鲤多拷贝基因Apo-14kDa和ApoE的系统学分析和其在胚胎发育中的功能探索

胎发育中的功能探索

崔润滋;万玉美;孙金生;汪金兔;徐鹏;孙效文

【摘 要】Apolipoproteins, the protein moieties of lipoproteins, participate in physical activities in different forms. A 14 kDa apolipoprotein (Apo-14 kDa) and apolipoprotein E (ApoE) are thought to be associated with embryonic development in animals. We analyzed the gene structure and phylogenetic evolution of these two types of apolipoprotein in the

common carp {Cyprinus carpio). In addition, we documented the pattern of expression using RT-PCR to provide insight into their function during the embryonic development of carp. We obtained two types of Apo-14 kDa and four types of ApoE, including Apo-14kDa-a and Apo-14kDa-b (identity=79%), ApoE-al and ApoE-a2 (identity=91%), and ApoE-bl and ApoE-b2 (identity=90%). Phylogenetic analysis revealed that Apo-14 kDa-a has a close relationship with that of most other teleosts and that Apo-14 kDa-b has the closest relationship with that of grass carp. These

relationships likely reflect the early differentiation of the family Cyprinidae, although ApoE is characterized by four homologous genes. The expression of carp Apo-14 kDa-a was highest in the liver and head-kidney, was very low in the intestine, and undetectable in the remaining tissues. Conversely, we were only able to detect expression of Apo-14 kDa-b in the liver. We observed tissue specific differences in the expression of Apo-14 kDa-a and Apo-14 kDa-b. ApoE-al and ApoE-a2 were only detected in the intestine

whereas ApoE-bl and ApoE-b2 were present in the brain, skin, gill, liver, spermary, intestine, heart, muscle, body-kidney, and head-kidney. ApoE-bl was also present in the spleen and ApoE-b2 in the ovary. Our observations suggest there is considerable variation in the expression and function of ApoE. Furthermore, qRT-PCR analysis suggests that the expression of these six genes varies throughout embryonic development, both within and among genes. This is consistent with the molecular phylogeny of these genes. qRT-PCR analysis suggests that Apo-14 kDa and ApoE play an important role throughout different stages of embryonic development in common carp.%本研究首次从鲤(Cyprinus carpio)中得到2种形式的14 kD载脂蛋白(Apo- 14kD)和4种形式的载脂蛋白E(ApoE),分别为Apo- 14kDa-a和Apo- 14kDa-b(同源性为79％)、ApoE-a1和ApoE-a2(同源性为91％)以及ApoE-bl和ApoE-b2(同源性为90％).系统学分析表明,Apo-14kDa-a与多数硬骨鱼的Apo - 14kDa同源性高于与Apo- 14kDa-b的同源性,而Apo-14kDa-b与草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的Apo- 14kDa同源性较高,提示二者在鲤科鱼类中的分化时间较早；ApoE-a和ApoE-b的分化时间也应该处于鲤科鱼类分化的早期阶段,随后进一步分化出4个同源基因.半定量RT-PCR结果显示Apo-14kDa-a基因在肝、头肾中大量表达,肠中微弱表达,其他组织无表达,Apo-14kDa-b基因只在肝表达；ApoE-al基因和ApoE-a2基因只在肠表达；而ApoE-b1基因和ApoE-b2基因均在脑、皮肤、鳃、肝、精巢、肠、心脏、肌肉、体肾、头肾中表达,但在脾和卵巢发生表达分化.进一步的qRT-PCR检测发现6个基因在不同胚胎发育时期的表达模式也有较大不同,且在不同时期的表达均存在阶段差异性.另外,qRT-PCR分析证实Apo-14kDa基因和ApoE基因均有可能在鲤胚胎发育过程中发挥着重要且显著不同的作用.

【期刊名称】《中国水产科学》 【年(卷),期】2012(019)005 【总页数】15页(P741-755)

【关键词】鲤;载脂蛋白;Apo-14kDa;ApoE;分子系统学;胚胎发育;基因功能 【作 者】崔润滋;万玉美;孙金生;汪金兔;徐鹏;孙效文

【作者单位】中国水产科学研究院水产生物应用基因组研究中心,北京100141;天津师范大学生命科学学院,天津300387;中国水产科学研究院水产生物应用基因组研究中心,北京100141;天津师范大学生命科学学院,天津300387;中国水产科学研究院水产生物应用基因组研究中心,北京100141;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院水产生物应用基因组研究中心,北京100141;中国水产科学研究院水产生物应用基因组研究中心,北京100141 【正文语种】中 文 【中图分类】S917

大部分鱼类利用脂类作为能量的主要来源,而并非像哺乳类那样利用糖类作为主要能量来源,这就说明脂类的代谢和脂蛋白发挥的作用可能对维持鱼体的平衡更为重要[1]。载脂蛋白(apolipoprotein, 简写为 Apo)是脂蛋白的重要组成成分,参与脂类的摄入、分泌和转运[2]。目前, 已报道的载脂蛋白有 20 多种, 如 ApoA-I、A-II、A-IV、C-I、C-II、E、H和Apo(a)等, 它们通过不同的途径调节体内的脂质代谢。 与其他物种的载脂蛋白不同, 14 kD载脂蛋白(Apo-14kDa)目前仅在鱼类中有发现, 是鱼类高密度脂蛋白的重要组成成分, 被认为是鱼类特有的一种载脂蛋白[1]。

