一种抗菌肽Dermaseptin

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 106397568 A(43)申请公布日 2017.02.15

(21)申请号 201611109715.6(22)申请日 2016.12.02

(71)申请人 河南牧翔动物药业有限公司

地址 451162 河南省郑州市航空港区空港

五路

申请人 河南牧翔科技有限公司(72)发明人 李登云　李灵娟　杨振豪　韩露　

张建勋　王彬　柴保国　李小佳　(74)专利代理机构 郑州豫开专利代理事务所

(普通合伙) 41131

代理人 张智伟(51)Int.Cl.

C07K 14/47(2006.01)A61K 38/17(2006.01)A61P 31/04(2006.01)

()发明名称

一种抗菌肽Dermaseptin-M及其应用(57)摘要

本发明属于生物技术领域，具体公开一种抗菌肽Dermaseptin-M及其应用。其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。通过实验证明本发明抗菌肽不但对大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌等有明显的抑制作用，而且对病毒也有一定的灭活作用，稳定性好，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用，可以作为抗生素替代品使用。

A61P 31/14(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页

序列表1页 附图2页

CN 106397568 ACN 106397568 A

权　利　要　求　书

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1.一种抗菌肽Dermaseptin-M，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.如权利要求1所述的抗菌肽Dermaseptin-M在制备抗菌肽制剂中的应用。3.如权利要求1所述的抗菌肽Dermaseptin-M在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和/或病毒感染疾病的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌或绿脓杆菌，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，所述病毒为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。

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说　明　书

一种抗菌肽Dermaseptin-M及其应用

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技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽Dermaseptin-M及其应用。背景技术[0002]抗生素在养殖业中的滥用导致药物在动物产品中残留，已经严重影响食品安全，使细菌对抗生素产生耐药性，并通过餐桌潜入人体，成为潜伏在人体内的杀手。其危机是如果发生新的病种将面临无药可用的局面。越来越多的国家开始寻找抗生素的替代品，而抗菌肽以其独特的生物活性和杀菌机制成为最具潜力的抗生素替代品之一。抗菌肽在食品、化妆品领域的应用也不断加深，具有良好的发展前景。[0003]抗菌肽（antibacterial peptides)是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。抗菌肽是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，具有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体作用，还有抗肿瘤细胞作用，因此又称为肽抗生素（peptide antibitics)。抗菌肽抗菌谱广，对多重耐药菌、肿瘤细胞、艾滋病毒有杀伤作用，甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）病毒的作用。因此有着广阔的开发应用前景，是目前国际学术研究的活跃领域之一。

发明内容[0004]本发明的目的旨在提供一种抗菌肽Dermaseptin-M及其应用。[0005]为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种抗菌肽Dermaseptin-M，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。[0006]所述抗菌肽Dermaseptin-M在制备抗菌肽制剂中的应用。[0007]所述抗菌肽Dermaseptin-M在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和/或病毒感染疾病的药物中的应用。[0008]所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌或绿脓杆菌，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，所述病毒为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。[0009]有益效果：通过实验证明本发明抗菌肽Dermaseptin-M不但对大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌等有明显的抑制作用，而且对病毒也有一定的灭活作用，稳定性好，抗菌活性强，具有高效广谱抑菌作用，可以作为抗生素替代品使用。附图说明[0010]图1：发酵液中Dermaseptin-M蛋白纯度鉴定结果；其中，M为蛋白maker，1，2，3，4均为样品重复；

图2：Dermaseptin-M蛋白质谱图。具体实施方式

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说　明　书

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以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的保护范

围并不局限于此。[0012]实施例1

本发明抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：

Ala-Ser-Trp-Met-Thr-Ser-Phe-Lys-Lys-Val-Leu-Lys-Thr-Pro-Thr-Lys-Thr-Thr-Leu-Asn-Thr-Val-Leu-Val-Gly-Thr-Asn-Ala。[0013]序列特征：序列为氨基酸序列，含有28个氨基酸残基，链型为α螺旋直链多肽，分子量大小为 3405 .04Da ，等电点是10.25，疏水残基46.42%。[0014]本实施例抗菌肽是发明人在Dermaseptin基因基础上通过氨基酸替代增强其多肽抗微生物能力，将改造后Dermaseptin-M基因转入枯草芽孢杆菌，并通过枯草芽孢杆菌发酵而得；其具体步骤如下：

