・１２０８’ 中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１０ Ｓｅｐ；２６（９）：１２０８～１２ 丹酚酸Ｃ诱导肝癌ＨｅｐＧ２细胞有丝分裂阻滞及凋亡的研究 杨华 ，程金建 ，梁钢 （１．广西医科大学药学院，２．广西壮族自治区人民医院肿瘤科，广西南宁５３００２１） 中国图书分类号：Ｒ ２８４．１；Ｒ ３２９．２４；Ｒ ３２９．２５；Ｒ ７３０．２３； Ｒ ７３０．５２ 文献标识码：Ａ文章编号：１００１—１９７８（２０１０）０９—１２０８—０５ 摘要：目的研究丹酚酸Ｃ（ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ，Ｓａｌ Ｃ）的体外 抗肿瘤细胞增殖作用及其分子机制。方法 Ｍ１Ｔｒ法检测 Ｓａｌ Ｃ对人肿瘤细胞的增殖抑制作用，流式细胞术检测细胞 周期分布及细胞凋亡，Ｇｉｅｍｓａ染色进行细胞有丝分裂的形 态学观察，微管蛋白聚合实验检测Ｓａｌ Ｃ对微管蛋白聚合活 性的影响，比色法检测细胞中Ｃａｓｐａｓｅ一３和Ｃａｓｐａｓｅ－６的活 性。结果丹酚酸Ｃ能抑制多种人肿瘤细胞增殖，其中对 ＨｅｐＧ２细胞的抑制作用较明显。流式细胞术分析发现Ｓａｌ Ｃ 使ＨｅｐＧ２细胞阻滞于Ｇ２／Ｍ期并随作用时间延长出现明显 的凋亡峰，细胞中Ｃａｓｐａｓｅ一３和Ｃａｓｐａｓｅ－６的活性升高。Ｇｉ— ｅｍｓａ染色提示ＨｅｐＧ２细胞发生有丝分裂阻滞。Ｓａｌ Ｃ能明 显抑制微管蛋白的聚合。结论Ｓａｌ Ｃ具有抗肿瘤细胞增殖 活性，通过抑制微管蛋白聚合诱导细胞有丝分裂阻滞从而诱 导凋亡。 关键词：丹酚酸Ｃ；抗肿瘤药；细胞周期；有丝分裂；微管蛋 白；凋亡 丹参是治疗心脑血管疾病的常用中药之一，有 着悠久的临床应用历史。其水溶性有效成分主要是 多种酚酸类化合物，包括丹酚酸Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ等。目 前对丹参水溶性成分的研究取得了一定成就，发现 丹酚酸类化合物具有多方面的药理作用¨ Ｊ。遗憾 的是，大部分研究都集中于总丹酚酸、丹酚酸Ａ、丹 酚酸Ｂ等化学成分，而对其它有效单体的研究较 少。从化学结构来看，丹酚酸既有咖啡酰缩酚酸结 构又有新木脂素骨架。新木脂素是一类广泛存在于 多种高等植物的天然产物，具有广泛的药理活性，包 括抗肿瘤、抗氧化、抗炎及免疫调节、镇痛以及心血 管方面的活性 ｊ，其中抗肿瘤活性一直是新木脂 收稿日期：２０１０—０５—０９，修回日期：２０１０～０６—１８ 基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ ３０７６０３１０）；广西医科大 学博士科研启动基金资助项目（Ｎｏ ３０８０４９） 作者简介：杨华（１９７７一），女，博士，讲师，研究方向：肿瘤药理学， Ｔｅｌ：０７７１，５３５８２７２，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙａｎｇｈｕａｚ＠１６３．ｃｏｎ； 梁钢（１９５７一），男，博士，教授，博士生导师，研究方向： 生化药理学，Ｔｅｌ：０７７ １—５３５８２７２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉａｎｇｇａｎｇ２２＠ｙａ— ｈ０ｏ．ｃｏｍ．ｃｎ 素药理作用研究的热点，小檗科鬼臼属植物中的鬼 臼毒素类木脂素及其半合成衍生物ＶＰ一１６（ｅｔｏｐｏ． ｓｉｄｅ）和ＶＭ．２６（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）已开发成为抗肿瘤药物 应用于临床 Ｊ。丹参水溶性成分中的丹酚酸Ｃ （ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ，Ｓａｌ Ｃ）是具有２一芳基苯并呋喃 结构的新木脂素，研究显示，许多天然或合成的苯并 呋喃类新木脂素化合物具有良好的抗肿瘤活性。从 中药花椒中提取到的２一芳基苯并呋喃化合物ａｒｉａｎ— ｔｈｏｉｄｏｌ，对乳腺癌细胞ＭＣＦ－７有抗增殖作用 Ｊ，云南 拟单性木兰中分离得到的３个苯并呋喃类木脂素， 对人肿瘤细胞株ＨＣＴ一８、ＳＩＨａ及ＧＬＣ一８２具有明显 的生长抑制作用 。Ｐｉｅｔｅｒｓ等 合成了一系列苯 并呋喃类化合物，体外实验表明，这些化合物对６Ｏ 种人肿瘤细胞均有不同程度的细胞毒作用。另有研 究报道 Ｊ，合成的一系列苯并呋喃类化合物具有明 显的抑制肿瘤血管生成作用。本研究旨在检测丹酚 酸Ｃ对人肿瘤细胞的增殖抑制作用以及对ＨｅｐＧ２ 细胞周期和凋亡的影响，并探索相关的机制。 １材料与方法 １．１药物与试剂丹酚酸ｃ购自上海沪云医药开 发有限公司，为黄色粉末，纯度＞９８％，用生理盐水 溶解。秋水仙碱为Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ公司产品，微管蛋白 聚合活性检测试剂购自Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ公司，Ｃａｓｐａｓｅ 活性检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司 产品。 １．２细胞培养与实验分组人肝癌细胞株ＨｅｐＧ２、 人宫颈癌细胞株ＨｅＬａ、人结肠癌细胞株ＨＴ２９、人肺 癌细胞株Ａ５４９、人鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２和人白血病 细胞株ＨＬ一６０均用含体积分数０．１０小牛血清的 ＲＰＭＩ １６４０培养液置３７ ｏＣ、５％ＣＯ２孵育箱培养。 实验均在细胞对数生长期进行，分别设溶剂对照 （Ｃｏｎｔｒｏ１）组和５－，１０、２０ ｔｚｍｏｌ・Ｌ 丹酚酸Ｃ组。 １．３方法 １．３．１ ＭＴＹ法检测丹酚酸Ｃ的抗增殖作用 取对 数生长期细胞接种于９６孔板，贴壁后加入不同浓度 的丹酚酸Ｃ，每个浓度设４个平行孔，培养７２ ｈ后 加人ＭＴＦ溶液，继续培养４ ｈ，弃去培养液，加入１５０ ｌ二甲基亚砜，振荡１０ ｍｉｎ，用酶标仪测定５７０／ ６３０ Ｂｉｌｌ双波长吸光度（Ａ）值，以Ｂｌｉｓｓ法计算半数抑 中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈ口ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１０ Ｓｅｐ；２６（９） ’１２０９・ 制浓度（ＩＣ 。）。 １．３．２流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡分 的敏感性相对较差。 Ｔａｂ １ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓａｌ Ｃ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ 别收集不同时间、不同浓度丹酚酸Ｃ处理的ＨｅｐＧ２ 细胞，ＰＢＳ洗涤两次，用体积分数为０．７０的乙醇固 定过夜。弃去乙醇，再次悬浮细胞于ＰＢＳ，溴化丙啶 ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ（ｘ±ｓ，ｎ：６） 染色５ ｍｉｎ，４℃避光３０ ｍｉｎ。在流式细胞仪上检测 细胞ＤＮＡ含量，得出细胞分布图以及凋亡细胞所占 比例。ＬＹＳＩＳ软件分析。 １．３．３ Ｇｉｅｍｓａ染色观察有丝分裂阻滞 丹酚酸Ｃ 处理ＨｅｐＧ２细胞２４ ｈ后，离心收集细胞，加入细胞 固定液固定，滴片于载玻片上，晾干后将载玻片置于 ２．２丹酚酸Ｃ对ＨｅｐＧ２细胞周期分布和凋亡的 Ｇｉｅｍｓａ染液中浸染，显微镜下观察。处于有丝分裂 期（Ｍ期）的细胞核膜消失，染色质松散分布于胞 质。随机计数２００个细胞，计算Ｍ期细胞所占的比 例，即有丝分裂指数（ＭＤ）。 １．３．４ 微管蛋白聚合活性测定 按试剂说明用 Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｕｂｕｌｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ溶解微管蛋白粉末并置冰浴， 影响流式细胞仪分析显示，不同剂量的丹酚酸ｃ 分别作用ＨｅｐＧ２细胞２４ ｈ后，细胞出现不同程度的 Ｇ，／Ｍ期阻滞（Ｐ＜０．０５）：对照组细胞Ｇ ／Ｍ期比例 为０．１６０±０．０３１，５、１０、２０ ｍｏＪ．Ｌ 丹酚酸ｃ组 Ｇ，／Ｍ期细胞比例分别为０．２５３±０．０２８、０．３８８± ０．０３２、０．４４０±０．０５３，见Ｆｉｇ １；细胞凋亡率呈剂量 依赖性和时间依赖性上升，见Ｔａｂ ２。 ２８０ ２４０ 微管蛋白溶液分为溶剂对照组、不同剂量丹酚酸ｃ 组和秋水仙素阳性对照组，分别加入相应药物后，混 合溶液加入冰浴的比色杯中，紫外分光光度计３４０ ｎｍ下调零；随后将比色杯置３７ ｑＣ恒温水浴保温，每 ５ ｍｉｎ测定一次吸光度（Ａ）值，直到４０～４５ ｍｉｎ Ａ值 无明显上升时止；以时问（ｍｉｎ）为横坐标，Ａ值 矗 ０ 基 ｊ ａ 童２ｏ０ 宝１６０ １２０ Ｕ ８Ｏ ４０ ０ ０ （Ａ ）为纵坐标，绘制各组微管蛋白聚合曲线，取 各组在４５ ｍｉｎ时的Ａ值，计算药物对微管蛋白聚合 的抑制率：抑制率／％＝（Ａ对ｊ！