无血清神经球培养下神经干细胞的生长与分化

中国组织工程研究　７７誊筹１４　势２０１３—０４—０２出版　ｗ　。一．。　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ￣ｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｐ　ｒ｝Ｉ　２．２０１３　ＶｏＬ１７，Ｎｏ．１４　ｄｏｉ：ｌＯ．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ　２０９５—４３４４．２０１３．１４．０１８　ｆｎｔｔｐ：ｌｌｗｗｗ，ｃｒｔｅｒ．ｏｒｇ］　赵际囊　沈强．黄斐　无血清＿｛串经球培舞下种经干组匏的生长ｓ分化呲，中国维织Ｉ程磺究，２０１３．１７（１￣：２５９２—２５９６　无血清神经球培养下神经干细胞的生长与分化★　赵际奄，沈强，黄斐　上海交通大学附属上海市第一人民医院骨科，上海市２０００８０　文章亮点：　从大鼠大脑皮质提取神经干细胞，以悬浮细胞球的培养方法纯化干细胞，证明流式细胞技术可以成功鉴　定神经球中的细胞表达神经干细胞特异性标志物ｎｅｓｔｉｎ，并可较为准确的测定神经干细胞分化后的神经　元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的比例。　关键词：　干细胞；干细胞培养与分化；神经干细胞；神经球；细胞培养；无血清；悬浮；流式细胞技术：干细胞　图片文章　摘要　背景：体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的神经干细胞并掌握其生物学特性是神经干细胞移　植研究的前提。　目的：建立大鼠神经干细胞的分离、培养、纯化方法，进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分　化能力检测。　方法：利用无血清悬浮神经球方法分离培养胚胎来源的神经干细胞，进行形态学观察，用免疫细胞化学　方法检测神经干细胞及其分化细胞的标志物，流式细胞仪检测细胞标志物及其比例。　结果与结论：无血清悬浮神经球培养下大鼠神经干细胞生长稳定，操作简单，可大量分离、纯化、扩增　神经干细胞，所获细胞具有神经干细胞的一股生物学特性，流式细胞仪检测第３代神经干细胞巢蛋白达９１．５％，并具有多向分化潜能，免疫化学染色及流式细胞仪示神经干细胞可分化形成神经元，神经胶质　细胞和少突胶质细胞。　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒ０ｍ　ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ　Ｚｈａｏ　Ｊｉ—ｔｏｎｇ，Ｓｈｅｎ　Ｑｉａｎｇ，Ｈｕａｎｇ　Ｆｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏ￣ｈｏｐｅｄｉｃｓ，Ｆｉｒｓｔ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００８０，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ：／ｎ　ｖｉｔｒｏ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ．￣ｒｏｎｇ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌ　ｌｔｒａｎｓＤｌａｎｔａｔｉＯｎ．　０ＢＪＥＣＴＩＶＥ：ＴＯ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ｎｅｕｒａｊ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ／ｎ　ｖ／ｔｒｏ．　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｃｅｌＩ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．ａｎｄ　ｔｏ　ａｓｓｅｓｓ　ＳＵｒｆａｃｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｎｄ　ｍｕｌｔｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａＩ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ．　ＭＥＴＨＯＤＳ：ＮｅｕｒａＩ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒ０ｍ　ｒａｔ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｄｅｘ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ．ｆｅｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｌｍｍｕｎｏｃ￣ｏｃｈｅｍＩｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｘａｍｉＲｅ　ｔｈｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒａＩ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ　ＳＵｒｆａｃｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．　ＲＥＳＵＬＴＳ　ＡＮＤ　Ｃ０ＮＣＬＵＳＩＯＮ：ＮｅｕｒａＩ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｇｒｅｗ　ａｓ　ｆｒｅｅ—ｆｌｅａｔｉｎｇ　ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ—ｆｅｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉＳ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｃａｎ　ｉｓｏｌａｔｅ．