正交试验法优选5_羟基色氨酸的提取工艺

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西北药学杂志　2006年4月　第21卷　第2期61

③波长选择　取黄芩苷对照品适量,用流动相配制成合适浓度的溶液,在200～400nm紫外光区内扫描。黄芩苷有3个最大吸收峰:214,277,314nm。其中214nm处吸收最大,灵敏度最高,但内标物对硝基苯甲酸在该波长下吸收较小且214nm处杂质干扰多,为保证待测物质与内标物具有足够灵敏度并减少干扰,选取274nm作为测定波长。参考文献:

〔1〕　曹于平,皋聪,孙继红,等.黄连解毒汤提取物的药理作

用研究[J].中国药科大学学报,1996,27(10):605.〔2〕　于留荣,李吉来.黄芩炮制饮片质量标准的研究[J].

中药材,19,12(4):25.

(收稿日期:2005-06-26)

可以增加血浆中促肾上腺皮质激素和可的松的水

〔8〕平。在食物吸收方面,对处于禁食和高压状态条件

〔9〕

下的小鼠有一定的抑制作用。近年来,5-羟基色氨酸的生产得到了迅速的发展,在国外医药行业的应用中日益广泛,为此,我们对非洲东部产的加纳籽粉采用正交试验,优化5-羟基色氨酸的生产工艺,以提高其生产率,为工业化生产提供重要依据。1　仪器与试药1.1　仪器　高效液相分析系统(Waters1525Binary

λAbsorbanceDetector,HPLCPump,Waters2487Dual

DellCompu);旋转蒸发器(R201);恒温水浴锅(W201B);真空泵(SHZ-95);超声波清洗机(AS3120);真空干燥箱(101A-2);粉碎机;热回流

正交试验法优选5-羟基色氨酸的提取工艺

许　慧,李多伟,任　静,孙诗清(西北大学生命科学

学院,陕西西安710068)

装置;电子天平(FA1004);高速离心机(LD5-10)。

1.2　试药　5-羟基色氨酸标准品(sigma公司);加纳籽粉来源于豆科植物Griffoniasimplicifolia的干燥成熟种子提取5-羟基色氨酸后的浸膏粉(陕西嘉禾药业公司提供);甲醇为色谱纯。2　方法与结果2.1　提取方法比较试验的选择　水热回流提取法:

摘要:目的　研究5-羟基色氨酸的最佳生产工艺。

方法　以5-羟基色氨酸含量为指标,采用正交试验方法考察提取时间,提取次数,料液比,提取温度诸因素对5-羟基色氨酸提取量的影响。结果　5-羟基色氨酸的最佳提取工艺为A2B3C2D2。结论　在80℃下,恒温提取2次,每次3h,按1ν15的料液比,确定为5-羟基色氨酸的最佳生产工艺条件。

关键词:5-羟基色氨酸;提取方法;正交试验;高效液相色谱法

中图分类号:R284.2　　　文献标识码:A文章编号:100422407(2006)0220061203

　　5-羟基色氨酸是由人体必需氨基酸色氨酸在体内被色氨酸羟化酶催化而成的,是一类重要的神经类药物。目前市场上的褪黑素、脑黄金等都是由5-羟基色氨酸转化而来的。5-羟基色氨酸作为一种药物与卡比多巴和盐酸氟西汀在临床上治疗缺氧

〔2〕

型肌阵挛取得较好的疗效。它也有一定的抗抑郁作用,可以刺激继地塞米松之后的β-内啡肽的水〔3〕

平。5-羟基色氨酸含量的变化与PCT患者的神经症状的缺失有很大关系。最近,在动物药理实验中发现,5-羟基色氨酸可以引起雄兔射精潜伏期

〔5〕

的延长,提高性兴奋水平。对口服给药的小鼠脑

〔6〕

中单胺能区的免疫产生影响。同时,5-羟基色氨酸对剥夺快动眼睡眠时相或是5-羟基色氨酸减少引起的回避反应的增强有一定的抑制作用

〔7〕

〔4〕〔1〕

取加纳籽粉末5.00g用50mL蒸馏水80C热回流

提取2h,过滤,收集滤液并用水定容至50mL。

醇热回流提取法:取加纳籽粉末5.00g用50mL

50%乙醇溶液80C热回流提取2h,过滤,收集滤液,并用50%乙醇溶液定容至50mL。

超声波水提取法:取加纳籽粉末5.00g,用50mL蒸馏水超声波提取30min,过滤,收集滤液,并用水定容至50mL。2.2　色谱条件　SymmetryC18(5μm,4.6mm×150mm)色谱柱,流动相甲醇∶水(5∶95),流速1.0

-1

mL・min,检测波长276nm,进样量10μL,灵敏度0.01AUFS,柱温室温。

2.3　标准曲线的制备　精密称取5-羟基色氨酸对照

品10.0mg,置10mL量瓶中,加50%乙醇溶解并用50%乙醇定容至刻度,摇匀,制成1.0g・L对照品溶液。稀释,使5-羟基色氨酸对照品浓度分别为0.8,0.6,0.4