《｛一Ａ Ｂ“药）／Ａ对照Ｘ １００％。 ４００ ３２０ 矗 ２８０ ．３２０ ２８０ ２４０ １．３．５ Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｃａｓｐａｓｅ－６活性检测 按 ｏ Ｃａｓｐａｓｅ活性检测试剂盒说明，收集不同浓度丹酚酸 Ｃ处理的ＨｅｐＧ２细胞５×１０。个，加入Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ 基 ２４０ ０ 岳 ２００ １６０ Ｕ ２００ １６Ｏ ｌ２０ ８０ ４０ Ｏ １２０ ８０ ４０ Ｏ ０ ４０ ８Ｏ １２Ｏ１６Ｏ ２００ ２４０ ＤＮＡ Ｃｏｎｔｅｎｔ 冰上裂解２０ ｒａｉｎ，离心收集上清，加入反应缓冲液和 Ｃａｓｐａｓｅ底物（Ｃａｓｐａｓｅ一３底物为ＤＥＶＤ—ｐＮＡ， Ｃａｓｐａｓｅ－６底物为ＩＥＶＤ—ｐＮＡ），３７ ｑＣ避光孵育４ ｈ， 酶标仪测定４０５ ｎｍ波长处的吸光度值（Ａ螂 ）。 １．４统计学分析采用ＳＰＳＳ１２．０统计软件进行统 Ｆｉｇ １ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓａｌ Ｃ ｏｎ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ：Ｂ，Ｃ ａｎｄ Ｄ：５，１０ ａｎｄ ２０ ｐｍｌｏｌ・Ｉ 一 Ｓａｌ Ｃ ｇｒｏｕｐ 计学处理，数据以 ±Ｓ表示。细胞周期分析、有丝 分裂指数测定和Ｃａｓｐａｓｅ活性检测的实验组和对照 组均采用非参数Ｋｒｕｓｋａｌ—Ｗａｌｌｉｓ检验，微管蛋白聚合 活性检测实验组和对照组采用Ｆｒｉｅｄｍａｎ秩和检验。 实验结果至少重复３次。 ２结果 ２．１ 丹酚酸Ｃ体外抗肿瘤细胞增殖作用 丹酚酸 Ｔａｂ ２ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ Ｓａｌ Ｃ ｉｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ（ ±Ｓ．ｎ＝４） Ｃ对ＨｅｐＧ２等细胞的生长抑制作用结果见Ｔａｂ １。 由表可知，肝癌细胞ＨｅｐＧ２对丹酚酸Ｃ比较敏感， 鼻咽癌细胞ＣＮＥ２和白血病细胞ＨＬ－６０对丹酚酸Ｃ ２．３丹酚酸Ｃ诱导细胞有丝分裂阻滞Ｇｉｅｍｓａ染 色结果显示，不同剂量丹酚酸ｃ分别处理ＨｅｐＧ２细 ・１２１０’ 中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１０ Ｓｅｐ：２６（９） 胞２４ ｈ后，细胞呈现不同程度的有丝分裂阻滞。处 于有丝分裂期（Ｍ期）的细胞核膜消失，染色体深染 理ＨｅｐＧ２细胞４８ ｈ后，细胞中Ｃａｓｐａｓｅ一３和 Ｃａｓｐａｓｅ－６的活性均明显升高，与对照组比较差异具 且松散分布于胞质中（Ｆｉｇ ２ Ｂ，Ｃ，Ｄ），间期细胞核 膜完整，胞核呈圆形或椭圆形，染色均匀（Ｆｉｇ ２ Ａ）。 随机计数２００个细胞，计算其中有丝分裂期细胞所 占的比例即有丝分裂指数（ＭＤ），对照组的有丝分 裂指数为０．０３２±０．００８，５、ｌ０、２０ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ 丹酚酸 Ｃ组的有丝分裂指数分别为０．１０８±０．０１７、０．３３７± 有显著性（Ｐ＜０．０５）。５、ｌ０、２０ Ｉｘｍｏｌ・Ｌ 用药组 Ｃａｓｐａｓｅ一３活性分别是对照组的４．１倍、５．２倍、５．６ 倍，Ｃａｓｐａｓｅ－６活性分别是对照组的３．０倍、３．８倍、 ４．１倍，见Ｆｉｇ ４。 ０．０２１、０．２６３±０．０１５，丹酚酸Ｃ使有丝分裂指数明 显提高（Ｐ＜０．０５）。 一 。。 。＿ ０ ５ １０ １５ ２０ ２５ ３Ｏ ３５ ４０ ４５ Ｔｉｍｅ／ｍｉｎ Ｆｉｇ ３ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓａｌ Ｃ ｏｎ ｔｕｂｕｌｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ 。・４ ： ¨¨ 。 ０－３ 毒 ｏ一２ Ｆｉｇ ２ Ｍｉｔｏｔｉｃ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｙ Ｓａｄ Ｃ ｉｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ（×３００） Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｅｌｌｓ；Ｂ，Ｃ ａｎｄ Ｄ：５，１０ ａｎｄ ２０ ｍ０１．