ｐｕｒｉｆｙ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｙ　ｎｅｕｒａＩ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ／ｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｆｏｒ　９１．５％ｂｙ　ｆｌｏｗ　２５９２　ＰＯ．Ｂｏｘ　１２０＆Ｓｈｅｎｙａｎｇ　赵际童★，男，１９８５年生，　江苏省太仓市人，上海交　通大学医学院在读硕士，　主要从事神经干细胞与脊　髓损伤治疗的研究。　ｚｈａｏｌｉ３８３＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ　通讯作者：沈强，博士，　主任医师，教授，硕士生　导师，上海交通大学附属　上海市第一人民医院骨　科，上海市２０００８０　ｓｈｍａｉｌ１２３１⑨ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ　中图分类号：Ｒ３９４　２　文献标识码：Ｂ　文章编号：２０９５－４３４４　（２０１３）１４・０２５９２—０５　收稿Ｅｌ期：２０１２—０４—２５　修目日期：２ｏ１２．０６＿１４　（２０１２０４２５００５／Ｍ－ｓ）　１１０００４　ＶＶ￣，ｑ４／．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ　赵际童　等无血清神经球培养Ｆ神经　｝：组匏的生长与分化　ｗ　ｃ尺矾。　Ｚｈａｏ　Ｊｉ－ｔｏｎｇＳｒ，Ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｆｏｒ　ｍａｓｔｅｒ’Ｓ　ｄｅｇｒｅｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ　ＦｉｒＳｔ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｔ　ｐａｓｓａｇｅ　３，ａｎｄ　ａｌｓｏ　ｈａｖｅ　ｍｕｌｔｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｐｏｔｅｎｔｉａ１．Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｃａｎ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｎｅｕｒｏｎｓ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｏｌｇｏｄｅｎｄｒｉｏｃｙｔｅｓ．　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ；ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ；ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｐｈＯｔＯｇｒａｐｈｓ—ｃＯｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐａｐｅｒ　２０００８０，Ｃｈｉｎａ　ｚｈａｏｌｉ３８３＠　ｓｏｈｕ　ｃｏｍ　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：Ｓｈｅｎ　Ｚｈａｏ　ＪＴ，Ｓｈｅｎ　Ｑ，Ｈｕａｎｇ　Ｆ．Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒ０ｍ　ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｑｉａｎｇ．Ｍ　Ｄ．Ｃｈｉｅｆ　ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．　Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ　ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，　Ｆｉｒｓｔ　Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００８０　Ｃｈｉｎａ　ｓｅｒｕｍ—ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｕｚｈｉ　Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ　Ｙａｎｊｉｕ．２０１３；１７（１４）：２５９２－２５９６．　０引言　ｓｈｍａｉｌｌ２３１＠ｙａｈｏｏ　ｃｏｍ　近年来利用神经干细胞移植治疗神经系统损伤和退行性疾病逐渐受到广泛关注。神经干　细胞是指神经系统中保持持续增殖能力和具有多向分化潜能的细胞，可以分化为神经元、星　形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞移植入创伤性动物模型后，能够在一定程度上恢复　受损神经系统的功能【Ｉ－８］ｏ实验建立了一个简便、有效的原代培养、增殖和纯化神经干细胞的　方法，并观察大鼠神经干细胞的生物学特性及其分化潜能，为组织工程寻找良好的种子细胞　提供实践基础。　１材料和方法　设计：体外细胞培养实验。　时间及地点：于２０１１年１月至２０１２年４月在上海市第一人民医院实验中心完成。　材料：　实验动物：孕１４　ｄ　ＳＤ大鼠３只，体质量为３００　ｇ左右，由中科院上海实验动物中心提供，　实验动物许可证号：１００４２４３８，清洁级，实验过程对动物处置符合动物伦理学标准。　