安徽农学通报,Anhui Agri.Sci.Bul1.2016,22(16) 109 高效液相色谱法测定竹叶提取物中的14种酚酸类化合物 王智聪 沙跃兵余笑波王珂 310018) (浙江省计量科学研究院,浙江杭州摘要:该研究建立了原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥 子酸、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷等14种酚酸类化舍物同时测定的高效液相色谱方法。色谱柱为 Agilent ZORBAX SB—C18(5 ̄m,4.6x250mm),采用甲醇一水(舍0.1%甲酸)流动相体系,梯度洗脱,检测波长为 274nm和324nm。结果显示,14种酚酸类化合物在0.250—5O.0 p ̄g]mL的范围内线性关系良好,相关系数r2均 大于0.99;方法精密度良好,相对标准偏差(RSD)小于7.7%。表明该方法可用于竹叶提取物中酚酸类化合物 含量的测定。 关键词:酚酸类化合物;竹叶提取物;高效液相色谱法 中图分类号TS201.1 文献标识码A 文章编号1007—7731(2016)16—0109—05 Determination of 14 Phenofic Acids in Bamboo Extract by nigh Pressure Liquid Chromatography Wang Zhicong et ai. (Zhejiang Province Institute of Metrology,Hangzhou 3 1001 8,China) Abstract:A simple method was developed in this paper for simultaneous determination of 14 phenolic acids by high pressure liquid chromatography,the compounds includes protocatechuic aicd,gentisic aicd,m—hydroxybenzoic aicd, chlorogenic acid,vanillic acid,eaffic acid,syringic acid,p-coumaric acid,terulic acid,sinapic acid,homoorientin, orientin,vitexin and isovitexin.The samples were separated by Agilent ZORBAX SB—C18 column(5 m,4.6× 250ram)using methanol and 0.1%formic acid aqueous solution as mobile phases by radigent elution under 274nm and 324nm for different compound.The results showed that there are good linear ranges with O.250~50.Op ̄g/mL. good correlation coeficifents(r2)with greater than 0.99.and good precisions with less than 7.7%of relative standard deviations for all 14 phenolic acids.The method can be used for phenolic acids determination for bamboo extract sam— pies. Key words:Phenolic acids;Bamboo extract;High pressure liquid chromatography 竹叶提取物又称竹叶抗氧化物,是一种新型的植物 其他种类的酚酸类化合物测定的报道,本研究在上述8种 酚酸类化合物的基础上,建立了竹叶提取物中14种酚酸 提取制剂。