Ｌ一’Ｓａｌ Ｃ．ｔｒｅａ— ｔｅｄ ｃｅｌｌｓ 。・ｌ ２．４丹酚酸Ｃ对微管蛋白聚合活性的影响微管 。．。 蛋白溶液在０～４ ｏＣ是无色透明溶液，在３７℃保温 时，微管蛋白逐渐聚合成微管，溶液在３４０ ｎｍ的吸 Ｓａｌ／ｕ ｔｏｏｌ・Ｌ。‘ Ｆｉｇ ４ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｃｔｉｖｉｉｅｓ ｏｆ ｔＣａｓｐａｓｅ－３ ａｎｄ 光度（Ａ值）逐渐上升，并在一定时间内达到坪值。 根据测得的Ａ值对保温时间作图，可以绘制出特征 性的“Ｓ”型聚合曲线。干扰微管蛋白聚合的药物可 Ｃａｓｐａｓｅ－６ ｉｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓａｄ Ｃ（ ±Ｓ，ｎ＝４） 尸＜０．０５／）Ｓ ｃｏｎｔｒｏｌ 以使曲线形态发生改变，曲线坪值也随之发生变化。 ３讨论 实验结果显示，随着３７℃保温时间的延长，溶剂对 照组Ａ值经过短暂的潜伏期（５ ｍｉｎ）后开始逐渐升 高，在４５ ｍｉｎ时基本达到坪值；阳性对照秋水仙素 组Ａ值在整个保温过程中有轻微上升，其曲线坪值 明显低于对照组（Ｐ＜０．０５），对微管蛋白聚合的抑 制率为０．６５６；５、１０、２０ ｔｘｍｏｌ・Ｌ 丹酚酸Ｃ组的曲 中药的活性成分结构新颖，安全性高，不良反应 少，从中药中开发新的抗肿瘤药物具有极大的潜力。 许多研究表明，丹参水溶性成分具有抗肿瘤作用， Ｌｉｕ等 。。报道，丹参的水溶性提取物能明显抑制人 肝癌细胞株ＨｅｐＧ２的增殖并引起细胞形态的改变， 最终导致细胞凋亡；沈云婕等… 发现，注射用丹参 多酚酸盐可抑制人肺腺癌ＳＰＣ－Ａ－１细胞、人肝癌 ＳＭＭＣ．７７２１细胞、Ｂ淋巴瘤Ｒａｊｊ细胞和白血病ＨＬ一 ６０细胞的生长并诱导凋亡。上述报道多以丹参水 线坪值与对照组比较有不同程度的降低（Ｐ＜ ０．０５），对微管蛋白聚合的抑制率分别为０．２５９、 ０．５６７和０．６００，见Ｆｉｇ ３。 ２．５ 丹酚酸Ｃ对ＨｅｐＧ２细胞Ｃａｓｐａｓｅ－３和 溶性成分的混合物为研究对象，本研究发现丹参水 溶性单体成分丹酚酸ｃ对人肝癌ＨｅｐＧ２细胞有较 Ｃａｓｐａｓｅ－６活性的影响不同剂量丹酚酸Ｃ分别处 中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１０ Ｓｅｐ；２６（９） ‘１２１１・ 明显的增殖抑制作用，这与上述研究报道具有互补 性。 ［１］Ｄｕ Ｇ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｊ Ｔ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｅｒｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｒｅｄ ｓａｇｅ ｒｏｏｔ（Ｒａｄｉｘ Ｓａｌｖｉａｅｍｉｈｉｏｒｒｈｉｚａｅ）［Ｊ］． ＨｅｒａｌｄＭｅｄ，２００４，２３（６）：３５５—６０． 流式细胞仪分析显示，丹酚酸Ｃ作用细胞２４ ｈ 即可诱导明显的Ｇ ／Ｍ期阻滞。由于流式细胞仪不 能区分处于Ｇ 期和Ｍ期的细胞，故进行Ｇｉｅｍｓａ染 色观察细胞的有丝分裂情况，正常情况下，细胞的有 ［２］ 范焕琼，崔燎．丹酚酸Ｂ对体外培养新生大鼠颅骨成骨细 胞的影响［Ｊ］．中国药理学通报，２００８，２４（７）：９７８—９． ［２］Ｆａｎ Ｈ Ｑ，Ｃｕｉ Ｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｂ ｏｎ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ［Ｊ］． Ｐｈａｒｎｕｗｏｌ Ｂｕｌｌ，２００８，２４（７）：９７８—９． ［３］Ｓａｌｅｅｍ Ｍ，Ｋｉｍ Ｈ Ｊ，Ａｌｉ Ｍ Ｓ，Ｌｅｅ Ｙ Ｓ．Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｐｌａｎｔ ｌｉｇｎａｎｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ，２００５，２２（６）：６９６—７１６． ［４］ 王希斌，刘华钢，杨斌，等．两面针中木脂素化合物结晶一８对 致痛大鼠脑内Ｂ一内啡肽表达的影响［Ｊ］．中国药理学通报， 丝分裂指数为０．０３～０．０５，而丹酚酸Ｃ使ＨｅｐＧ２细 胞的有丝分裂指数升高至０．３３７，提示发生有丝分 裂阻滞。