高效液相色谱法测定绿茶中咖啡因含量

本科毕业论文 ( 2013 届 )

题 目：学 院：专 业：学生姓名：指导

合作导师：完成时间：成 绩：

高效液相色谱法测定绿茶中咖啡因含量 化学化工学院 职称（学位）：

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目 录

摘要................................................................................................................................ 3 引言................................................................................................................................ 4 1 提取实验.................................................................................................................. 6 1.1 提取实验原理................................................................................................... 6 1.2 仪器 .................................................................................................................. 7 1.3 试剂 .................................................................................................................. 7 1.4 主要装置图 ...................................................................................................... 7 1.5 咖啡因对照品的提取及提纯 .......................................................................... 7 2 检测实验.................................................................................................................. 8 2.1 仪器 .................................................................................................................. 8 2.2 试剂 .................................................................................................................. 8 2.3 色谱条件 .......................................................................................................... 9 2.4 溶液配制 .......................................................................................................... 9 2.4.1 咖啡因标准储备液 ................................................................................... 9 2.4.2 标准系列配制 ........................................................................................... 9 2.4.3 样品制备 ................................................................................................... 9 2.4.4 流动相(20mmol/L乙酸铵溶液)的配制.................................................10 2.5 色谱进样标准曲线的绘制 .............................................................................. 9 2.6 样品测定 ........................................................................................................ 13 2.7 回收率试验测定 ............................................................................................ 13 2.8 注意事项 ........................................................................................................ 15 3 结论........................................................................................................................ 16 参考文献...................................................................................................................... 17 致 谢............................................................................................................................ 18

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高效液相色谱法测定绿茶中咖啡因含量

摘要：本文主要是以茶叶为原料在索式提取器中用95%乙醇提取茶叶中的咖啡因作为标准样品，并配制标准系列溶液，实验简便、易操作，采用高效液相色谱法测定系列溶液及处理后的待测样品溶液，绘制出咖啡因标准曲线，并求出样品中咖啡因含量。高效液相色谱Aglient TC-C18（4.6×150）以20mmol/L乙酸铵溶液—甲醇（75:25）为流动相，在检测波长2nm的条件下测定。

关键词：咖啡因；高效液相色谱；含量

HPLC Method for the Determination of

Caffeine in Drinks

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College of chemistry and chemical engineering Applied chemistry

Meng Xiaoting(20907032037)

Direcyor：Guan Tingting (Lecturer)

Abstract：This article is based on tea as the raw material and used the method that extract the caffeine as the control products by adding tea in the Soxhlet extractor using 95% ethanol extraction. Then compound of the standard series solution. The experiment is very simplicity, easy controlling. And then used the HPLC method for the determination of the standard series solution and the sample solution afer treatment. Drawing the standard curve of caffeine, and found out caffeine content in the sample solution. The Aglient TC-C18 column (150 mm ×4. 6 mm) was used with 20mmol/L ammonium acetate solution – methanol (75:25) as the mobile phrase. Caffeine content of drinks was determined at 2 nm. Key Words：caffeine; HPLC; contents

引言

咖啡因是存在于茶叶、咖啡、可可以及某些植物中的生物碱之一，属黄嘌呤

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衍生物，它的化学名称是1，3，7-三甲基黄嘌呤，分子式：C8H10O2N4H2O。结构式如图1所示。

图1 咖啡因结构式

咖啡因为白色针状结晶，味苦，无臭，有风化性。能溶于水、乙醇、丙酮、氯仿等，微溶于石油醚，无水咖啡因的熔点为238℃。少量咖啡因

可以使身心处于兴奋状态，具有舒张血管，刺激机体的中枢神经，促进血液循环、预防高血压、心肌梗塞等药理和生理作用，增高机体的血糖平衡，使注意力集中。咖啡因亦能影响睡眠，所以入睡困难者晚上应减少其摄入量[1]。茶叶中含有较多的咖啡因，咖啡因约占茶叶干重的2%～5%，具有强心、利尿、解毒、消除疲劳等作用，应用前景广泛。然而过量的咖啡因则对身体有害，已有研究表明大量摄入咖啡因容易上瘾，导致慢性中毒，引起一些严重后果，如影响睡眠。一些动物和人体实验表明，过量饮用咖啡因会导致焦虑、烦躁、心律不齐。引发阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝脏、胃、肾等器官，诱发呼吸道炎症等。

