维生素 K2抑制肝癌细胞增殖的机制研究

王光丽;周小辉

【摘 要】目的：探讨维生素K2抑制肝癌细胞（ HCC）增殖的可能机制。方法人肝癌细胞株（ HuH7）传代培养，以不同浓度的（0、10、30μM）维生素K2处理HuH-7细胞96 h，以实时定量PCR测定和Western印迹分析分别测定血小板衍生因子α受体（ PDGFR-α） mRNA 和蛋白的表达；用 pluc-a2（ PDGFRα启动子荧光素酶载体）转染人肝癌细胞株（HepG2），用维生素K2处理24 h后采用荧光素酶测定其荧光活性。结果维生素K2抑制HuH7细胞的增殖；维生素K2以剂量依赖的方式抑制PDGFR-αmRNA和蛋白的表达；PDGFR-α启动子的活性被维生素K2抑制并呈剂量依赖关系。结论维生素K2可能通过下调PDGFR-α的转录抑制肝癌细胞的增殖。%Objective To investigate the mechanism of inhibition proliferation of hepatocellular carcinoma ( HCC) cell lines in vitro.Methods Human hepatoma cells ( HuH7) were treated with various concentrations of vitamin K2 for 96 h,then the expression of PDGFR-αmRNA and protein was investigated by real time PCR and western blot analysis respectively.human hepatoma cells (HepG2) were transfected with pluc-a2 (PDGFR-αpromoter-luciferase vector),and the luciferase activity after 24 h treatment with Vitamin K2 was assessed.Results Vitamin K2 suppressed the expression of PDGFR-αmRNA and protein in a dose dependent manner.The PDGFR-αpromoter activity was suppressed by Vitamin K2 administration in a dose dependent manner.Conclusion Vitamin K2 suppresses the proliferation of hepatocellular carcinoma cells via down-regulating the transcrip-tion of PDGFR-α.

【期刊名称】《实用癌症杂志》 【年(卷),期】2016(000)001 【总页数】4页(P14-17)

【关键词】维生素K2;肝癌细胞;血小板衍生因子α受体 【作 者】王光丽;周小辉

【作者单位】515041 汕头大学医学院第一附属医院;515041 汕头大学医学院第一附属医院

【正文语种】中 文 【中图分类】R735.7

肝细胞癌(HCC)是最常见恶性肿瘤之一。在癌症相关的死亡中，肝癌居于第3位[1-2]。到目前为止，包括肝内注射给药在内的密集化疗已被应用于晚期肝细胞癌的治疗。然而，由于复发率高及癌组织对门静脉的侵袭，患者的愈后并不乐观[3-4]。

维生素K是1种脂溶性维生素，属于结构相似的2-甲基-1，4萘醌亲脂家族，该家族包括维生素K1、K2和K3[4-5]。迄今为止，维生素K2在日本被广泛应用于骨质疏松症的治疗，无明显副作用[4]。最近的研究发现，维生素K2在体内外均能抑制包括肝癌细胞在内的众多肿瘤细胞的增殖[1,3,6]。另一项临床研究表明，维生素K2预防了病毒性肝硬化导致的肝细胞癌的发生[7]。然而，维生素K2抑制肝癌增殖的机制尚不明确。血小板衍生因子受体α(PDGFRα)与配体结合后，便处于激活状态，能引起细胞内特异性底物的磷酸化，这些底物属于受体酪氨酸激酶家族[8-9]。在基底细胞癌、脑肿瘤、胃肠道间质瘤等多种肿瘤组织中，PDGFR-α的表

达明显升高。近期的一项研究发现，与癌旁组织比较，肝癌组织中PDGFR-α的表达也是升高的。小鼠体内高表达肝特异性的PDGFR-α配体PDGF-CC，逐步进展为肝硬化与肝癌[10]。抗PDGFR-α单克隆抗体具有抑制多种人与小鼠来源的肿瘤细胞的增殖，其中包括肝细胞癌的细胞系[2]。根据上述研究结果，我们假设PDGFR-α可能在肝癌的进展中发挥重要作用，抑制PDGFR-α可能对于肝癌治疗是有意义的。既往研究显示维生素K2处理肝癌细胞(HepG2)后，采用基因芯片技术测定发现PDGFR-α的表达是下降的[11]。那么维生素K2抗肿瘤增殖的作用，是否可能通过抑制PDGFRα的表达实现的？

肝癌细胞系HuH7与HepG2(ATCC),DMEM培养基(GIBCO公司,美国)，胎牛血清(Signa公司，美国)，维生素K2(Eisai公司，日本)，MTT(Roche公司,美国)，PDGFR-α 与β-actin抗体(Santa Cruz公司，美国)，磷酸钙转染试剂盒