主要试剂：　Ｍａｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅａｇｅｎｔｓ：　试剂　来源　Ｇｉｂｃｏ公司　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基，Ｂ２７和胎中血清　表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子　一ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ公司　Ａｂｃａｍ公司　抗：兔抗大鼠ｎｅｓｔｉｎ多克隆抗体　小鼠抗大鼠１３　ＩＩＩ—ｔｕｂｕｌｉｎ多克隆抗体，兔抗大鼠ＧＦＡＰ多克隆抗体，小鼠抗大鼠　ＣＮＰａｓｅ多克隆抗体　荧光二抗　Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司　Ｊａｃｋｓｏｎ公司　Ｓｉｇｍａ公司　ＢＤ公司　兔抗大鼠Ｂ　ｉｌｉ－ｔｕｂｕｌｉｎ单克隆抗体，兔抗大鼠ＧＦＡＰ单克隆抗体，兔抗大鼠ＣＮＰａｓｅ　单克隆抗体　ＰＥ小鼠抗大鼠ｎｅｓｔｉｎ单克隆抗体　方：去：　神经干细胞的分离培养　”】：将ＳＤ大鼠用１　０％水合氯醛腹腔麻醉后，用体积分数７５％的乙醇浸　泡５　ｍｉｎ，无菌条件下取出胎鼠大脑皮质放入预冷的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液中，用眼科剪将组织块剪　成１　ｍｍｘ１　ｍｍｘｌ　ｍｍ大小，用吸管反复吹打后取上清液，通过２００目滤网过滤制成单细胞悬液，　收集单细胞悬液，８００　ｒ／ｍｉｎ（离心半径１２０　ｍｍ）离一１１，，１０　ｍｉｎ，弃上清，加入含有２％Ｂ２７，２０　ｐｇ／Ｌ　表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液重悬细胞，调节细胞浓度为　２ｘｌ　０。Ｌ－１接种到５Ｏ　ｍＬ培养瓶中，置于３７℃，体积分数为５％ｃｏ２的饱和湿度培养箱培养。　神经干细胞的培养、纯化及传代：将培养５—７　ｄ的神经干细胞收集到离心管中，８００　ｒ／ｍｉｎ（离　ＩＳＳＮ　２０９５—４３４４　ＣＮ　２１—１５８１／Ｒ　ＣＯＤＥＮ：ｚＬＫＨＡＨ　２５９３　赵际蕈　等无血清｝　经球培养　神绎于细匏的生长与分化　培养的神经干细胞纯度为９１．５％，利用无血清悬浮细胞球　方法传代后能够较好的富集提纯细胞并满足实验需求。　第３代神经干细胞经体积分数为１％胎牛血清诱导，随诱　导时间延长，形态学及流式细胞仪检测发现，诱导至第４　天，约有８０％的神经干细胞分化为神经细胞。另外神经　干细胞经单细胞悬液贴壁分化后，绝大部分是星形胶质　细胞，极少有神经元，少突胶质细　叫；而将神经干细　胞球直接贴壁分化【协２０】，神经元、少突胶质细胞数量明　显高于前者，这可能与神经干细胞的分化过程中，细胞　间的某种接触作用有益于神经元、少突胶质细胞的诱导　有关。实验表明，所培养的神经干细胞经诱导能逐步分　化为神经元和胶质细胞，失去多向分化的潜能。　实验成功地从胎鼠脑组织中分离出了神经干细胞　并培养、提纯、诱导成功，初步探讨了神经干细胞体外　的生长和分化特性，为进一步研究神经干细胞的细胞学　特性和临床应用建立了实验室基础。　感谢上海市第一人民医院实验中心提供实验平台。　名　豺：实验设计为第二作者，实验实施为第一作者，　实验评估为第三作者。第一作者成文，第二作者审校，第一、　二作者对丈章负责。　彳缢　究课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组　织直接或间接的经济或利益的赞助。　纶理要＝　实验过程中对动物的处置符合２００９年（（Ｅｔｈｉｃａｌ　ｉｓｓｕｅｓ　ｉｎ　ａｎｉｍａｌ　ｅ×ｐｅ　ｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ））相关动物伦理学标准的条例。　者翩文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，　无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他　人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。　４参考文献　Ｋａｗａｄａ　Ｈ，Ｔａｋｉｚａｗａ　Ｓ。Ｔａｋａｎａｓｈｉ　ｅｔ　ａ１．Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｃ￣ｏｋｉｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｂａｃｕｔｅ　ｐｈａｓｅ　ａＲｅｒ　ｃｅｒｅｂｒａＩ　ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ　ｉｓ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａＩ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｎｅｕｒａＩ　ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．　２００６；１１３（５）：７０１－７１０　Ｅｌｌｉｓ—Ｂｅｈｎｋｅ　ＲＧ，Ｌｉａｎｇ　ＹＸ，Ｙｏｕ　ＳＷ，ｅｔ　ａ１．Ｎａｎｏ　ｎｅｕｒｏ　ｋｎｉｔｔｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎａｎｏｆｉｂｅｒ　ｓｃａｆｆｏｌｄ　ｆｏｒ　ｂｒａｉｎ　ｒｅｐａｉｒ　ａｎｄ　ａｘｏｎ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａＩ　ｒｅｔｕｒｎ　ｏｆ　ｖｉｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ　ＮａｔＩ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．２００６；１　０３（１　３）：５０５４—５０５９．　Ｓｅｌｅｄｔｓｏｖ　ＶＩ，Ｋａｆａｎｏｖａ　Ｍ　Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ　ＳＳ，ｅｔ　ａ１．Ｃｅｌ　ｌｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｐａｌｓｙ．Ｂｕｌｌ　Ｅｘｐ　ＢｉｏＩ　Ｍｅｄ．２００５；１３９ｆ４）：４９９—５０３．　Ｈａｙａｓｈｉ　１ｗａｉ　Ｍ，ｌｋｅｄａ　ｅｔ　ａ１．