Apo-14kDa基因最早是Kondo等[3]在日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆和鉴定出来的。目前一些研究发现, Apo-14kDa可能在肝内皮细胞(也主要集中于此)的形成过程、幼鱼的生长发育过程等起着重要作用[4-5]。载脂蛋白E(ApoE)为载脂蛋白家族的重要成员之一, 具有细胞的识别和膜脂蛋白的内化作用[6-7]。一些学者认为哺乳类的 ApoE可能在脑的正常功能、认知及相对应的功能紊乱引发的疾病包括阿兹海默症(Alzheimer's disease)、脑损伤、中风等生理活动中发挥着重要的作用[8-9], 而鱼类的ApoE可能在鳍和鳞被的发育以及鳍的再生等生命活动中起着重要的作用[10-11]。还有研究发现, 该基因可能参与免疫反应, Chang等[12]发现草鱼(Ctenopharyngodon idellus)被寄生虫感染后, Apo-E和 Apo-14kDa的转录水平都上调。

鲤(Cyprinus carpio)是中国广泛养殖的鱼类之一, 经济价值较大。由于其在进化上的独特地位, 如基因组四倍化现象等, 使之成为水产和鱼类生理、进化生物学家的研究对象。近年来, 鲤的分子遗传学和基因组学研究取得了不小的进步,但目前国内外对鲤的胚胎发育的研究很少。因此,探索Apo-14kDa基因和Apo-E基因在胚胎发育过程中的具体机制是很有必要的。本研究基于鲤全基因组和转录组测序数据, 获取 Apo-14kDa基因和 Apo-E基因序列全长, 并系统检测和分析其组织表达特征和在胚胎不同发育时期的mRNA表达特征, 旨在探索载脂蛋白基因在鲤胚胎发育过程中发挥的作用, 为进一步探讨胚胎发育过程中的基因提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料和试剂

1.1.1 实验材料 成体鲤体质量(250.0±5.1) g,采自黑龙江水产研究所。实验室条件下暂养2周,保证鱼体健康。分别提取脑、肠、皮肤、心、鳃、肌肉、体肾、头肾、精巢、肝、脾、卵巢和血液组织并立即置于RNAlater中, -80℃冰箱保存。 不同发育时期的鲤胚胎, 采自黑龙江水产研究所, 收集后立即置于RNAlater中, -

80℃冰箱保存。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂Trizol, Super Script III First-Strand Synthesis System购自Invitrogen公司;胶回收试剂盒购自Promega公司; RNAlater购自Qiagen公司; 大肠杆菌 DH5α感受态细胞购自Tiangen公司, pMD18-T载体购自 TaKaRa公司;SYBR Green PCR Master Mix购自Applied Biosystems公司; 引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。 1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和cDNA合成 用Trizol试剂提取鲤全鱼各组织混合总RNA, 脑、肠、皮肤、心、鳃、肌肉、体肾、头肾、精巢、肝、脾、卵

1.2.2 序列的获取及克隆验证 鲤 Apo-14kDa基因、ApoE基因的cDNA序列的获取是通过利用斑马鱼和朝鲜相对应的基因cDNA序列与本实验室的鲤基因组数据库和转录组数据库进行比对、拼接获得。随后通过PCR产物测序对所获序列进行实验验证, 设计引物如表1, 具体流程是: 以全鱼各组织混合总RNA合成的cDNA为模板进行PCR反应, 将回收得到的 PCR产物与 pMD18-T载体连接, 连接产物转化大肠杆菌 DH5α感受态,挑取菌落培养并通过PCR鉴定阳性转化子, 提取质粒, 测序。

1.2.3 序列分析与分子系统学分析 应用BLASTX程序将测序所得序列与鲤基因组序列数据库进行比对分析, 确认目标基因序列的完整性。采用SignalP 3.0进行信号肽预测, 采用SMART分析其蛋白质家族结构域(pfam domains)、蛋白是否跨膜(transmembrane segments)和是否存在复合螺旋区(coiled coil regions)。 采集硬骨鱼类的Apo-14kDa和ApoE氨基酸序列, 以及人类和小鼠 ApoE氨基酸序列, 利用ClustalW 程序进行多重序列比对和分析, 利用系统学分析软件 MEGA4.0采用 NJ法分别构建Apo-14kDa和 ApoE在这些硬骨鱼类中的系统进化树, 其中人类和小鼠的 ApoE氨基酸序列作为系统树的外群。

1.2.4 半定量RT-PCR法分析Apo-14kDa基因和ApoE基因的组织表达特征 用半定量RT-PCR法比较目标基因在鲤 13个组织(脑、肠、皮肤、心脏、鳃、肌肉、体肾、头肾、精巢、肝、脾、卵巢和血液)中的 mRNA表达水平, 采用 β-actin基因作为参照基因。引物和PCR反应条件如表2所示, 实验中保证在PCR扩增的指数增长期内终止巢和血液组织RNA, 以及不同发育时期(受精后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、42 h、72 h、孵化后1 d、孵化后3 d、孵化后5 d)样品RNA。利用NanoVue Plus检测RNA浓度、A260/280, 随后利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。DNaseI处理上述所得RNA, 利用反转录试剂盒按照说明书提供的方法进行反转录反应合成各类cDNA, -20℃冰箱保存备用。反应。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测, 凝胶成像系统进行图像采集分析。 表1 序列获取试验引物和扩增反应条件Tab.1 Oligonucleotide primers and thermal cycling conditions of cloning引物名称 primer name 序列(5′-3′) sequence(5′-3′) 扩增条件 amplification condition 产物/bp product Apo-14kDa-a-F ATTTCTCTCTACAGGAATCTCACT Apo-14kDa-a-R CTGGGTGTTATTTATTTTTCCT Apo-14kDa-b-F TCTCTACAGGAATCTCACTAGCACA Apo-14kDa-b-R