在有丝分裂期（Ｍ期），为了保证遗传物质 平均分配到两个子代细胞，姐妹染色单体的着丝点 必须与纺锤体两极发出的纺锤体微管相结合，才能 实现染色单体的分离。纺锤体在细胞进入Ｍ期时 由胞质中的微管蛋白聚合而成，若纺锤体装置出现 异常，姐妹染色单体就不能正确分离和移动，从而发 生Ｍ期阻滞 。作用于微管蛋白的化合物能够引 起Ｍ期纺锤体微管结构损伤，使细胞阻滞于Ｍ期， 这类化合物已作为抗肿瘤药物成功应用于临床，并 取得了良好的治疗效果，如长春碱类和紫杉醇类抗 肿瘤药¨ 。本研究中，丹酚酸ｃ能够抑制微管蛋白 聚合，其抑制作用与已知的微管蛋白抑制剂秋水仙 素类似，推测丹酚酸Ｃ诱导Ｍ期阻滞的机制可能与 其抑制微管蛋白聚合有关。 药物通过损伤纺锤体微管结构而使细胞阻滞于 Ｍ期，若损伤无法修复，就会引起细胞凋亡。目前 已知几乎所有的抗肿瘤药都是通过诱导细胞凋亡清 除肿瘤细胞的。在细胞凋亡过程中，Ｃａｓｐａｓｅ家族成 员发挥重要作用，其中下游Ｃａｓｐａｓｅ（如Ｃａｓｐａｓｅ－３，６ 和７等）活化后直接对凋亡细胞中的重要底物进行 剪切，使细胞解体¨ 。本研究结果显示，随着丹酚 酸Ｃ作用时间的延长，细胞凋亡率增加，同时细胞 中Ｃａｓｐａｓｅ一３和Ｃａｓｐａｓｅ－６的活性明显升高，可能是 药物不可逆地抑制微管蛋白聚合，细胞周期阻滞无 法进行，通过一系列信号传导途径使Ｃａｓｐａｓｅ活化， 从而引起细胞凋亡。 综上所述，丹参水溶性成分丹酚酸Ｃ具有抑制 肿瘤细胞增殖的作用，并且可能通过抑制微管蛋白 聚合、诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。作为 治疗心脑血管疾病的常用药，丹参水溶性成分的安 全性和稳定性得到了积极评价，因此，作为丹参水溶 性单体成分，丹酚酸Ｃ的抗肿瘤作用值得进行深入 研究 参考文献： ［１］杜冠华，张均田．丹参现代研究概况与进展（续一）［Ｊ］．医药导 报，２００４，２３（６）：３５５—６０． ２００９，２５（９）：１２５６—７． ［４］ ＷａｎｇＸ Ｂ， ｕＨ Ｇ，Ｙａｎｇ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌ－８ｆｒｏｍ Ｚａｎ－ ｔｈｏｘｙｌｕｍ ｎｉｔｉｄｕｍ（Ｒｏｘｂ．）ＤＣ．ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ３－ｅｎｄｏｒｐｈｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ｐａｉｎｆｕｌ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｐｈａｒｍｎｃｏｌ Ｂｕｌｌ，２００９，２５ （９）：１２５６—７． ［５］ 郑晓亮，刘雪莉，钱伯初．植物提取物诱导肿瘤细胞凋亡机制 研究进展［Ｊ］．中国药理学通报，２００４，２０（１１）：１２０１—５． ［５］Ｚｈｅｎｇ Ｘ Ｌ，Ｌｉｕ Ｘ Ｌ，Ｑｉａｎ Ｂ Ｃ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｌａｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｐｈａｒｍａ￣ｏｌ Ｂｕｌｌ，２００４，２０ （１１）：１２０１—５． ［６］ Ｆｏｋｉａｌａｋｉｓ Ｎ，Ｍａｇｉａｔｉｓ Ｐ，Ｍｉｔａｋｕ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｅｓｔｏｒｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｓａｒｃｏｍｅｌｉｃｏｐｅ ｍｅｇｉｓｔｏｐｈｙｌｌａ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｎｏｒｎｅｏｌｉｇｎａｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ，２００３，６９ （６）：５６６—８． ［７］程永现，周俊，谭宁华．云南拟单性木兰的化学成分【Ｊ］．