Ｎｅｕｒａｌ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍ　ｉｇｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ／ｈｙｐｏｘｉｃ　ｉｎｊｕｒｙ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．２００５；１　０３８（１　１：４１－４９．　２５９６　Ｍ　ＣＲＴＥＲ．０ｒｇ　ｆ５１　Ｓａｖｉｔｚ　ＳＩ，Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ　ＤＭ，Ｄｉｎｓｍｏｒｅ　ＪＨ，ｅｔ　ａＩ．Ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｓｔｒｏｋｅ．Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏ１．２００２：５２（３）：２６６—２７５．　【６】　Ｒｉｄｄｌｅ　Ａ，Ｌｕｏ　ＮＬ，Ｍａｎｅｓｅ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｓｐａｔｉａｌ　ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｌｉｎｅａｇｅ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｏｔ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｆｌｏｗ　ｐｒｅｄｉｃｔｓ　ｆｅｔａｌ　ｏｖｉｎｅ　ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｗｈｉｔｅ　ｍａｔｔｅｒ　ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６；２６（１　１）：３０４５－３０５５　【７　７］Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖｓｋｙ　Ａ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ＡＭ，Ｄｅｒｒｉｃｋ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｎｓｏｒｙ　ｄｅｆｉｃｉｔｓ　ａｎｄ　ｏｌｆａｃｔｏｒｙ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎｊｕｒｙ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｎｏｖｅｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＥＭＲＩ　ｉｎ　ｎｅｗｂｏｒｎ　ｒａｂｂｉｔ　ａｆｔｅｒ　ａｎｔｅｎａｔａｌ　ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｓｃｈｅｍｉａ　Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ．２００６；３２（３）：１１０６－１１１２．　【８】Ｈａｙａｓｈｉ　１ｗａｉ　Ｍ，Ｉｋｅｄａ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ　Ｎｅｕｒａｌ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ／ｈｙｐｏｘｉｃ　ｉｎｊｕｒｙ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．２００５；１０３８（１１：４１—４９．　【９】　Ｊｏｈｎｓｏｎ　ＰＪ，Ｔａｔａｒａ　Ａ，Ｓｈｉｕ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３　ａｎｄ　ｐｌａｔｅｌｅｔ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｆｒ０ｍ　ｆｉｂｒｉｎ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｎｅｕｒａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ａｎｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ｉｎ　ａ　ｓｕｂａｃｕｔｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ＳＣＩ．　Ｃｅｌ　ｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１０：１９（１１：８９—１０１．　【１　０】Ｏｌｓｏｎ　ＨＥ，Ｒｏｏｎｅｙ　ＧＥ，Ｇｒｏｓｓ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ－ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌｌ—ｌｏａｄｅｄ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ　ｓｕｐｐｏＲ　ａｘｏｎａｌ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｅｃｔｅｄ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇ　ＰａｒｔＡ　２００９；１５（７）：１７９７—１８０５．　【１　１】Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ　ＣＤ，Ｓｌｏｔｋｉｎ　ＪＲ，Ｙｕ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ａｆｒｉｃａｎ　ｇｒｅｅｎ　ｍｏｎｋｅｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａＩ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　ｐｏｌｙｍｅｒ　ｓｃａｆｆｏｌｄｓ　ｓｅｅｄｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　２０１０；１８８（２）：２５８—２６９．　