ATTTAGTATGAGTCTTGTTGTTTCT ApoE-a1-F GGCGCTTCCTGTTTCAGGAT ApoE-a1-R CAGGTCTCCCAGAGTTGTCA ApoE-a2-F

TACTGTCCAAAAACAATCAT ApoE-a2-R TTCTCTGTGCTCTTCTCAAC ApoE-b1-F CTGGCTGTTTTTACTGGGGCT ApoE-b1-R

CCTCTCACAGAATGAAAAAAGC ApoE-b2-F ATCTTTGCTCTGGCTGTTTTTA ApoE-b2-R TGCTAACGAAAGACACTGAAAG 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30s, 60℃ 30 s,72℃ 30 s, 30个循环; 72℃7 min 651 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30 s, 60℃ 30 s,72℃ 30 s, 30个循环; 72℃ 7 min 715 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30

s, 55℃ 30 s,72℃ 30 s, 30个循环; 72℃ 7 min 565 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s,72℃ 30 s, 30个循环; 72℃ 7 min 724 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30 s, 60℃ 30 s,72℃ 30 s, 30个循环; 72℃ 7 min 911 95℃ 5 min 预变性; 95℃ 30s, 60℃ 30 s,72℃ 30 s, 30个循环; 72℃ 7 min 1053

表2 组织表达特异性试验引物和扩增反应条件Tab.2 Oligonucleotide primers and thermal cycling conditions of RT-PCR analysis引物名称 primer name 序列(5′-3′) sequence(5′ -3′) 扩增条件 amplification condition 产物/bp product Apo-14kDa-a-S-F ATTTCTCTCTACAGGAATCTCACT Apo-14kDa-a-S-R CTGGGTGTTATTTATTTTTCCT Apo-14kDa-b-S-F TCTCTACAGGAATCTCACTAGCACA Apo-14kDa-b-S-R ATTTAGTATGAGTCTTGTTGTTTCT ApoE-a1-S-F

GGCGCTTCCTGTTTCAGGAT ApoE-a1-S-R CAGGTCTCCCAGAGTTGTCA ApoE-a2-S-F TACTGTCCAAAAACAATCAT ApoE-a2-S-R

TTCTCTGTGCTCTTCTCAAC ApoE-b1-S-F CTGGCTGTTTTTACTGGGGCT ApoE-b1-S-R CCTCTCACAGAATGAAAAAAGC ApoE-b2-S-F ATCTTTGCTCTGGCTGTTTTTA ApoE-b2-S-R

TGCTAACGAAAGACACTGAAAG 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30 s, 60℃ 30 s,72℃ 30 s, 25个循环; 72℃ 7 min 651 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30 s, 60℃ 30 s,72℃ 30 s, 24个循环; 72℃ 7 min 751 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s,72℃ 30 s, 25个循环; 72℃ 7 min 565 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s,72℃ 30 s, 27个循环; 72℃ 7 min 724 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30 s, 60℃ 30 s,72℃ 30 s, 25个循环; 72℃ 7 min 911 95℃ 5 min预变性; 95℃ 30 s, 60℃ 30 s,72℃ 30 s, 25个循环; 72℃ 7 min 1053

1.2.5 qRT-PCR法分析不同发育时期Apo-14kDa基因和 ApoE基因的表达特征

设计引物用于荧光实时定量PCR反应, 引物列于表3中。首先, 使用相应的引物进行普通PCR扩增, 通过琼脂糖凝胶电泳检测是否存在非特异性扩增。随后取不同发育时期(受精后 0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、42 h、72 h、孵化后1 d、孵化后3 d、孵化后5 d)的cDNA样品作为模板, 在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行定量PCR反应, 反应条件如表1。15 μL 反应体系包含: 1 μL 的 cDNA(100 ng/μL),0.3 μL 的上下游引物混合液(10 μmol/L), 7.5 μL 的2×SYBR Green Master Mix, 6.2 μL的水。以 β-actin作为内参基因, 为确保实验数据的准确性, 每个发育时期的样品都进行 3次重复实验。另外, 每次实验均设置没有添加模板的空白反应作为阴性对照。实验数据通过ABI 7500的SDS软件进行分析, 采用2-ΔΔCt[13]的方法分析表达结果。 2 结果与分析

2.1 基因cDNA序列分析

图1 鲤Apo-14kDa-a cDNA的核苷酸和氨基酸序列带有阴影的序列表示信号肽; 下划线表示起始密码子; *表示终止密码子.Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Cyprinus carpio Apo-14kDa-a cDNAShadow marks signal peptide. Underline marks the start codon. * marks the stop codon.

图2 鲤Apo-14kDa-b cDNA的核苷酸和氨基酸序列带有阴影的序列表示信号肽; 下划线表示起始密码子; *表示终止密码子.Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Cyprinus carpio Apo-14kDa-b cDNAShadow marks signal peptide. Underline marks the start codon. * marks the stop codon. 将测序所得的 6条序列(提交至 Genbank,Apo-14kDa-a序列号是JQ038773, Apo-14kDa-b序列号是 JQ038774, ApoE-a1 序列号是 JQ038775,ApoE-a2 序列号是JQ038776, ApoE-b1 序列号是JQ038777, ApoE-b2 序列号是