(Invitrgen公司，美国)，荧光素酶测定试剂盒(Promega公司，美国)，RNA提取试剂盒(Nakalai Tesque公司，日本)，逆转录试剂盒(Invitrogen公司，美国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce公司，美国)，ABC试剂盒(Vector,Burlingame,美国)。包含PDGFR-α启动子区域的质粒pluc-a2由日本兵库大学医学院的Yutaka Kitami教授馈赠。维生素K2来自日本Eilai公司，以酒清作为溶剂，配制不同浓度的维生素K2储液(0.01,0.1,1,10,30 mM)，然后用DMEM-10%胎牛血清(FBS)稀释至工作液的乙醇浓度3‰。

1.2.1 细胞培养 人肝肿瘤细胞HuH7与HepG2均用DMEM培养基培养，加入10%胎牛血清(FBS)，青霉素(100 U/ml),链霉素(100 mg/ml)，在37 ℃含5%CO2饱和湿度的细胞孵育箱中培养。细胞融合达80%以上时，用胰酶(含0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化传代。细胞经不同浓度的维生素K2处理96 h后，用于后续实验。对照组细胞加入与实验组终浓度相同的酒精。HuH7用于MTT、荧光定量PCR和western blot，HepG2细胞用于荧光素酶测定实验。

1.2.2 四氮唑蓝比色分析法(MTT比色法) 取对数生长的HuH7细胞接种于96孔板中，细胞密度为2.5×103/孔，加入100 μl培养基。细胞贴壁后，加入含有不同浓度维生素K2(0.01,0.1,0,1,10,30 μM)的新鲜培养基。细胞孵育48、72及96 h后，加入MTT1液继续孵育4 h，每孔中加入100 μl溶剂DMSO，选择单波测定(0 nm)，采用酶联免疫检测仪测定每孔的光密度值，并将OD测定值转换为相应细胞数予以计算。

1.2.3 实时荧光定量RT-PCR 采用不同浓度的维生素K2(0,10和30 μM)处理HuH7细胞96 h后，按照试剂盒说明(Nakalai Tesque,Kyoto,Japan) 提取细胞总RNA，浓度调整为0.5 μg/μl。用分光光度计，在260 nm与280 nm处分别测定RNA样本的吸光度值。A260/A280 1.8的样本中提取1 μg总RNA进行RT-PCR。20 μl PCR反应体系中加入1 μl cDNA，终浓度为0.2 μM的上游与下游引物，混匀，4 000 rmp瞬间离心，20 ℃反应10 min,37 ℃反应120 min,85 ℃反应5 S,4 ℃反应5 min结束，逆转录产物进行实时定量PCR。基因表达水平用ABI PRISM 7700序列测定系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)根据说明书来检测。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 3 s，60 ℃30 s，循环40次。引物序列如下：PDGFR-α 上游:5'-GACCCTATGCAGCTGCCTTA-3',下游:5'-GGAAGCTACCCTATTCTTATG-3';β-actin上游:5'-CCTAGAAGCATT TGCGGTGG-3',下游:5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'。条带的强度用光密度分析仪定量测定，并与参照物β-actin条带结果比对分析。 1.2.4 Western bolt 用不同浓度的维生素K2(0,10和30 μM)处理HuH7细胞96 h后，用预冷的PBS洗2次，加入裂解液冰上裂解(1×PBS,1% NP-40,0.5%去氧胆酸钠,0.1% SDS,100 μg/mL PMSF,45 μg/mL抑肽酶,100 mM原钒酸钠)。离心后收集上清，BCA法测定各样本蛋白浓度，调整上样量一致，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h后，

一抗4 ℃过夜，二抗室温孵育1 h。加入化学发光液，暗室中显影，用

Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。目的蛋白条带的灰度值与本组actin的灰度值相除，对所得数值进行统计学处理。

1.2.5 瞬时转染与荧光素酶测定 PDGFR-α启动子报告基因的结构如图1所示。HepG2细胞接种于直径为35 mm的培养皿中，细胞密度为5×103/孔，用含5%FBS-CCS的不含酚红的DMEM培养。细胞用4 μg Pluc-a2转染,同时用0.1 μg of PRL-TK转染，后者用于矫正转染效率。转染24 h后，培养基更换为含不同浓度(0,10和30 μM)维生素K2的新鲜培养基，孵育24 h，测定细胞裂解液中荧光素酶的活性。

所有实验至少重复3次，所得计量资料用均值±标准差±s)表示，应用SPSS 13.0软件，t检验分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

前期研究发现，维生素K2能以剂量依赖的方式抑制HepG2细胞的增殖[4]。与此相符，维生素K2也能抑制HuH7细胞的增殖。在HuH7细胞中，与对照组相比，10与30 μM的维生素K2分别抑制细胞增殖的比例为48.9%与65.7% (P<0.05)。基于此发现，我们选择10与30 μM作为进一步研究的药物浓度。

