性遥3结论巨大芽孢杆菌作为一种重要解磷细菌被广泛应用于农业生产中袁将其优化培养制成菌剂肥料使用袁可以提高土壤肥质袁增产增收遥近年来袁随着微生物肥料在农业上的广泛应用袁巨大芽孢杆菌以其在土壤中的解磷作用而被深入研究袁是工业上生产解磷固钾肥的常用菌种袁同时在水体处理和提高烟叶发酵增香效果上有独特作用[13]遥本试验采用单因素和正交试验2种方法优化巨大芽孢杆菌M03的液体摇瓶培养基及发酵条件遥优化后的发酵培养基为酵母膏5g/L袁葡萄糖10g/L袁MgSO4发酵条件20院温度30益袁初始pH值8.01.0g/L曰最适培养基能有效地促进巨大芽孢杆菌mL/250mL袁发酵时间为16h遥根据数理统计分析袁接种量5%袁装液量为M03生长袁为巨大芽孢袁优化后的渊下转第216页冤.com.cn. All Rights Reserved.资源与环境科学先袁要判断即将发生的天气是雷暴曰其次袁如果已经确定了将要发生雷暴袁应判断其具体表现及强度遥第1判断院雷暴的触发机制可以是气团的整层抬升袁也可以是高空槽尧切变线尧低压尧冷涡系统影响等遥通过综合运用卫星云图尧数值预报产品尧8院00探空及上游指标站实况资料袁认真分析大尺度环流形势及天气尺度系统袁对照上述系统分型袁判断单站在未来12h内是否具备有利于雷暴天气发生的触发机制袁如存在则进入第2判断遥第2判断院位势不稳定层结是对流天气发生的重要条件袁可利用沙氏指数渊SI冤[2-3]尧抬升指数渊LI冤对大气位势不稳定层结作进一步判别遥沙氏指数渊SI冤也叫做稳定指数袁其表达式为院SI=T500-T忆850[4]现代农业科技圆园15年第24期表1北票地区2005要2014年6月雷暴发生日8院00各层的平均相对湿度渊%冤天气多年气候值雹+雷雨无雹+雷雨雹+小雨无雹+无雨地面84.184.284.875.554.4850hPa65.072.572.360.234.7700hPa57.464.165.747.436.8500hPa42.167.661.445.124.6400hPa40.858.055.732.921.7气干燥度对雷暴天气降水状态进行粗略判断遥其次袁在前面已提到过雹加小雨的分布特征中袁它的中低层相对湿度较高袁地面是75.5%袁比无雨时要大20%袁但比雷雨的情况又要小对湿度明显偏小近20%遥据此可以把雹加小雨的天气与另10%以上袁中高层渊700耀400hPa冤的相对湿度则比雷雨时相外2种对流天气区分开遥降雹并伴有雷雨的情况与无雹并伴有雷雨的湿度分布并没有什么区别袁如何区分这2种天气则需进入第5判断遥2个必要条件院一是500耀300hPa之间的厚度要小于3200第5判断院从气候分布概况来看袁北票地区发现冰雹有渊T忆850为850hPa空气块绝热抬升至500hPa时的温度冤遥郝莹等曾指出沙氏指数能对强对流天气的发生有较好的指示自由对流高度以上不稳定能量大小的指数遥其表达式为院示作用袁对雷暴有较好的指示意义遥抬升指数渊LI冤是一种表LI=T500-T忆sup渊T忆sup为地表空气块绝热抬升至500hPa时的温度冤遥一般SI尧LI为负值代表大气不稳定袁负值越大袁大气越不稳定遥若SI尧LI均为负值袁则进入第3判断遥m曰二是0益层要在4000耀4600m之间遥如某日的天气满雷雨遥4结语雷暴天气的预报一直以来都是夏季气象预报的重点足这2个条件袁则可判断出现冰雹天气袁否则只能产生强第3判断院在已做出气层不稳定层结判断后袁就要进一步考虑中低层水汽条件遥K指数在反映气层不稳定程度的同时考虑了中低层水汽条件遥其表达式为院K=渊T850-T500冤+Td850-渊T-Td冤700遥当K约20表示无雷雨曰20约K约25表示强度为孤立雷雨袁历史出现概率为35%曰25约K约30表示强度为零星雷与难点袁现有手段的监测与预警还局限于临近时段袁雷暴的预报相对较难袁且大多都集中在雷暴有无的判断上袁对雷暴天气现象性质与强度则无法进行预报遥本文通过引入判断树方法可以看出袁通过物理量场的甄选与判断袁基本可以初步实现对雷暴天气定性与强度定量的预报遥当然袁利用判断树方法预报雷暴天气还是相对较为粗糙的袁仍然难以满足气象精细化保障的需要袁因此袁该文拓展了对雷暴天气预报方法的研究袁以期能为雷暴天气精细化预报提供有益的借鉴遥[1]寿绍文袁励申申袁姚秀萍.