竹叶抗氧化物作为天然抗氧化剂已被列入到 我国《食品添加剂使用卫生标准)(GB2760)中,允许在食 用油脂、肉制品、水产品、膨化食品、油炸食品、焙烤食品、 即食谷物及果蔬汁饮料和茶饮料等几大类食品中使用。 国家标准《食品添加剂竹叶抗氧化物》(GB30615)已在 2014年11月1日起实施。 竹叶提取物具有优良的抗氧化、抗自由基、抗疲劳、 类化合物含量测定的方法。 1材料与方法 1.1仪器与试剂Aliance e2695高效液相色谱,配光电 二极管阵列检测器和Empower 3数据处理系统(美国Wa. ters公司);AG285精密电子天平(瑞士Mettler Toledo公 司);5810R高速冷冻离心机(德国Eppendoff公司);KQ一 抗病毒、抗菌、抗炎、降脂和增强免疫等作用n 。龚金炎 等 采用液相色谱法测定了竹叶抗氧化剂中绿原酸、咖啡 酸、香豆酸、阿魏酸、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆 100DE数控超声仪(昆山超声仪器有限公司);Milli—Q超 纯水系统(美[]Millipore公司)。甲醇(色谱纯)购自德国 Merck公司;甲酸(分析纯)购自美[]Sigma—Aldrich公司; 原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡 苷等8种酚酸类化合物的含量。基于竹叶提取物具有良 好的抗氧化等药理功效,有必要对其活性成分进行系统 的研究,尤其是酚酸类化合物在竹叶提取物中的存在形 式及分布特征等进行系统的研究。但文献中鲜有竹叶中 基金项目:浙江省公益技术应用研究项目(2015C37070,2016C37063)。 酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸和芥子酸标准品购自美[]Sig. ma—Aldrich公司;荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷标 准品购自上海同田生物技术有限公司;竹叶(金刚竹)采 作者简介:王智聪(1977一),男,内蒙古人,博士,研究方向:分析化学与标准物质研制。 收稿日期:2016—07—02 110 自当地;竹叶抗氧化剂(1撑)样品购自浙江圣氏生物科技 有限公司;竹叶抗氧化剂( )样品由浙江大学张英课题 组提供。 1.2实验方法 1.2.1标准工作溶液的配制分别称取适量原儿茶酸、 龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、 香豆酸、阿魏酸、芥子酸、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异 牡荆苷标准品,加适量甲醇漩涡震荡、超声溶解,配制浓 度均为2.OOmg/mL的母液;再用超纯水序列稀释,配制浓 度分别为0.250、0.350、0.500、0.750、1.00、2.50、5.O0、10.0、 25.0、50.0 咖L的混合标准工作溶液。 1。2.2竹叶样品的提取采摘新鲜竹叶适量,用自来水 清洗泥污,再用超纯水冲洗数次,沥干,置于40℃烘箱干 燥过夜;取出分拣,丢弃干枯枝叶,去枝除梗;将干燥竹叶 置于粉碎机打碎,干燥保存备用。称取适量干燥粉碎后 的竹叶样品,按照1:20的料液比,加入60%的甲醇溶液, 超声提取30min,取出于4 000璃,L'10min,倒出上清液;残 渣再按照上述方法提取1次;合并上清液,混匀,用超纯水 稀释2倍后进行测定。 1.2-3竹叶抗氧化荆样品的配制称取适量竹叶抗氧化 剂样品,加入适量甲醇,配制浓度为10mg/mL的溶液;并于 4 000r离, ̄"lOmin,吸出上清液,用超纯水稀释4倍后进行 测定。 