咖啡因的摄入量可分为以下等级：成人每天摄入80～250mg咖啡因，（1.1～3.5mg/kg.d-1）为底摄入量，300～400mg(4～6mg/kg.d-1)为中摄入量，超过500mg(7mg/kg.d-1)为高摄入量。咖啡因是受国家管制的精神药品，我国食品添加剂使用卫生标准规定，可乐型饮料咖啡因最大使用量为150mg/kg，美国、加拿大、日本等国家则规定饮料中咖啡因的含量不能超过200mg/kg，南斯拉夫规定不得超过120mg/L，因此，国家要严格饮料及食品中的咖啡因含量。咖啡中含咖啡因约为1.2～1.8%，茶叶中约含2.0～4.7%，本实验是采用索氏提取法从茶叶当中多次提取咖啡因作为标准样品的。

目前，测定咖啡因的方法有很多种，如薄层色谱法[2-3]，紫外分光光度法[4]，电导率法[5]，高效液相色谱法[6-13]。紫外分光光度法是比较早地应用于测定咖啡因含量的，它是利用咖啡因结构上的嘌呤环具有共轭双键体系，因而具有独特的吸收光谱[14]。但紫外分光光度法测的实际上是茶叶中嘌呤碱的总量[15]，所以较纯的咖啡因的测定才可用紫外分光光度法。薄层色谱法是一种微量分离方法[16]。薄层层析-紫外分光光度法可以很好地测定咖啡因含量，它是借助于混合物中的组分在互不相溶的两相间进行吸附或分配来达到分离的目的。然后将分离出的咖啡因刮板、洗脱，在特定波长下测定咖啡因含量[17]。但是此法的缺点也有很多，

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如人为因素干扰大，刮板的干净度、洗脱程度，不同人员操作结果不同，偏差较大，准确度低。本文采用的是高效液相色谱法对咖啡因进行测定的，高效液相色谱法是目前国家的通用法，而且被国家标准采用。此法操作简便、快速、准确、灵敏，可应用于咖啡因含量的测定，对于确保人类健康有着重要意义。

1 提取实验

1.1 提取实验原理

索式提取器是利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断的为纯溶剂所

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萃取，因而效果比较好。萃取前将茶叶整好，使其与滤纸筒紧密接触，以增加溶剂浸润的面积，然后将固体物质放在滤纸套内。提取筒的下端通过磨口和盛有溶剂的烧瓶连接，上端接冷凝器。当溶剂沸腾时，蒸气通过蒸气管上升，到达冷凝管时，再被冷凝器冷凝成为液体，滴入提取筒中的滤纸套中。当溶液液面超过虹吸管的最高处时，即产生虹吸，结果是将萃取出的部分物质一起随液体带入烧瓶中。这样利用溶剂回流和虹吸作用，使固体中能溶于溶剂的物质逐渐富集到烧瓶中，再用其他方法将萃取到的物质从溶液中分离出来。 1.2 仪器

表1-1 仪器

仪 器 索式提取器 半微量有机制备仪

电加热套

型号（产地）

BZ-39 天长市千玻教学仪器有限公司 BB-26 天长市千玻教学仪器有限公司 ZNCL-T 巩义市予华仪器有限公司

1.3 试剂

表1-2 试剂

试 剂 茶叶 95%乙醇 生石灰粉 蒸馏水

规格 当地市售黄山毛峰

A.R. A.R. A.R.