1. Dermaseptin-M序列合成

Dermaseptin-M是在Dermaseptin序列（如SEQ ID No.2所示）：

GCGTTGTGGATGACCTTGTTAAAAAAGGTTCTTAAAGCTGCCGCAAAGGCTGCGCTGAATGCAGTGTTGGTAGGTGCAAATGCT的基础上，将第37、43、49、52、61、76位碱基G变为A，其编码氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸，第5、17位T变成C，其氨基酸由亮氨酸变成丝氨酸，即Dermaseptin-M序列为：

GCGTCGTGGATGACCTCGTTAAAAAAGGTTCTTAAAACTGCCACAAAGACTACGCTGAATACAGTGTTGGTAGGTACAAATGCT（如SEQ ID No.3所示）。替代后，其亲水性增强，更易于表达。序列委托上海生工公司合成。[0015]2. Dermaseptin-M序列整合入枯草芽孢杆菌

2.1 整合载体的构建

将Dermaseptin-M序列按照pUB110载体(购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心）克隆标准操作步骤连接到芽孢杆菌载体pUB110上，得到整合载体pUB110-DM。[0016]2.2 枯草芽孢杆菌基因组的整合

将构建好的整合载体pUB110-DM用电转化法转化至Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）168 (购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心）感受态，操作步骤如下：

1. 以1：100的比例将10mL Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）168菌液（市购菌粉用无菌水稀释而得）倒入1000mL LB液体培养基中，37℃、220rpm振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养；

2. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500mL 冰上预冷的离心杯中，4℃、2500rpm离心10分钟；

3. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃、4000rpm离心10分钟；

4. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，冰上预冷；甘油与水的体积百分比，下同)，重悬菌体，再加满10%甘油，4℃、4000rpm离心10min；

 5. 弃上清，每个离心杯中加入5mL10%的甘油，使沉淀悬浮后，制得感受态；取100 μL感受态加0.01ng pUB110-DM直接电穿孔转化，用0.05%（g/mL，下同）氯霉素抗性的LB固体培养基筛选阳性转化子。[0017]其中，LB液体培养基的配方：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L；

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LB固体培养基的配方：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L、琼脂15 g/L。[0018]3 枯草芽孢杆菌优化表达

首先应用 Plackett-Burman 试验设计方法，确定出转速、接种量和总发酵时间为重要影响因素。通过最陡爬坡法接近最大响应面区域，利用 Box-Behnken 试验设计，建立了以Dermaseptin-M蛋白含量为响应值的全变量二次回归方程模型，最终得到枯草芽孢杆菌产蛋白酶的最优发酵条件为：

最佳培养基配方：葡萄糖20g，玉米粉10g，大豆粉10g，酵母粉8g，硅油1g，碳酸氢钙0.5g，氯化钙0.015g，硫酸铵1g，硫酸镁0.15g，加水1000 mL，用碳酸氢钠调节pH至7.0，于121℃条件下灭菌20 min。[0019]最佳发酵条件如下：装液量为500mL的三角瓶中装100mL培养基，初始pH值为7.0，接种菌液量为2%（即每100ml液体培养基中加入2mL 浓度为1×108个/mL的枯草芽孢杆菌悬液，枯草芽孢杆菌悬液是指筛选所得阳性转化子经肉汤培养基培养并调整菌落浓度而得)，培养温度为35℃，摇床转速200rpm，总发酵时间120h。[0020]在摇床条件下，优化后此发酵液的Dermaseptin-M蛋白含量达974.96mg/mL。[0021]鉴定：

（1）、将发酵液取样进行SDS-PAGE鉴别其纯度，结果显示如图1所示，发酵液中几乎没有杂蛋白片段，只有Dermaseptin-M蛋白，灰度扫描计算其纯度为98.9%；