1.2.4色谱分析条件色谱柱:Agilent ZORBAX SB—C18 (51- ̄m,4.6x250mm);柱温:35oC;流速:1.0mL/min;流动相 A:含0.1%甲酸的水溶液;流动相B:甲醇;梯度洗脱:5%B (1rain)一12%B(3min)一15%B(13rain)一19%B(15min)一 21%B(25min)一26%B(26min)—。29%B,32rnin)一30%B (45rain)一45%B(55min)一98%B(56min)一98%B (60rain)一5%B(61rain)一5%B(65rain);紫外检测波长: 274/324nm;进样体积:10p&。 2结果与分析 2.1样品前处理方法的优化植物提取物成分复杂,既 有极性较大的糖类、氨基酸类和酚酸类等,又有极性较小 的黄酮类和叶绿素等化合物,为了有效地进行组分的分 离,应当选择较长的色谱柱” “,实验中采用柱长为 250ram的色谱柱,各组分得到了较好的分离。在流动相 中添加酸性添加剂,可以调节酚酸类化合物的解离,添加 0.1%的甲酸有效地抑制了酸性化合物的解离,从而提酚 酸类高化合物在反相色谱的保留能力,色谱峰型也较 好。14种酚酸类化合物中以羟基苯甲酸为母核的酚酸类 化合物在250—290nm有最大吸收,而以羟基肉桂酸为母 核的酚酸类化合物及绿原酸、碳苷黄酮等在310—330nm 有最大吸收。因此,对原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸 和丁香酸采用274nm的波长进行定量分析,而对其他化合 安徽农学通报,Anhui A .Sei.Bul1.2016,22(16) 物则采用324nm的波长进行定量分析。l4种酚酸类化合 物在274nm和324nm的色谱如图1所示。 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5O 55 Rl(rain) 图1 酚酸类化合物标准溶液的色谱 1.原儿茶酸;2.龙胆酸;3.对羟基苯甲酸;4.绿原酸;5.香草酸;6. 咖啡酸;7.丁香酸;8.香豆酸;9.阿魏酸;10.芥子酸;11屏荭草苷;12. 荭草苷;13.牡荆苷;14.异牡荆苷 2.2竹叶样品提取条件的优化 2.2.1料液比的优化称取干燥粉碎后的竹叶样品lg (精确至O.O01g)5份,按照l:10、1:20、1:30、1:40和1:50的 料液比,分别加入lOmL、2OraL、30mL、4Oral和50mL的75% 甲醇一水溶液(体积比),超声提取30min;取出于4 000r离 心lOmin,上清液用超纯水稀释2倍后,进行液相色谱分 析。以绿原酸为例,在不同料液比的情况下,其含量变 化如图2所示。从图2可以看出,绿原酸的含量随料液比 的增加先减少后增大,但总体变化不大。总体来看,增 大料液比,提取效率有所增加,但提取液中绿原酸的浓 度变低。考虑到竹叶提取物中酚酸类化合物的含量较 低,提取液浓度太低,不利于其中酚酸类化合物的测定; 但是减少料液比,如采用1:10的料液比,虽然提取物中 酚酸类化合物的浓度增加,但是较小的料液比不利于酚 酸类化合物的浸出。因此,综合考虑,实验中采用1:20 的料液比。 600 40O 抽 200 O 1O 2O 30 4o 5O 料液比 圈2料液比的优化 2.2.2提取溶剂的优化称取干燥粉碎后的竹叶样品lg (精确至0.001g)6份,按照l:20的料液比,分别加入20mL 22卷16期 王智聪等高效液相色谱法测定竹叶提取物中的l4种酚酸类化合物 l1 1 50%、55%、60%、70%、80%和90%的甲醇一水溶液(体积 比),超声提取30min;取出于4 000r离心10min,上清液用 2.2.4提取次数的优称取干燥粉碎后的竹叶样品1g (精确至0.001g),按照1:20的料液比,加入20mL 75%的甲 醇一水溶液,超声提取30min,取出于4 000r离心10min,倒 出上清液;残渣再加入20mL 75%的甲醇一水溶液提取3 次。对每次提取离心后的上清液,用超纯水稀释2倍后进 行液相色谱分析。以绿原酸为例,其含量变化如图5所 示。