1.4 主要装置图

图1-1 索式提取器 图1-2 升华少量物质的装置

1.5 咖啡因对照品的提取及提纯

（1）准备电加热套，将电加热套插电源准备好，设定温度400℃。 （2）称取10g茶叶在研钵中并硏成茶叶末，放入事先卷好的滤纸筒内。滤

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纸筒的大小要求为紧贴抽提筒的器壁，且其直径要略小于抽提筒内径，这样可以去放方便。并且要求滤纸筒内茶叶末的高度不得超过虹吸管。滤纸包茶叶时要严密，纸套上面要折成凹形且封闭。再将滤纸筒放入150ml 索式提取器（图1-1）中，在平底烧瓶中加入80～100ml 95%乙醇，加热回流提取。直到提取液颜色变的较浅为止（约2～3h），待冷凝液刚刚虹吸下去时即可停止加热。待冷凝液稍冷后，把平底烧瓶中提取液转入到圆底烧瓶中。并把提取装置改成蒸馏装置，这是为了使提取液中的大部分乙醇蒸出（回收），然后趁热把瓶中剩余液倒入蒸发皿中，留作升华法提取咖啡因用。

（3）称取3g左右的生石灰粉（中和及吸水作用），在研钵中研碎成粉末，加入盛有提取液的蒸发皿中。同时用玻璃棒搅成糊状，然后移至石棉网上用酒精灯小火加热，除去水分。若水分未能除净，将会在下一步加热升华开始时在漏斗内出现水珠。加热的同时用玻璃棒不断搅拌，防止局部过热，使液体溅出。取一个口径大小合适的漏斗，将其罩在盖有滤纸（滤纸上刺有许多小孔且孔刺向上）的蒸发皿上，漏斗颈部塞一团疏松的棉花（图1-2），防止咖啡因蒸汽从漏斗颈逸出。然后用酒精灯隔着石棉网小心加热升华，适当控制温度（升华操作是实验成败的关键，必须严格控制温度），尽可能使升华速度放慢，当发现滤纸小孔上有白色针状结晶出现，并出现棕色烟雾时，即升华完毕，停止加热。待自然冷却后，小心取下漏斗，轻轻揭开滤纸，用刮刀将附在滤纸上下两面的咖啡因小心刮下。剩下的残渣经搅拌后，用较大的火再加热片刻，使升华完全。合并几次升华的咖啡因，再进行多次加热升华重结晶以提纯，小心的刮下滤纸两面的咖啡因晶体，收集起来作为对照标准品。

（4）重复以上步骤，进行多次提取，制备出足够量的咖啡因晶体来作为标准品。

2 检测实验

2.1 仪器

表2-1 仪器

仪 器 高效液相色谱仪

分析天平 抽滤机

型 号 美捷伦1200

AUY220 SHZ-D(Ⅲ)

2.2 试剂

表2-2 试剂

试 剂

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规 格

甲醇 乙酸铵 乙酸 咖啡因对照品

绿茶 超纯水

光谱纯 A.R. A.R. 自制 统一绿茶

2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18（4.6×159），粒径5μm 流动相：0.02mol/L 乙酸铵溶液- 甲醇（75:25） 检测波长：2nm 流速: 1.0ml/min 进样量：20μl 2.4 溶液配制

2.4.1 咖啡因标准储备液

精密称取0.0500g咖啡因对照品，加蒸馏水溶解，定容至100ml，则该储备液浓度为0.50mg/ml。

2.4.2 标准系列配制

用移液管分别移取咖啡因标准储备液1.00ml，2.00ml，3.00ml，4.00ml，5.00ml，于5个50ml的容量瓶中，加入蒸馏水配成每毫升含咖啡因10，20，30，40，50μg的标准溶液，各吸取10ml，用微孔滤膜过滤，弃去最初5ml，保留5ml备用。