（2）将发酵液取样送于上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱鉴定，质谱结果见图2，质谱分析见表1；PMF和MS/MS数据提交到MASCOT数据库进行搜索，分类学检索为Phyllomedusa sauvagii，结果显示，该蛋白与Dermaseptin蛋白相似率为78.57%，即产生了6个突变。结合图谱分析，该蛋白序列为 ：

Ala-Ser-Trp-Met-Thr-Ser-Phe-Lys-Lys-Val-Leu-Lys-Thr-Pro-Thr-Lys-Thr-Thr-Leu-Asn-Thr-Val-Leu-Val-Gly-Thr-Asn-Ala，与发明人预期结果完全一致，说明该蛋白在枯草芽孢杆菌内得到正确表达。

收集发酵液离心，5000rpm，取上清冻干，得到淡黄色粉末状成品即抗菌肽

Dermaseptin-M，密封包装，-20°保存可以保存两年，4°可以保存6个月。[0023]4. 发明产品抗菌肽Dermaseptin-M最小抑菌浓度（MIC)的测定

MIC实验选择大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌等临床常见有害菌进行。分别将大肠杆菌（ATCC25922)、绿脓杆菌（ATCC182)、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）用肉汤培养基37℃培养至对数期，然后用肉汤培养基稀释至2.0×106 cfu/mL。在青霉素瓶中依次加入稀释过的抗菌肽水溶液100μL（浓度为0.5、1、2、4、5、10、15、20mg/mL），向各瓶中加入已经稀释好的菌液100 μL。混匀后置于37℃恒温培养箱静置培养18h，震荡后测定各瓶菌液在600nm处的吸光度值，以100μg/mL氨苄青霉素水溶液作为阳性对照。其中，肉汤培养基的配方为：蛋白胨 10g/L，牛肉浸出粉 3g/L，氯化钠5g/L。[0024]结果判定：以检测不到细菌生长的抗菌肽最小浓度孔作为其最小抑菌浓度，结果

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如表2所示。

表2可以看出，Dermaseptin-M对大肠杆菌，绿脓杆菌以及金黄色葡萄球菌等临床

常见细菌都有很强的抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌效果最好，绿脓杆菌次之，具有较好的开发价值。[0026]5. 本发明产品抗菌肽Dermaseptin-M体外抑制猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的活性

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）是目前困扰养殖业的一大难题，猪群感染后引起猪的免疫抑制，导致免疫失败，还会造成猪瘟、大肠杆菌病等多种疫病混合感染或者继发感染。本发明抗菌肽对PRRSV在体外有一定的抑制作用。[0027]本实验中PRRSV采用HuN4 F112 株弱毒疫苗，购自哈尔滨维科生物技术有限公司，用生理盐水将其病毒滴度稀释至10-7 TCID50/mL，备用。[0028]Marc-145购自中国兽医药品监察所，按如下步骤复苏培养：

1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上；2.培养液（DMEM）、0.25％（g/g，下同)胰蛋白酶溶液恒温水浴箱37℃预热20min，备用；3.从液氮保存罐中取出细胞冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化；

4.将融化后所得细胞悬液移入15mL离心管，缓慢加入4mL DMEM培养液，离心（1000r/min，5min）；

5.用DMEM培养液混悬沉淀细胞，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。每管细胞可以复苏2-3瓶。

[0029] 48h后，将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.5-1mL 0.25%的胰蛋白酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。放在倒置显微镜下观察细胞，在原贴壁细胞逐渐趋于圆形，还未漂起时将胰酶弃去，加入10mL 含1v%小牛血清的DMEM培养液终止消化，用无菌吸管将贴壁细胞吹打成悬液。[0030]5.1 Dermaseptin-M对Marc145细胞最大无毒浓度的测定