从图5可以看出,绿原酸的含量随提取次数的增加而 超纯水稀释2倍后,进行液相色谱分析。以绿原酸为例, 在不同提取溶剂的情况下,绿原酸提取含量的变化如图3 所示。从图3可以看出,绿原酸的含量随提取溶剂中甲醇 含量的增加先增大后减少,在60%甲醇含量的情况下,绿 原酸的提取含量最大。增加提取溶剂中甲醇的含量,有 利于竹叶中绿原酸的浸出;但提取溶剂中甲醇含量太高, 增加,提取2次后,提取回收率大于95%,实验中选择提取 20(。 绿原酸的含量反而降低,其原因可能是酚酸类化合物的 极性较大,提取溶剂中水的比例减少,反而不利于其浸 出。另外,增加甲醇的含量,竹叶中其他非极性杂质如叶 绿素等的浸出量也增加,不利于后续的分析。因此,实验 中采用甲醇含量为60%的提取溶剂。 800 600 一∞ }IIJ一蛹姐 8 6 4 ∞ ∞ ∞ 40o 咖 缸 2oo O 50 55 6(J 7O 80 90 甲醇比例(%) 图3提取溶剂的优化 2.2.3提取时间的优化称取干燥粉碎后的竹叶样品1g (精确至0.001g)6份,按照1:20的料液比,加入20mL 75%的甲醇一水溶液,分别超声5、l0、20、30、45、60min;取 出于4 000r离, ̄,10min,上清液用超纯水稀释2倍后,进行 液相色谱分析。以绿原酸为例,其含量变化如图4所示。 从图4可以看出,绿原酸的含量随超声时间的增加而增 加。60min时最大,可能是由于随着超声时间的增加,超声 水浴温度升高,导致60min时绿原酸的含量变化较大;但 在45min前,绿原酸的含量缓慢增加。为了节省时间,以 及由于后续需要多次提取的缘故,实验中选择超声 30min 蕃 2O 3O 45 6o 时间(rain) 提取时间的优化 l 2 3 4 ∞ O 提取次数 图5提取次数的优化 2.3线性关系、线性范围和检出限对1.2.1节配制的混 合标准工作溶液,按照1.2.4节的色谱方法进行分析,以标 准品的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,进行线性回 归。以标注曲线的最低点为最低定量浓度,以3倍信噪比 (Sin)计算检出限。各化合物的回归方程、线性范围、相 关系数及检出限如表1所示,结果表明各酚酸类化合物在 给定浓度范围内线性关系良好。 表1酚酸类化合物的线性关系、线性范围和检出限 2.4方法精密度按照1.2.2节的方法,称取5份竹叶样 品,独立进行提取和分析,以绿原酸为指标,考察提取方 法的精密度,测定结果的相对标准偏差(RSD)/J ̄于7.7%; 112 对1.2.3节制备的竹叶抗氧化剂样品,进行5次重复进样, 考察分析方法的精密度,对各酚酸类化合物,测定结果的 相对标准偏差(rtSO)均小于3.2%。 2.5样品的测定对1.2.2和1。2.3节制备的竹叶提取物和 竹叶抗氧化剂样品,每个样品重复制备3次,按照1.2.4节 的色谱方法进行分析,以竹叶抗氧化剂2#样品为例,其色 谱如图6所示。 0 5 1O 15 2O 25 30 35 4O 45 50 55 Rt(min) 1.原儿茶酸;2.龙胆酸;3.对羟基苯甲酸;4绿原酸;5.香草酸;6. 咖啡酸;7.丁香酸;8.香豆酸;9.阿魏酸;10.芥子酸;11.异荭草苷;12. 荭草苷;13.牡荆苷;14.异牡荆苷 图6竹叶抗氯化剂样品的色谱 按照2.3节所述方法进行外标法定量分析,竹叶及竹 叶抗氧化剂中各组分的含量按照公式1进行计算: c= 其中C表示竹叶干燥样品或竹叶抗氧化剂产品中酚 酸类化合物的含量(g/kg),C 表示由标准曲线读出的含量 (p ̄g/mL),V表示样品提取或溶解的总体积(mL),D表示 进样前的稀释倍数,ITI表示样品的称取质量(g)。 竹叶(于燥品)及竹叶抗氧化剂中各酚酸类化合物的 含量测定结果如表2所示。从表2可以看出,竹叶提取物 中各种酚酸类化合物的含量差异较大。竹叶中酚酸类化 合物的含量较低,主要含有荭草苷、异荭草苷、龙胆酸和 绿原酸等,而竹叶抗氧化剂产品中酚酸类化合物的含量 较高。