2.4.3 样品制备

量取10ml饮料绿茶饮料，直接用水稀释，加水定容至50ml，分别吸取该两种制备液10ml，用微孔滤膜过滤，弃去最初5ml，保留5ml备用。

2.4.4 流动相(20mmol/L乙酸铵溶液)的配制

准确称取0.7708g乙酸铵固体，加蒸馏水溶解，定容至500ml。则该溶液浓度为20mmol/L，抽滤，备用。 2.5 标准曲线的绘制

打开计算机电源，并自上而下打开主机各模块电源。显示有信号时，双击桌面上工作站联机图标，进入色谱工作站，调出一个分析方法，检查各参数的设置。旋开泵上的排气阀，将工作站中的泵流量设到5ml/min。设置溶剂A（水）为100%,开启泵，排除管线中的气体数分钟，再依次切换到其他溶剂分别排气。本实验中流动相为20mmol乙酸铵-甲醇（75:25）两种溶剂，把乙酸铵和甲醇按3:1的比

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例配成一种溶液，以此作为流动相接D管，因此本实验只需将D管排气即可。再将泵流量设到1.0ml/min，输入检测波长2nm，关闭排气阀。检查柱前压力，待柱前压力基本稳定后，观察基线情况，待基线平稳后，按浓度从小到大的顺序吸取标准系列溶液25μl（进样量20μl）。在所选择的色谱条件下，注入HPLC仪，记录色谱图。进样时，将手动进样器搬上去，进样针筒中溶液进入进样器后，搬下进样器，拔出进样器，开始记录色谱图（图2-1至图2-5）。标准系列溶液及试样溶液中咖啡因的峰面积列于表2-3中，峰面积与浓度进行回归求得标准曲线（图2-6）。 DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121228.D) 峰 11.681面积: 114.603mAU32.521.510.50-0.5-1024681012min

图2-1 10μg/ml的咖啡因标准溶液色谱图

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DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121222.D)-80-81-82-83-84-85-8602468101214min 11.960mAU 图2-2 20μg/ml的咖啡因标准溶液色谱图

DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121225.D) 11.931mAU820-202468101214min 图2-3 30μg/ml的咖啡因标准溶液色谱图

DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121226.D) 11.637mAU1210820-202468101214min 图2-4 40μg/ml的咖啡因标准溶液色谱图

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DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121227.D)141210820-2024681012 11.491mAUmin 图2-5 50μg/ml的咖啡因标准溶液色谱图

表2-3 2nm下不同浓度的咖啡因溶液的峰面积值 项 目 标准溶液10μg/ml 标准溶液20μg/ml 标准溶液30μg/ml 标准溶液40μg/ml 标准溶液50μg/ml

绿 茶

峰面积值 114.6 240.8 447.1 609.5 615.7 353.7

图2-6 咖啡因标准曲线

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2.6 样品测定

按操作要求，吸取25μl（进样量20μl）样品制备液，在所在的色谱条件下，注入HPLC仪，记录色谱图（图2-7），计算测定结果（表2-4）。

DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121229.D)160140120100806040 1.992mAU0024681012min 3.10420 11.449 2.273 图2-7 绿茶溶液色谱图 表2-4 样品溶液测定及计算结果

样品名称 绿茶

峰面积值 353.7

咖啡因含量（μg/ml）

26.24

2.7 回收率试验测定

吸取已知含量的绿茶饮料制备液10ml，于50ml容量瓶中，则其中样品本底咖啡因含量为26.24/5=5.25μg/ml。再加入咖啡因标准储备液适量，加蒸馏水稀释，定容，取10ml，用微孔滤膜过滤，弃去最初5ml，保留5ml备用。吸取25μl（进样量20μl），在所选择的色谱条件下，注入HPLC仪，记录色谱图（图2-8至图2-12），计算回收率（表2-5）。 DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121236.D)14012010080604020002468101214min49.9 115.0 2mAU 2.274 3.0 11.121 图2-8 加入量20μg/ml的绿茶溶液

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DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121237.D) 1944092.9mAU1401201008060402000 2.275 3.085 11.2272468101214min 图2-9 加入量23μg/ml的绿茶溶液

DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121238.D)140120100806040 2.27769994.01. 2 mAU0024681012min 3.09420 11.325 图2-10 加入量26μg/ml的绿茶溶液

DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121240.D) 14092.9mAU120100806040 11.259 2.274002468101214min 3.09020图2-11 加入量29μg/ml的绿茶溶液