JQ038778)分别与生物信息学方法所得的序列进行比对, 结果显示预测序列与克隆测序序列间的相似性达到99%。Apo-14kDa-a的cDNA序列长度为 757 bp, 编码141个氨基酸(图1), 采用SignalP 3.0分析预测了N末端的19个氨基酸为信号肽序列。Apo-14kDa-b的cDNA序列长度为733 bp, 编码139个氨基酸(图2), SignalP 3.0预测N末端19个氨基酸为信号肽序列。将Apo-14kDa-a与Apo-14kDa-b的核苷酸序列进行比对, 序列间相似性达到 84%, 二者的氨基酸序列间相似性为79%。ApoE-a1和ApoE-a2的cDNA序列长度均为793 bp, 编码2个氨基酸, 采用 SignalP 3.0分析预测其 N末端的 18个氨基酸为信号肽序列。SMART结果显示, 其蛋白不跨膜, 存在两个复合螺旋结构区域, 结构域属于载脂蛋白家族, 两条序列的核苷酸、氨基酸相似度分别为 94%和 91%(图 3、4)。ApoE-b1和ApoE-b2基因的cDNA序列长度分别为1 256 bp和1 269 bp, 均编码281个氨基酸, SignalP 3.0预测出二者的信号肽为N末端相同的一段有18个氨基酸的序列, SMART结果显示, 其蛋白亦无跨膜区部分, 存在两个复合螺旋结构区域, 结构域属于载脂蛋白家族, 两条序列的核苷酸、氨基酸相似度分别为91%和90%(图5、6)。将鲤ApoE-a与ApoE-b基因的氨基酸序列进行比对, 其相似性均在60%以上。

使用ClustalW程序把鲤Apo-14kDa氨基酸序列与从 GenBank、TGI数据库检索得到的银鲫(Carassius auratus gibelio, AY773183)、日本鳗鲡(AB046209)、斑马鱼(Brachydanio rerio, XM 693887)、朝鲜(Hemibarbus mylodon, FJ170111)、大西洋鲑(Salmo salar, TC104333)、 河鲀 (Tetraodon fluviatils, NM001032716)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides, DN552074)等15个物种的Apo-14kDa氨基酸序列进行比较。鲤 Apo-14kDa-a与朝鲜Apo-14kDa氨基酸序列之间的同源性最高为86%,与银鲫(84%)、草鱼(74%)、斑马鱼(73%)的 Apo-14kDa间同源性也较高, 与其他物种的同源性相对较低; Apo-14kDa-b与朝

鲜Apo-14kDa氨基酸序列之间的同源性也最高, 为81%, 与银鲫(72%)、斑马鱼(%)、大西洋鲑(58%)的同源性相对较高,与草鱼的同源性降为%, 其他物种亦相对较低。将鲤 ApoE-a、ApoE-b氨基酸序列与从 GenBank数据库查找到的人(M12529)、小鼠(NM009696)、中华鲟(Acipenser sinensis, GQ851930)、虹鳟(Salmo gaidnerii, AJ132620)、朝鲜(FJ170107,FJ170108)等7个物种的11条ApoE氨基酸序列进行比对。ApoE-a1、ApoE-a2与朝鲜ApoE-a氨基酸的同源性最高, 分别为84%、82%, 与斑马鱼ApoE-a(77%、77%)、朝鲜ApoE-b(65%、61%)的同源性次之, 与小鼠(27%、26%)、人(26%、25%)的同源性最低; ApoE-b1、ApoE-b2与朝鲜ApoE-b的同源性最高(%、86%), 与斑马鱼ApoE-b (86%、86%)、虹鳟(66%、67%)、朝鲜ApoE-a (63%、67%)的同源性也较高, 与小鼠(27%、26%)、人(26%、25%)的同源性也最低。

图3 鲤ApoE-a1 cDNA的核苷酸和氨基酸序列带有阴影的序列表示信号肽; 下划线表示起始密码子; *表示终止密码子; 黑体部分表示复合螺旋区.Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Cyprinus carpio ApoE-a1 cDNAShadow marks signal peptide. Underline marks the start codon. * marks the stop codon. The sequence in bold marks coiled coil region. 图4 鲤ApoE-a2 cDNA的核苷酸和氨基酸序列带有阴影的序列表示信号肽; 下划线表示起始密码子; *表示终止密码子; 黑体部分表示复合螺旋区.Fig.4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Cyprinus carpio ApoE-a2 cDNAShadow marks signal peptide. Underline marks the start codon. * marks the stop codon. The sequence in bold marks coiled coil region. 2.2 系统学分析

利用 MEGA4.0软件构建和绘制的鱼类Apo-14kDa基因的进化树(图7)。从该进化树可以看到, 鲤 Apo-14kDa基因的两个拷贝分别被聚类到了不同的分支中,

Apo-14kDa-a基因与属于鮈亚科的朝鲜、属于鲤亚科的银鲫和亚科的斑马鱼等的 Apo-14kDa基因之间的进化关系较近, 而Apo-14kDa-b基因则与雅罗鱼亚科的草鱼等的Apo-14kDa基因间的进化关系较近, 提示鲤基因组中两种Apo-14kDa基因的分化时间可能早于鲤科鱼类的分化时间, 或者发生在鲤科鱼类分化的非常早期, 两个基因呈现典型的旁系同源(paralogs)基因的进化关系。