将Marc-145细胞悬液接种于96孔板中，每孔0.1mL，每孔接种细胞个数2.5×104。每孔加10v%小牛血清DMEM培养液100μL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，12h后观察细胞贴壁生产情况。将Dermaseptin-M用DMEM培养液稀释，浓度分别为0.5、1、2、4、8、16mg/L，待细胞贴壁后，每孔加DMEM稀释的Dermaseptin-M 100μL。每4个小时观察一次，判定各孔存活细胞的增殖代谢情况及细胞毒性反应，不产生细胞病变的药物最大浓度视为最大无毒剂量。培养96h，测得抗菌肽 Dermaseptin-M对Marc-145细胞的最大安全浓度为8mg/L。即当抗菌肽 Dermaseptin-M浓度大于8mg/L时，Marc-145细胞会产生病变。

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5.2 体外抗病毒试验

将Marc-145细胞悬液接种于96孔板中，每孔0.1mL，每孔接种细胞个数2.5×104，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，48h后细胞形成单层开始进行体外抗病毒试验。[0032]试验分正常细胞对照组（不接种病毒）、PRRSV对照组（只接种PRRSV 0.1mL，不加药物）、药物（替米考星）对照组（20mg/L，用DMEM稀释）和抗菌肽Dermaseptin-M（DM）组（2、4、6mg/L，DMEM液稀释）。试验采用同时感染的方式进行：将PRRSV病毒液用不含血清的DMEM细胞培养基稀释100倍后取100μL，与100μL药物对照组/DM组处理液在37℃、5% CO2培养箱中作用2h后感染Marc-145细胞，检测本发明抗菌肽对PRRSV的直接灭活作用。[0033]试验采用96孔细胞培养板进行，每个处理重复10次，当PRRSV对照组感染阳性率达75%、正常细胞对照组正常时进行MTT染色，用酶标仪测490nm处吸光度值OD490nm。分别计算细胞存活率和DM对PRRSV的抑制率。[0034]细胞存活率=（实验组OD490nm/正常细胞对照组OD490nm）×100%；

抑制率=（实验组OD490nm－PRRSV对照组OD490nm）/PRRSV对照组OD490nm×100%；抗菌肽Dermaseptin-M对PRRSV抗性结果如表3所示。

表3可以看出，3个不同浓度的DM与PRRSV直接作用后再作用于Marc-145细胞，结果

与PRRSV对照组相比，各组的OD490nm显著升高（P＜0.05），各组细胞存活率和对PRRSV的抑制率分别为61.93%、75.29%、85.80%和31.71%、60.12%、82.48%，即三个不同浓度的Dermaseptin-M都有抑制PRRSV的作用，各个浓度间的抑制效应差异显著。Dermaseptin-M在高浓度时的吸光度值、细胞存活率和对PRRSV的抑制率均稍低于替米考星对照组，但差异不显著（P＞0.05）。说明Dermaseptin-M体外可以直接灭活PRRSV，且灭活效果与药物替米考星相当。[0036]综上，本发明抗菌肽Dermaseptin-M不仅对畜禽常见致病菌有显著的抑制作用，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较好的效果，抗菌谱广，而且对PRRSV也有一定的灭活作用，所以本发明抗菌肽具有极大的应用潜力，在制备抗菌抗病毒药物中能够得到广泛的应用。

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序　列　表

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SEQUENCE LISTING<110> 河南牧翔动物药业有限公司河南牧翔科技有限公司<120> 一种抗菌肽Dermaseptin-M及其应用<130><160> 3<170> PatentIn version 3.4<210> 1<211> 28<212> PRT<213> 人工序列<400> 1Ala Ser Trp Met Thr Ser Phe Lys Lys Val Leu Lys Thr Pro Thr Lys1  5 10  15Thr Thr Leu Asn Thr Val Leu Val Gly Thr Asn Ala 20  25<210> 2<211> 84<212> DNA<213> 未知<400> 2gcgttgtgga tgaccttgtt aaaaaaggtt cttaaagctg ccgcaaaggc tgcgctgaat 60gcagtgttgg taggtgcaaa tgct  84<210> 3<211> 84<212> DNA<213> 人工序列<400> 3gcgtcgtgga tgacctcgtt aaaaaaggtt cttaaaactg ccacaaagac tacgctgaat 60acagtgttgg taggtacaaa tgct  84

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说　明　书　附　图

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图1

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图2

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