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DAD1 A, Sig=2,4 Ref=360,100 (A121239.D)49594.01. 2 mAU1401201008060402000 2.276 3.098 11.32424681012min 图2-12 加入量32μg/ml的绿茶溶液 表2-5 回收率测定及计算结果

样品名称

样品本底C1（μg/ml）

加入标准品量V（ml） 2 2.3

绿茶

5.25

2.6 2.9 3.2

加入含量C2（μg/ml）

20 23 26 29 32

峰面积 3.4 431 434.7 460.2 477.8

测得量C3(μg/ml） 28.82 31.85 32.12 33.98 35.27

回收率% 87.61 88.70 97.29 100.79 105.61

96.00 平均回收率%

从咖啡因标准品曲线（图2-6）得到咖啡因浓度与峰面积的线性关系，峰面积y=13.7x-5.73（x为咖啡因浓度）。再由绿茶溶液色谱图（图2-7）根据此公式得到绿茶样品中咖啡因含量为26.24μg/ml（表2-4），则溶液中样品本底含量为5.25μg/ml。依次加入适量标准品储备液v，则溶液中标准品的含量为

（V*500μg/ml）/50ml=10V（μg/ml）。再依次根据图2-8至2-12由线性关系得到溶液的咖啡因含量，从而得到回收率C3/(C1+C2）×100%。从表2-5中可以看出,溶液回收率达到96%,实验方法操作方便，准确度高，适合用于咖啡因含量的精确测量。 2.8 注意事项

（1）实验中所用甲醇为光谱纯，其余为色谱纯，待测溶液在进样前都需用微孔滤膜过滤，以免损坏仪器。

（2） 使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样都必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡。

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3 结论

目前市面上所售的饮料中咖啡因含量因品种不同而有所差异，本文采用20（mmol/L）的乙酸铵-甲醇（75:25）为流动相，以水为溶剂，方法快速，简便，可用于测定一般市售饮料中咖啡因含量。本研究方法测定的咖啡因含量，均未超过国家标准。与其他测定方法相比较，层薄色谱实验法较直观，紫外分光光度法简单迅速，电导率改进方法减少对环境的污染，而高效液相色谱法测定结果精确，方法也简单，适用于精确测量。

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致 谢

大学生活一晃而过，回首走过的岁月，心中倍感充实。作为大学生活行将结束的纪念篇章，当我写完这篇论文的时候，有一种如释重负的感觉，感慨良多。在大学四年的学习生涯中，感谢陪伴在我身边的室友、同学、朋友，感谢他们为我提出的有益的建议和意见，有了他们的支持、鼓励和帮助，我才能充实的度过这四年的学习生活，是他们让我的生活充满精彩，充满欢乐。感谢老师们对我的很多指导和帮助，你们严谨的治学，优良的作风和敬业的态度，为我们树立了为人师表的典范，是你们指引着我，沿着正确的方向前进。在此，我对所有的化学化工学院的老师表示感谢，祝你们身体健康，工作顺利！

在此特别要感谢我的指导老师，本文是在她的精心指导下完成的，从论文的选题、实验材料的准备、实验的进行、实验结果的测定以及论文的编写，都有着关老师的悉心指导，谨此向我的指导老师表示衷心的感谢！感谢化学化工学院高效液相实验室的指师的帮助和指导，以及实验室同学的帮助！在他们的帮助下，我完成了实验中的测定实验。还要感谢我的实验合作同学吴丹丹一直以来的帮助与合作。

这四年以来，经历过的所有事，所有人，都将是我以后生活回味的一部分，是我为人处事的指南针。就要离开学校了，成功走完了大学生涯，为我人生历程中的一段旅程画了一个完满的句号，同时这又是我即将开始的下一段旅程的起点，在这里祝福大学里跟我风雨同舟的朋友们，一路走好，未来总会是绚烂缤纷。 最后，感谢所有给予过我支持和帮助的老师、同学及朋友们，愿你们都有一个美好的未来！

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