图5 鲤ApoE-b1 cDNA的核苷酸和氨基酸序列带有阴影的序列表示信号肽; 下划线表示起始密码子; *表示终止密码子; 黑体部分表示复合螺旋区.Fig.5 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Cyprinus carpio ApoE-b1 cDNAShadow marks signal peptide. Underline marks the start codon. * marks the stop codon. The sequence in bold marks coiled coil region. 利用 MEGA4.0软件构建和绘制鱼类 Apo-E基因的进化树，如图 8所示。鲤ApoE基因同斑马鱼和朝鲜一样分为 ApoE-a和 ApoE-b, 提示在鲤亚科、亚科和亚科中, 该基因在分化后均保持了分化较为清晰的a和b两类ApoE基因。但是与斑马鱼和朝鲜不同, 本课题组在鲤发现了4个拷贝的ApoE基因, 分别为ApoE-a1、ApoE-a2、ApoE-b1和ApoE-b2。分子系统学分析表明ApoE-a1和ApoE-a2的相似度, 以及ApoE-b1和ApoE-b2的相似度均大于90%, 提示这种分化应该与鲤基因组最近的一轮复制事件相关, 大约发生在1 200万年前[14]。随后的空间表达和时间表达实验结果证实, 尽管此分化时间较短, 但是 4份基因拷贝均已经显示出了表达分化的趋势。

2.3 Apo-14kDa和ApoE基因的组织表达特异性分析

图6 鲤ApoE-b2cDNA的核苷酸和氨基酸序列带有阴影的序列表示信号肽; 下划线表示起始密码子; *表示终止密码子; 黑体部分表示复合螺旋区.Fig.6 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Cyprinus carpio ApoE-b2 cDNAShadow marks signal peptide. Underline marks the start codon. *

marks the stop codon. The sequence in bold marks coiled coil region. 利用半定量RT-PCR方法测定了鲤13个组织中的Apo-14kDa和ApoE基因的表达情况, 结果如图9所示。鲤的Apo-14kDa-a基因在肝、头肾中表达量最高, 在肠中有表达微弱, 在其他组织中则未见表达; Apo-14kDa-b基因只在肝中有表达,在其他组织中未见表达, 这和系统学分析结果一致, 鲤中两个Apo-14kDa表现出空间表达差异性,提示其可能在不同的组织中行使不同的基因功能。ApoE-a1基因和 ApoE-a2基因只在肠中有表达; ApoE-b1基因在脑、皮肤、鳃、肝和精巢中大量表达, 在肠、心脏、肌肉、体肾、头肾、脾中表达相对较弱, 其他组织无表达; ApoE-b2基因在脑、皮肤、鳃、肝和精巢中大量表达, 在肠、心脏、肌肉、体肾、头肾和卵巢中微弱表达, 其他组织无表达。结果提示 ApoE基因在鲤中的多个拷贝已经显示出分化的趋势, 但是还具有很多相似的空间表达特点。

图7 基于硬骨鱼类Apo-14kDa氨基酸序列构建的系统进化树Fig.7 Neighbor-joining phylogenetic tree based on teleost Apo-14kDa amino acid sequence

图8 基于ApoE氨基酸序列构建的系统进化树Fig.8 Neighbor-joining phylogenetic tree based on ApoE amino acid sequence 2.3 不同发育时期Apo-14kDa基因和ApoE基因的表达特征

以不同发育时期的鲤 cDNA为模板, 分析各个时期Apo-14kDa和ApoE的表达情况, 结果如图10所示。Apo-14kDa-a基因在受精后初始有微量表达, 随后不再表达, 在受精后12 h又开始表达,并随着时间的推移表达量不断增加, 直至孵化后3 d达到峰值, 随后表达量降低; 而Apo-14kDa-b基因与前者比较, 表达趋势相似, 但是整体表达水平均比前者要高, 在孵化后3 d达到峰值, 其相对表达量是Apo-14kDa-a基因的15倍左右, 提示Apo-14kDa-b可能在胚胎发育以及卵黄囊吸收和开口期起到较关键的脂类运输和代谢的功能。

图9 Apo-14kDa和ApoE在鲤各组织中表达的RT-PCR分析Fig.9 RT-PCR analysis of Apo-14kDa and ApoE gene expression in various tissues of Cyprinus carpio

图10 不同发育时期鲤Apo-14kDa、ApoE基因表达的qRT-PCR分析Fig.10 qRT-PCR analysis of Apo-14kDa and ApoE expression in different development stage of Cyprinus carpio

ApoE-a基因和 ApoE-b基因的表达特征具有显著差异。ApoE-b基因在受精后12 h(原肠胚期[15])即达到表达的峰值, 随后逐步降低表达丰度, 而ApoE-a基因却是受精后逐步提高表达丰度, 在孵化后5 d才达到表达峰值, 提示鲤的ApoE-a基因与 ApoE-b基因在其胚胎发育过程中发挥着完全不同的作用。4个拷贝的具体表达分析结果为:ApoE-a1基因在每一时期都有表达, 在刚受精时就有大量表达, 在受精后 12 h表达量骤然增加,随后降低, 在受精后72 h至孵化后3 d时表达量基本处于同一水平, 在孵化后5 d达到峰值; ApoE-a2基因的表达量明显高于ApoE-a1基因, 受精时有表达, 3 h无表达, 从 6 h开始表达量逐渐增加直至36 h, 随后直到孵化后3 d一直表现下降的趋势, 在孵化后 5 d达到峰值。比较 ApoE-a1和 ApoE-a2的时间表达特征可以发现, 尽管二者的表达变化趋势相似, 但是 ApoE-a1的表达丰度显著高于 ApoE-a1, 在表达中占主导地位, 提示二者在功能上的分化趋势。ApoE-b1基因是从受精后12 h开始表达且此时的表达量最高, 随后逐渐降低, 到孵化后 5 d表达量下降到最低水平;ApoE-b2基因在刚受精和受精后6 h有微弱表达,在受精后12 h表达量到峰值, 随后的表达趋势与ApoE-b1基因一致, 其表达量约为ApoE-b1的1/3。 3 讨论