中尺度气象学[M].北京院气象出版社袁2003.[2]章国材袁矫海燕袁李延香袁等.现代天气预报技术和方法[M].北京院气象出版社袁2001.[3]章国材.我国天气预报逐级指导技术研究[M].北京院气象出版社袁2001.[4]郝莹袁姚叶青袁陈焱袁等.基于对流参数的雷暴潜势预报研究[J].气象袁2007袁33渊1冤院51-56.[5]刘仙婵袁保广裕.西宁地区雷暴天气分析及预报方法研究[J].青海农业科技袁2011渊4冤院4-7..com.cn. All Rights Reserved.雨袁历史出现概率为55%曰30约K约35表示强度为分散雷雨袁历史出现概率为83%曰K跃35表示强度为成片雷雨袁历史出现概率为100%遥据此袁K指数是判断雷暴发生强度的重要因子遥当K跃20袁则进入第4判断[4-5]遥第4判断院判别雷暴天气的天气表象是强雷雨尧冰雹袁还是两者同时发生遥选取北票地区2005要2014年6月65个雷暴日个例天气资料进行统计袁分析结果表明渊表1冤院出现雷暴天气当日8院00袁从地面到400hPa整层大气异常潮湿袁与其他日常情况基本一样袁各层均比气候平均值大10%左右遥雹加小雨湿度分布则是中低层渊地面-850hPa冤较湿袁中高层却很干袁400hPa以上的相对湿度小于40%遥无雹无雨的天气则是整层干燥袁850耀700hPa各层的相对湿度小于40%袁500hPa以上则小于30%遥因此袁判断树中可用整层大渊上接第204页冤杆菌的实验室培养及工业发酵提供了理论依据遥4参考文献[1]沈德龙袁李俊袁姜昕.我国微生物肥料产业现状及发展方向[J].微生物学杂志袁2013袁33渊3冤院1-4.[2]范丙全袁唐玉霞袁孟春香.长期施肥对土壤溶磷微生物的影响[J].河北农业科学袁1999袁3渊3冤院9-12.[3]李法云袁高子勤.土壤要植物根际磷的生物有效性研究[J].生态学杂志袁1997袁16渊5冤院57-60.[4]李阜棣袁喻子牛袁何绍江.磷细菌的分离与纯化[M]//农业微生物学实验技术袁北京院中国农业出版社袁1995院90-92.[5]俞渭江.生物统计附试验设计[M].北京院中国农业出版社袁1991院300.[6]钱柔存袁黄仪秀.微生物学试验教程[M].北京院北京大学出版社袁5参考文献1999院198-199.[7]王进华袁戚薇袁陈莹袁等.凝结芽孢杆菌芽孢形成液体培养基的研究[J].杭州食品科技袁2003袁71渊4冤院5-10.[8]秦艳袁李卫芬袁黄琴.枯草芽孢杆菌发酵条件优化[J].菌制剂与微生物制剂袁2007渊12冤院70-74.[9]刘辉袁魏祥法袁井庆川袁等.一株枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化[J].山东农业科学袁2007渊1冤院100-102.[10]陈金春袁陈国强.微生物学实验[M].北京院清华大学出版社袁2005院85.[11]刘莹袁孙荣丹袁杨翔华袁等.地衣芽孢杆菌LNPU-1发酵条件研究及培养基优化[J].食品科技袁2006袁31渊8冤院78-81.[12]秦艳袁李卫芬袁余游东.蜡样芽胞杆菌培养条件的优化[J].饲料工业袁2008袁29渊2冤院34-37.[13]郑传进袁黄林袁龚明.巨大芽孢杆菌解磷能力的研究[J].江西农业大学学报袁2002袁24渊2冤院190-192.216