为了探讨维生素K2抑制HuH7细胞增殖的分子机制，以及了解PDGFR-α是否在此过程中发挥作用，我们采用不同浓度的维生素K2(0,10和30 μM)处理HuH7肝癌细胞96 h后，用实时定量PCR检测不同组PDGFR-α mRNA的表达。如图2所示，与对照组相比，10与30 μM的维生素K2处理的细胞中PDGFR-α mRNA的表达分别减少了(0.65±0.37)和(0.94±0.05)(P<0.01)。维生素K2以剂量依赖的方式抑制PDGFR-α mRNA的表达。

用不同浓度维生素K2处理细胞96 h后，western blot检测不同组PDGFR-α蛋白的表达，用Quantity One软件测定条带的灰度值。如图3所示，维生素K2显著抑制PDGFR-α蛋白的表达。10 和 30 μM浓度的维生素K2处理组细胞内

PDGFR-α的蛋白表达水平分别为对照组的(0.53±0.03)和(0.57±0.05)倍(P<0.05)。由此可见，维生素K2不仅抑制PDGFR-α mRNA，同时也抑制蛋白的表达。随后，我们检测维生素K2是否也在转录水平抑制PDGFR-α的表达。

荧光素酶实验用于检测维生素K2对PDGFR-α启动子区域活性的作用。PDGFR-α报告基因质粒瞬时转染HuH7细胞，随后检测荧光素酶的活性。如图4所示，10和30 μM浓度的维生素K2处理组细胞内PDGFR-α的荧光素酶相对活性分别为对照组的(0.75±0.12)和 (0.49±0.38)(P<0.05)。维生素K2抑制了PDGFR-α启动子活性。

研究发现，维生素K2具有抑制肝癌细胞增殖的作用[4,8]。与此相符，我们的研究表明，用维生素K2处理细胞96 h后，HuH7细胞的增殖以维生素K2剂量依赖的方式受到抑制。当用10 μM的维生素K2处理细胞时，细胞的数量明显减少。细胞数量的减少是由于增殖受到抑制，而不是细胞死亡。因为，在镜下并未观察到培养基中存在大量死亡细胞的现象。到目前为止，维生素K2抑制肝癌增殖的机制并不明确。

PDGFR是特异的蛋白酪氨酸激酶细胞表面受体，有2种亚型，即PDGFR-α和-β。在PDGFR与其相应的配体结合后，信号转导通路便被激活[12]。在生长发育过程中，PDGFR-α在许多组织中发挥作用，它参与增殖、形态发生、上皮与间质的相互作用[11,13]。近期的一项研究发现，PDGFR-α仅在恶性程度高的肝细胞肿瘤组织的内皮中高表达[10]。另有研究发现，以PDGFR-α为靶向的单克隆抗体处理人与小鼠肝癌细胞，能有效地抑制PDGFR-α的表达和细胞的增殖与转移；同样的，肝癌小鼠模型中的研究也表明，此单克隆抗体还能延长肝癌小鼠的生存期[2]。基于上述研究结果，我们可以做出假设：PDGFR-α可能参与维生素K2抑制肝癌增殖的机制。我们既往的研究发现，维生素K2能减少PDGFR-α的表达。 在本研究中，我们检测了维生素K2对PDGFR-α mRNA与蛋白表达，以及对

PDGFR-α启动子区活性的影响。首先，用实时定量PCR的方法检测PDGFR-α mRNA的表达。结果表明，用不同浓度的维生素K2处理细胞96 h后，随着维生素K2的浓度增加，PDGFR-α的表达逐渐减少。随后，我们用western blot的方法检测PDGFR-α蛋白的表达，结果与实时定量PCR的结果相符，PDGFR-α的表达以维生素K2剂量依赖的方式减少。以上研究结果表明，维生素K2能同时抑制PDGFR-α mRNA与蛋白的表达。然而，我们并不知道维生素K2的抑制作用是否因为其与PDGFR-α的启动子相互作用所致。最后，我们用瞬时转染与荧光素酶报告基因的方法，检测维生素K2对PDGFR-α启动子活性的影响。研究发现，随着维生素K2的浓度增加，PDGFR-α的活性逐渐减弱。

越来越多的研究表明，PDGF信号通路与几种病理状态相关，其中包含了纤维变性疾病，如肺纤维化、肝纤维化、硬皮病等[14]。近期的一项研究发现，过度表达PDGFR-α的一种配体PDGFR-C能导致肝纤维化，后者是由于胶原沉积于细胞外周与静脉周围形成的病理改变[15]。我们推测维生素K2可能通过抑制PDGFR-α的表达改善肝硬化。维生素K2改善肝纤维化的作用机理以及PDGFR在此过程中的作用，还有待进一步研究。然而，我们的研究为维生素K2抑制肝癌增殖的作用提供了依据，可能的分子机制是维生素K2抑制了PDGFR-α的表达。维生素K2可能成为肝细胞癌的潜在治疗剂。

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