3.1 鲤 Apo-14kDa和 ApoE 基因的序列分析及系统学分析

目前对于载脂蛋白的报道主要集中于哺乳类,对鱼类载脂蛋白的研究相对较少。载

脂蛋白是血浆脂蛋白的重要构件, 参与脂蛋白的装配、分泌、加工和分解代谢[16-17], 在生物体内发挥着极其重要的作用。Apo-14kDa是高密度脂蛋白(HDL)的组成成分之一, 因其序列与哺乳类的载脂蛋白无明显相似性, 被认为是鱼类特异的载脂蛋白[3, 12]。本研究首次发现鲤中存在两种形式的Apo-14kDa基因:编码141个氨基酸的Apo-14kDa-a和编码139个氨基酸的Apo-14kDa-b, 同源性达到79%。二者均有 1段长度为 19个氨基酸的信号肽序列, Apo-14kDa-a的信号肽序列与已报道的银鲫(Carassius auratus gibelio)[5]序列完全一致。现有研究资料表明, 鱼类中大多存在1种形式的Apo-14kDa基因。鲤是1种四倍体鱼类, 2n=100[18]。在进化过程中硬骨鱼存在基因组复制的过程, 而鲤染色体是大多数鲤科鱼类的两倍[19], 这表示可能相对其他鱼类, 鲤存在多1次的基因组复制和多1次的基因复制[14], 因此在鲤基因组中存在多种形式的Apo-14kDa基因是可能的。从图7可知, 鲤Apo-14kDa-a与朝鲜、银鲫的进化关系近, Apo-14kDa-b与草鱼的进化关系最近, 且二者间的进化关系相对较远, 是典型的旁系同源基因, 并且表达分析结果也表明二者可能出现功能分化, 分摊不同的功能,或者进化出了新的功能。Concha等[20]利用亲和色谱从鲤 HDLs中分离得到 ApoA-I 和 ApoA-II蛋白, 认为二者在鲤的先天免疫反应中起着重要作用, ApoA-II即为鲤的Apo- 14kDa。Choudhury等[21]分析了多种鱼的 Apo-14kDa和其他物种的ApoA-II、ApoC-II、ApoC-III氨基酸序列结构, 认为鱼类的Apo-14kDa序列缺少前体肽, 不一定和哺乳类的 ApoA-II序列一样保守, 推断鱼类的Apo-14kDa基因与哺乳动物的 ApoA-II基因有远源关系。

ApoE基因是生物体内广泛存在的一类基因,是载脂蛋白基因家族中研究较多的一类基因。本研究在鲤中发现4种形式的ApoE基因: 编码2个氨基酸的 ApoE-a1、ApoE-a2基因和编码 281个氨基酸的ApoE-b1、ApoE-b2基因, 在N末端有1段包含18个氨基酸的信号肽序列, 蛋白不存在跨膜结构, 有两个属于载脂蛋白

的复合螺旋结构区域。ApoE-a1和 ApoE-a2的同源性达到 91%,ApoE-b1和ApoE-b2的同源性达到90%, ApoE-a和 ApoE-b间的同源性在 60%以上。一些硬骨鱼中可能存在多拷贝 ApoE基因[22], 鲀如红鳍东方(Tetraodon

nigroviridis)[1]、斑马鱼[23]、朝鲜[24],这种现象可能是由于辐鳍鱼类在进化过程中发生的全基因组复制和一些硬骨鱼类存在的基因复制[25-27], 随后发生了功能分化。本研究发现了 4种形式的ApoE基因, 数量为斑马鱼的2倍, 可以利用“4R”假说[14]来解释这一现象。如图 8所示,鲤的2种ApoE-a与斑马鱼、朝鲜的ApoE-a聚到一个分支, 两种ApoE-b也与斑马鱼、朝鲜的ApoE-b聚到一个分支, 且同源性都很高, 说明鲤科鱼出现两种形式的 ApoE基因分化是出现在鲤科鱼类的物种分化之前, 随后的 ApoE-a和ApoE-b的进化相对比较保守。 3.2 鲤Apo-14kDa和ApoE mRNA在鲤不同组织中的表达情况

半定量 RT-PCR结果显示两种形式的 Apo-14kDa基因都在肝中表达丰富, Apo-14kDa-a在头肾和肠中也有表达, 揭示肝组织是两种形式 Apo-14kDa最主要的表达器官。肝是鱼类的贮脂器官[28],Apo-14kDa为载脂蛋白的成员之一, 也参与了脂类的运输和代谢, 这就可以解释为何两种 Apo-14kDa基因在肝大量表达。这一现象与银鲫[5]、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)[4]、朝鲜[24]等鱼类的结论一致。两种形式基因的组织表达差异暗示,两种基因可能发挥着不同的功能, 如 Apo-14kDa-a基因在头肾中表达丰富, 可能表明其参与鲤的免疫, 这在草鱼中已经被初步证实[12]。

鲤两种ApoE-a基因在肠中有表达, 这与红鳍东方 鲀 [1]、朝鲜[24]的结论相似。ApoE-b1和ApoE-b2的组织表达特征相似, 二者都在脑、皮肤、鳃、肝和精巢、肠、心脏、肌肉、体肾、头肾中有表达。此外, ApoE-b1在脾有表达, 而ApoE-b2在卵巢有表达, 这种空间表达分化暗示二者在体内发挥的作用可能不一致。一些研究发现, ApoE可能为雌性激素所控制[29-32], 这就可以解释为何从鲤卵巢中检测