［１２】Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　ＢＡ，Ｗｅｉｓｓ　Ｓ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｎｄ　ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ　ｆｒＯｍ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｄｕｌｔ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２：２５５（５Ｏ５２）：１７０７—１７１０．　【１　３】Ｃｈｏｊｎａｃｋｉ　Ａ，Ｗｅｉｓｓ　Ｓ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｎｓ，ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　ｆｒ０ｍ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＣＮＳ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ．２００８；３（６）：９３５—９４０．　【１　４】　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　ＢＡ，Ｒｉｅｔｚｅ　ＲＬ．Ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ…ｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　２００５；２（５）：３３３－３３６．　［１５】Ｗａｎ　Ｆ，Ｚｈａｎｇ　Ｓ，Ｘｉｅ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｕｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ　ａｓｓａｙ，ＣＤ１　３３　ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｉｄｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｉｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｒａｉｎ　Ｐａｔｈｏ１．　２０１　０：２０（５）：８７７－８８９．　【１　６】Ｌｏｕｉｓ　ＳＡ，Ｒｉｅｔｚｅ　ＲＬ，Ｄｅｌｅｙｒｏｌｌｅ　Ｌ１ｅｔ　ａ１．Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒａｌ　ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ａｓｓａｙ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２ＯＯ８：２６（４）：９８８—９９６．　【１７】Ａｚａｒｉ　Ｈ，Ｌｏｕｉｓ　ＳＡ，Ｓｈａｒ￣ａｒ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｕｒａｌ—ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ａｓｓａｙ：ａｎ　ａｓｓａｙ　ｔｏ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ　ｂｏｎａ　ｆｉｄｅ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆ帕ｍ　ｎｅｕｒａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．Ｊ　Ｖｉｓ　Ｅｘｐ．２０１１；（４９）．ｐｉｉ：２６３９　【１　８】Ｈｕａｎｇ　Ｆ，Ｚｈａｏ　ＪＴ，Ｓｈｅｎ　Ｑ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｕｚｈｉ　Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ　Ｙａｎｊｉｕ．２０１２；１６（１１：８１—８４．　黄斐，赵际童，沈强－｛中经球方法体外无血清含生长因子培养的神　经干细胞主要向神经胶质细胞分化［Ｊ］ｌ中国组织工程研究，２０１２，　１６（１）：８１—８４．　［１９】Ｆｅｒｒａｒｉ　Ｄ，Ｂｉｎｄａ　Ｅ，Ｄｅ　Ｆｉｌｉｐｐｉｓ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒ０ｍ　ｎｅｕｒａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ｃｕｒｒ　Ｐｒｏｔｏｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ１．２０１０；Ｃｈａｐｔｅｒ　２：Ｕｎｉｔ２Ｄ　６．　［２０】Ｄｅｌｅｙｒｏｌｌｅ　ＬＰ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　ＢＡ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄ　ｄｉｆ『ｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｕｌｔ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ　ａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２００９；　５４９：９１—１０１．　ＰＯ．Ｂｏｘ　１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４　ｗｖｖ￣１．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