云 南植物研究，２００１，２３（３）：３５２—６． ［７］Ｃｈｅｎｇ Ｙ Ｘ，Ｚｈｏｕ Ｊ，Ｔａｎ Ｎ Ｈ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ ｐａｒａ－ ｋｍｅｒｉａ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｂｏｔａｎ Ｙｕｎｎａｎ，２００１，２３（３）：３５２ —６． ［８］Ｐｉｅｔｅｒｓ Ｌ，Ｄｙｃｋ Ｓ Ｖ，Ｇａｏ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌ－ ｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｌｉｇｎａｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｓ ｐｏ— ｔｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｕｂｕｌｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．．， Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９９，４２（２６）：５４７５—８１． ［９］ Ａｐｅｍ Ｓ，Ｐａｐｅｒ Ｄ，Ｂｕｒｇｅｒｍｅｉｓｔｅｒ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｌｉｇｎａｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ，２００２，６５ （５）：７１８—２０． ［１０］Ｌｉｕ Ｊ，Ｓｈｅｎ Ｈ Ｍ，Ｏｎｇ Ｃ Ｎ．Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ ｒｇｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２０００，１５３（１－２）：８５—９３． ［１１］沈云婕，王松梅，朱瑁，潘銮凤．丹参多酚酸盐体外抗肿瘤作 用研究［Ｊ］．中国药房，２００８，１９（３Ｏ）：２３３２—５． ［１１］Ｓｈｅｎ Ｙ Ｊ，Ｗａｎｇ ＳＭ，Ｚｈｕ Ｊ，Ｐａｎ Ｌ Ｆ．Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｅｐｓｉｄｅｓ ｓａｌｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｈｉｏｒｒｈｉｚａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ『Ｊ １． Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２００８，１９（３Ｏ）：２３３２—５． ［１２］Ｒｉｅｄｅｒ Ｃ Ｌ，Ｓａｌｍｏｎ Ｅ Ｄ．Ｔｈｅ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｃｅｌｌ ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｍｉｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ＣｅｌｌＢｉｏｌ，１９９８，８（８）：３１０—８． ［１３］李燕，王永华，房华，等．紫杉醇类衍生物的定量结构一抗 癌活性关系研究进展［Ｊ］．中国药理学通报，２００８，２４（３）：２８８ ９３． ［１３］Ｌｉ Ｙ，ＷａｎｇＹＨ，ＦａｎｇＨ，ｅｔ ａ１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｔｈｅ ９ｕａｎｔｉ－ ａｔｉｖｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｕｌｌ，２００８，２４（３）：２８８—９３ ・１２１２。 中国药理学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１０ Ｓｅｐ；２６（９）：１２１２—５ 赖氨匹林对人宫颈癌ＨｅＬａ细胞的抑制作用及其机制研究 张乃菊 ，陈天平 ，董淑英 ，张月林 ，李筱俊 ，余美玲 ，祝晓光 （１．蚌埠医学院药学系药理学教研室，２．蚌埠市第二人民医院药剂科，安徽蚌埠２３３００４； ３．蚌埠医学院第一附属医院心血管内科，安徽蚌埠２３３０００） 中国图书分类号：Ｒ ３２９．２５；Ｒ ７３７．３３０．２２；Ｒ ９７７．３ 文献标识码：Ａ文章编号：１００１—１９７８（２０１０）０９—１２１２—０４ 但不影响总ＥＲＫ表达（Ｐ＞０．０５）。结论ａｓｐｉｓｏｌ对宫颈癌 ＨｅＬａ细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用，其作用机制可能与 抑制ＥＲＫ１／２的活化进而下调ＣＯＸ－２的表达有关。 关键词：赖氨匹林；ＨｅＬａ细胞；信号通路；ＥＲＫＩ／２；ＣＯＸ－２；凋亡 摘要：目的： 探讨ＥＲＫ１／２信号通路在赖氨匹林（ａｓｐｉｓｏ１）对 人宫颈癌ＨｅＬａ细胞抑制中的作用。