到 ApoE-b2的存在。ApoE的这些组织表达特征也提示, 该基因在逐渐进行功能和表达特征的分化。

3.3 鲤Apo-14kDa和ApoE mRNA在鲤胚胎不同发育时期的表达特征 动物的胚胎发育是一个精细而严密的过程, 需要各种因子和转录因子的参与,因而胚胎发育实际上是基因组中多个发育相关基因在不同时间和空间进行特异性表达的结果[33]。在这个过程中, 需要大量的营养物质和能量来支持胚胎形成、组织器官分化和胚体的卵内运动等活动。脂类是鱼类的主要能量来源, 因此载脂蛋白参与的脂类代谢过程则发挥着极其重要的作用。本研究发现两种Apo-14kDa基因在胚胎发育期和仔鱼期的表达模式不同且呈现阶段差异性, 尤其是Apo-14kDa-b的表达量显著高于 Apo-14kDa-a。Apo-14kDa-a在刚受精时有微量表达, 这部分转录本可能来自亲本。Apo-14kDa-b从受精后第24小时开始表达, 说明该基因为非母源性基因, 这与银鲫[5]、斜带石斑鱼[4]的结论相符合。两种基因在受精后24 h至孵化后1 d的表达量基本上是呈现增加的趋势, 可能是由于这一阶段各种活动相对旺盛, 能量代谢活跃, 对基因的表达量要求相对较高。桂建芳等[5]探索该基因在银鲫胚胎期和仔鱼期早期的表达模式时, 发现其从囊胚期开始表达, 无母源性表达且将其在胚胎形成期的转录本和蛋白产物定位在卵黄合胞层(YSL), 推断Apo-14kDa对于银鲫胚胎形成期和幼虫发育期的消化器官形成是必须的。在孵化后3 d表达量达到最高值, 可能是由于这一时期为开口期, 个体从完全的内营养阶段进入到短暂的内外营养阶段和外营养阶段[34], 其营养方式发生了改变, 不再完全从自身携带的卵黄囊中摄取营养物质和能量,而是从环境中获取部分营养, 从而需要更多的载脂蛋白来运输和代谢脂类。

图10显示鲤胚胎发育期和仔鱼期ApoE基因的表达模式与Apo-14kDa基因是完全不同的。鲤ApoE-a和ApoE-b的表达模式也呈现不同的趋势。ApoE-a1与 ApoE-a2的表达模式相似, 随着时间的推移表达量呈上升趋势, 在孵化后 5 d达到

峰值, ApoE-a2表达量约是ApoE-a1的5倍; ApoE-b1与ApoE-b2的表达模式相似, 在受精后12 h达到峰值, 随着时间的推移表达量呈下降趋势,ApoE-b1表达量约是ApoE-b2的3倍。这些结果与上述Apo-14kDa的表达特征(从受精后24 h至孵化后 5 d, Apo-14kDa-b的表达量均明显高于Apo-14kDa-a)相似, 暗示每一型基因(ApoE-a1与ApoE-a2、ApoE-b1与 ApoE-b2、Apo-14kDa-a与Apo-14kDa-b)在胚胎发育期和仔鱼期发挥的作用有主次之分。鲤 ApoE基因的表达也呈现出阶段差异性, ApoE-a基因在刚受精时就有表达, 说明该基因为母源性基因; 而 ApoE-b1基因是从受精后 12 h(原肠胚期)开始表达为非母源性基因, 与中华鲟(Acipenser sinensis)[22]研究结果一致,ApoE-b2则为非母源性基因。ApoE-a和 ApoE-b的这种不同的表达模式, 说明了二者在胚胎发育过程中发挥了完全不同的作用, 出现了功能分化,这一推论与上述半定量RT-PCR分析结果一致。 本研究首次发现鲤中存在2种Apo-14kDa基因和4种ApoE基因, 分子系统学分析表明Apo-14kDa的a、b基因, 以及ApoE的a、b基因分化时间较早, 且已经有了显著的功能分化, 而 ApoE-a和ApoE-b进一步分化出的鲤特有的4份拷贝则可能形成在鲤最近一次全基因组复制时期, 由于时间较近, 其功能分化尚不完全。随后的组织表达和不同发育时期的表达分析验证了这一推测。而在不同发育时期的鲤样本上的定量表达分析证实了这两类 Apo基因可能和鲤的早期胚胎发育有关, 但是具体的作用和机制尚需进一步研究。 参考文献：

[1]Kondo H, Morinaga K, Misaki R, et al. Characterization of the pufferfish Takifugu rubripes apolipoprotein multigene family[J]. Gene, 2005, 346: 257-266.

[2]Havel. Lipoproteins and lipid transport[J]. Adv Exp Med Biol, 1975, 63: 37-59.

[3]Kondo H, Kawazoe I, Nakaya M, et al. The novel sequences of major plasma apolipoproteins in the eel Anguilla japonica[J]. Biochim Biophys Acta, 2001,1531(1-2): 132-142.

[4]Zhou L, Wang Y, Yao B, et al. Molecular cloning and expression pattern of 14 kDa apolipoprotein in orange-spotted grouper, Epinephelus coioides[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2005,142(4):432-437.

[5]Xia J H, Liu J X, Zhou L, et al. Apo-14 is required for digestive system organogenesis during fish embryogenesis and larval development[J]. Int J Dev Biol, 2008, 52(8): 10-1098.

[6]Weisgraber K H. Apolipoprotein E: structure-function relationships[J]. Adv Protein Chem, 1994, 45: 249-302.

[7]Mahley R W. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology[J]. Science, 1988,240(4852): 622-630. [8]Higgins G A, Large C H, Rupniak H T, et al. Apolipoprotein E and Alzheimer's disease: A review of recent studies[J].Pharmacol Biochem Behav, 1997, 56(4): 675-685.