竹叶抗氧化剂1}}产品中酚酸类化合物的总量占产 品总质量的54.0%,2#产品占36.3%;其中4种竹叶黄酮在 竹叶抗氧化剂1撑和2#产品中占酚酸类化合物的总量 90.9%、61.8%;竹叶黄酮中主要以荭草苷和异荭草苷存 在,在两种竹叶抗氧化剂中均占竹叶黄酮总量的80%。 表2竹叶及竹叶提取物中酚酸类化合物的含量(n--a) 安徽农学通报,Anhui Agri.Sci.Bul1.2016。2206) 对以羟基苯甲酸为母核和以羟基肉桂酸为母核的酚 酸类化合物,在两种竹叶抗氧化剂中主要以龙胆酸、绿原 酸、阿魏酸和芥子酸为主,并且与竹叶黄酮的分布存在明 显的差异。龚金炎 指出,对大孔树脂法制备的竹叶抗 氧化剂产品,在大孔树脂洗脱过程中会损失极性较大的 卯 ∞ 鲫 ∞ 2 2 1 l 一∞ 卿如 O 酚酸类化合物。本研究的竹叶抗氧化剂1静产品即为大孔 树脂法精制而得,而竹叶抗氧化剂2#产品为正丁醇液一液 萃取法精制而得,表现出1#产品中竹叶黄酮的含量高于 产品;相反,其他酚酸类化合物在勰产品中的含量高于 l#产品,如图7所示。除制备工艺外,竹叶原料的差异也 会影响竹叶提取物中酚酸类化合物的分布。 -竹叶抗氧化剂1# 一竹叶抗氧化剂2# - I J一- .一I. I I 图7竹叶抗氯化剂样品中酚酸类化合物的分布 文献中常见对竹叶提取物中绿原酸、咖啡酸、香豆 酸、阿魏酸、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷等化合 物进行分析,未见其他如以苯甲酸为母核和肉桂酸为母 核的酚酸类化合物测定的报道。本研究除上述8种酚酸 类化合物以外,还测定了原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲 酸、香草酸、丁香酸和芥子酸等,并探讨了酚酸类化合物 在不同工艺制备的竹叶抗氧化剂产品中的分布,对全面 了解竹叶提取物中的酚酸类化合物提供新的思路。 3结论 本研究建立了竹叶提取物中14种酚酸类化合物的测 定方法,通过色谱分离条件的优化,各组分与(下转148页) 148 安徽农学通报,Anhui A .Sci.Bul1.2016,22(16) 并规范其基本职能。首先,教研组要对课程的建设目标、 讲授内容、实施方法和考核方式予以指导,对教学过程进 行统筹管理,从而更好地实现教学目标。其次,教研组要 年)》强调:“提高质量是高等教育发展的核心任务”,是建 设高等教育强国的基本要求,因此对教学过程进行规范, 是高校保障教学质量的关键所在。随着国际上对食品安 全风险分析作用的重视,相信会有更多的高等院校开设 食品安全风险分析课程。同时,食品安全风险分析课程 的师资队伍建设、教材建设及教学内容和水平等方面也 会得到大幅提高,食品质量与安全学科框架将更趋完善, 人才培养会更加有效。 参考文献 [1]陈君石,樊永祥.食品安全风险分析[D].北京:人民卫生出版社, 2008:1-7. 有目的组织教师进行外出进修、培训或参观考察,提升师 资水平,加强理论修养,优化师资结构,打造一支团结合 作、业务能力强的教师团队。最后要建立和完善教学评 估体系,要对学生的学习情况进行调查,切实满足学生学 习的实际需要。 2.5教学实践的规范化建设在进行理论教学的同时, 要注重提高学生的实践能力,包括问题分析和实际动手 能力,这样才会较好的完成教学效果,达到教学目的。一 [2]周宇.食品安全风险分析体系存在的问题探析EJ7.济宁医学院学 报,2014,37(2):77—80. 方面,河北农业大学积极与食品安全相关单位,包括疾控 中心、出入境检验检疫局、食品监督检验中心、技术监督 局等进行沟通和合作,为学生搭建了良好的教学实践平 台;另一方面学校积极开展翻转课堂、第二课堂等多种教 学新形式,在教师的指导下进行知识点自主学习、课题设 [3]樊永祥.风险分析原则在全球食品安全管理中的应用[J].中华预 防医学杂志,201l,45(6):487—489. 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