方法分别采用ＭＴＦ比 色法、标准细胞集落形成分析法和Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ双染法分析 不同浓度ａｓｐｉｓｏｌ（１、５、１０ ｍｍｏｌ・Ｌ ）对ＨｅＬａ细胞增殖、细胞 集落形成及细胞凋亡的影响；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法检测细胞外信 号调节蛋白激酶（ＥＲＫ１／２）／磷酸化（Ｐ—ＥＲＫ１／２）和ＣＯＸ一２的 信号传导通路在细胞分化、增殖与凋亡中起着 重要作用。ＥＲＫ１／２是受外界刺激时决定细胞命运 的关键因素，ＥＲＫ１／２的活化是将信号从细胞表面 受体转导至胞核的关键步骤，ＥＲＫ１／２在刺激中被 激活，同时其持续活化最终促进细胞增殖和恶性转 表达。结果ａｓｐｉｓｏｌ（１、５、１０ ｍｍｏｌ・Ｌ ）可呈浓度依赖性抑 制ＨｅＬａ细胞的生长、降低克隆形成数量、诱导ＨｅＬａ细胞的早 期凋亡率、下调Ｐ—ＥＲＫ１／２及ＣＯＸ一２的表达水平（Ｐ＜０．０１）， 收稿日期：２０１０—０５—０９，修回日期：２０１０—０６～１９ 基金项目：安徽省教育厅自然科学重点研究资助项目（Ｎｏ ２００５ＫＪＯ４７ＺＤ） 化。目前，赖氨匹林（即阿司匹林与赖氨酸的复盐， 主要成分为阿司匹林）对宫颈癌ＨｅＬａ细胞的抑制 作用是否与ＥＲＫ信号通路有关尚不明确。本实验 旨在研究ａｓｐｉｓｏｌ对宫颈癌ＨｅＬａ细胞株ＥＲＫ１／２、Ｐ— ＥＲＫＩ／２和ＣＯＸ－２蛋白表达的影响，初步探讨ａｓｐｉｓｏｌ 作者简介：张乃菊（１９８１一），女，硕士，研究方向：生化药理学，Ｅ—ｍａｉｌ： ｚｉｙｕａｎｚｎｊ＠ｙａｈｏｏ．ｅｎ； 祝晓光（１９５２一），女，教授，研究方向：肿瘤生化药理学和心 脑血管药理学，通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｉｎｇｚｈｕ＿２００７＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ 在体外对人宫颈癌ＨｅＬａ细胞的抑制作用及其机制。 ａｎｄ ｍｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｐｈａｒｎｍｃｏｌ Ｂｕｌｌ，２００８，２４（１１）： １４０９一ｌ１． ［１４］张嘉杰，王广发，吴曙光．抗肿瘤药物与ｍｉＲＮＡ靶点相互作用 研究进展［Ｊ］．中国药理学通报，２００８，２４（１１）：１４０９—１１． ［１４］Ｚｈａｎｇ Ｊ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｇ Ｆ，Ｗｕ Ｓ Ｇ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｅｅｒ ｄｍｇｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｔｉｃ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ａｐｏｏｔｏｓｉｓ ｂｙ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｏａｔｏｍａ ＨｅｏＧ２ ｃｅｌｌｓ ＹＡＮＧ Ｈｕａ ．ＣＨＥＮＧ Ｊｉｎ－ｊｉａｎ ．ＬＩＡＮＧ Ｇａｎｇ （１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｃｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，？Ｃａｎｎｉｎｇ ５３００２１，Ｃｈｉｎａ；２．却 ｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ， ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａｕｔｏｎｏｍｏ￣Ｒｅｇｉｏｎ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ／ｎ ｖｉｔｒｏ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉ ｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ Ｏｌｌ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｅｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒ ｍｉｎｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ．Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐ— ｔｏｓｉｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｇｉｅｍｓａ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｅａ— ｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｔｏｔｉｃ ｐｈａｓｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｕ． ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ．ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｄｌｙ ａｒｉｅｓ— ｔｅｄ ｉｎ Ｇ２／Ｍ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ ｉｎｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ・－３ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ－６ ｉｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂ－－ ｓｅｒｖｅｄ．Ｇｉｅｍｓａ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｍｉｔｏｔｉｃ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｙ ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｅ ａｃｉｄ Ｃ．Ｔｈｅ ｄｒｕｇ ａｌｓｏ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｕｂｕｌｉｎ ｐｏｌ・ ｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ ｄｉｓｐｌａｙｓ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｉｔ ｂｌｏｃｋｓ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｕｂｕｌｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． １ｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｕｂｕｌｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｓｓａｙ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ．．３ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ－６ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｏｌｏｒｉ ． ｍｅｔｉｃ ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｒｓ Ｍ１Ｔｒ ａｓｓａｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓａｌｖｉ— ａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｃａｎｅ— ｅｒ ｃｅｌｌ １ｉｎｅｓ．ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ Ｃ；ａｎｔｉ—ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ；ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ；ｍｉｔｏｓｉｓ；ｔｕｂｕｌｉｎ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