[9]Horsburgh K, McCulloch J, Nilsen , et al. Increased neuronal damage and apoE immunoreactivity in human apolipoprotein E, E4 isoform-specific, transgenic mice after global cerebral ischaemia[J]. Eur J Neurosci, 2000,12(12): 4309-4317.

[10]Monnot M J, Babin P J, Poleo G, et al. Epidermal expression of apolipoprotein E gene during fin and scale development and fin regeneration in zebrafish[J]. Dev Dyn, 1999, 214(3):207-215.

[11]Tingaud-Sequeira A, Forgue J, Andre M, et al. Epidermal transient down-regulation of retinol-binding protein 4 and mirror expression of apolipoprotein Eb and estrogen receptor 2a during zebrafish fin and scale development[J]. Dev Dyn,2006, 235(11): 3071-3079.

[12]Chang M X, Nie P, Liu G Y, et al. Identification of immune genes in grass carp Ctenopharyngodon idella in response to infection of the parasitic copepod Sinergasilus major[J].Parasitol Res, 2005, 96(4): 224-229. [13]Schmittgen T D, Livak K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J]. Nat Protoc, 2008, 3(6):1101-1108. [14]David L, Blum S, Feldman M W, et al. Recent duplication of the common carp (Cyprinus carpio L.) genome as revealed by analyses of microsatellite loci[J]. Mol Biol Evol, 2003,20(9): 1425-1434. [15]陈少莲. 鲤鱼胚胎发育的观察[J]. 动物学杂志, 1960(4): 4.

[16]Gotto A M, Pownall H J, Havel R J. Introduction to the plasma lipoproteins[J]. Methods Enzymol, 1986, 128: 3-41.

[17]Li W H, Tanimura M, Luo C C, et al. The apolipoprotein multigene family: biosynthesis, structure, structure-function relationships, and evolution[J]. J Lipid Res, 1988, 29(3):245-271.

[18]余先党. 中国淡水鱼类染色体[M]. 北京: 科学出版社,19.

[19]黎双飞, 胡炜, 汪亚平, 等. 鲤鱼sGnRH基因克隆及其在成熟个体的表达分析[J]. 遗传学报, 2004(10): 1072-1081.

[20]Concha M I, Smith V J, Castro K, et al. Apolipoproteins A-I and A-II are potentially important effectors of innate immunity in the teleost fish Cyprinus carpio[J]. Eur J Biochem,2004, 271(14): 2984-2990.

[21]Choudhury M, Yamada S, Komatsu M, et al. Homologue of mammalian apolipoprotein A-II in non-mammalian vertebrates[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2009, 41(5):370-378.

[22]Li C J, Gan F, Chen X H, et al. Molecular and expression analysis of apolipoprotein E gene in the Chinese sturgeon,Acipenser sinensis[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2011, 158(1): -70.

[23]Babin P J, Thisse C, Durliat M, et al. Both apolipoprotein E and A-I genes are present in a nonmammalian vertebrate and are highly expressed during embryonic development[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 94(16): 8622-8627.

[24]Kim K Y, Cho Y S, Bang I C, et al. Isolation and characterization of the apolipoprotein multigene family in Hemibarbus mylodon (Teleostei: Cypriniformes)[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2009, 152(1): 38-46.

[25]Meyer A, Schartl M. Gene and genome duplications in vertebrates: the one-to-four (-to-eight in fish) rule and the evolution of novel gene functions[J]. Curr Opin Cell Biol, 1999,11(6): 699-704.

[26]Blomme T, Vandepoele K, De Bodt S, et al. The gain and loss of genes during 600 million years of vertebrate evolution[J]. Genom Biol, 2006, 7(5): R43.

[27]Moghadam H K, Ferguson M M, Rexroad III C E, et al.Genomic organization of the IGF1, IGF2, MYF5, MYF6 and GRF/PACAP genes across Salmoninae genera[J]. Anim Genet, 2007, 38(5): 527-532. [28]Ando S, Mori Y. Characteristics of serum lipoprotein features

associated with lipid levels of muscle and liver from five species of fish[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 1993, 59(9):1565-1571.

[29]Kishi K, Kitagawa E, Onikura N, et al. Expression analysis of sex-specific and 17beta-estradiol-responsive genes in the Japanese medaka, Oryzias latipes, using oligonucleotide microarrays[J]. Genomics, 2006, 88(2): 241-251.

[30]Martyniuk C J, Gerrie E R, Popesku JT, et al. Microarray analysis in the zebrafish (Danio rerio) liver and telencephalon after exposure to low concentration of 17alpha-ethinylestradiol[J]. Aquat Toxicol, 2007, 84(1): 38-49.

[31]Gunnarsson L, Kristiansson E, Förlin L, et al. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen--a microarray approach[J]. BMC Genom, 2007, 8: 149.

[32]Garcia-Reyero N, Griffitt R J, Liu L, et al. Construction of a robust microarray from a non-model species (largemouth bass) using pyrosequencing technology[J]. J Fish Biol, 2008,72(9): 23-.

[33]尹隽, 周莉, 刘军, 等. 银鲫pou2基因在胚胎发育过程中的时空表达图式[J]. 水生生物学报, 2007, 31(5): 629-636.

[34]Poupard G, André M, Durliat M, et al. Apolipoprotein E gene expression correlates with endogenous lipid nutrition and yolk syncytial layer lipoprotein synthesis during fish development[J]. Cell Tissue Res, 2000, 300(2): 251-261.