-1

和0.2g・L,按色谱条件进行测定,结果5-羟基色氨酸峰面积(Y)与其量(X,μg)在2.0～10.0μg范围内有良好的线性关系。回归方程为:

Y=235116.78035+9.72275E6×X,r=0.99915

-1

2.4　提取温度的影响　在料液比为1∶10,提取时间为2h,提取次数为3次的条件下研究了温度(50,

70,80,90C)对5-羟基色氨酸得率(8.26%,

9.%,10.14%,10.20%)的影响。结果表明,随着

。它也提取温度的增加,5-羟基色氨酸的量在增加,但在

62西北药学杂志　2006年4月　第21卷　第2期

80℃以后,提取率增加的幅度减小。

2.5　提取时间的影响　在料液比为1∶10,提取温

度为80℃,提取次数为3次的条件下研究了提取时

间(1,2,3,4h)对5-羟基色氨酸得率(9.15%,10.28%,10.57%,10.82%)的影响。结果表明,随着

　　将在不同水平下提取出的样品液抽滤后定容于250mL量瓶中,通过HPLC分析检测系统分别检测出不同水平下的5-羟基色氨酸含量,结果见表2。

表3　方差分析

方差来源

BCDe

提取时间的延长,5-羟基色氨酸的量在增加,但在2h以后,提取率增加的幅度减小。

2.6　提取次数的影响　在料液比为1∶10,提取时

偏差平方和

0.000249

0.0001180.0001083.39E-053.39E-05

自由度2

2222

均差0.000125

5.9E-055.4E-051.7E-051.7E-05

F比显著性

3333

7.3470229913.47828653.1851138

间为2h,提取温度为80℃的条件下研究了提取次数(1,2,3,4次)对5-羟基色氨酸得率(8.94%,10.46%,10.87%,10.94%)的影响。结果表明,随着提取次数的增加,5-羟基色氨酸的量在增加,但在2次以后,提取率增加的幅度减小。

2.7　料液比的影响　在提取温度为80℃,提取时间

　　33P<0.01,3P<0.05

　　通过正交试验可知各因素对提取效果的影响程度依次为A>B>C>D,因素A对实验的效果很显著

(P<0.01),因素B和C对实验结果影响显著(P<0.05),而实验D对实验结果影响不显著,可任意选取一个水平。因此,最优提取工艺条件可选取方案A2B3C2D23　小结

为2h,提取次数为3次的条件下研究了料液比(1∶

10,1∶15,1∶20,1∶25)对5-羟基色氨酸得率(9.11%,10.56%,10.63%,10.80%)的影响。结果

表明,随着料液比的增加,5-羟基色氨酸的量在增加,但在料液比为1∶15以后,增加的幅度减小。2.8　正交试验结果　在讨论了各单因素影响的基础

上,为探讨各工艺参数相互交叉影响,试验设计了四因素三水平正交试验,结果分别见表1,表2,表3。精确称取加纳籽粉末5.0g,按下列因素及不同水平进行正交提取实验。

表1　因素水平表

因素

A提取温度/℃B提取时间/hC提取次数/次D料液比170111∶10①水热回流提取法、醇热回流提取法、超声波水提取法都可以用于5-羟基色氨酸的提取,水热回流提取法略高于其他两种方法。②通过正交试验确定5-羟基色氨酸最佳提取工艺为:用水80C热回流提取2次,每次提取3h,料液比为1∶15。参考文献:

〔1〕　薛启冥.神经系统的生理和药理化学[M].第2版.北

京:科学出版社,1992.210～211.〔2〕　郭秀海,丁生元,刘军,等.5-羟色氨酸治疗缺氧后肌

阵挛1例报告[J].临床神经病学杂志,2002,15(5):313.〔3〕　Michaelmaes,AnnVanGastel,RakeshRanjanetal.

StimulatoryEffectsof1-5-HydroxytryphophanonPost2dexamethasoneβ-EndorphinlevelsinMajorDepression[J].Neuropsychopharmacology,1996,15(4):340～348.

〔4〕　ElenaB.C.Liambias,CarmenAldonatti,LeonorC.San

Martindeviale.Tryptophanmetabolismviaserotonininratswithhexachlorobenzeneexperimentalporphyria[J].Biochemicalpharmacology,2003,66(1):35～42.

〔5〕　SvenAhlenius.KnutLarsson.Evidenceforaninvolvement

of5-HT11Breceptorsintheinhibitionofmaleratejacula2torybehaviorproducedby5-HTP[J].Psychopharmacolo2gy,1998,137:374～382.〔6〕　ChristinaP.Lynn-Bullock,KristyWelshhans,SarahL.

Pallas,PaulS.Katz.Theeffectoforal5-HTPadminis2trationon5-HTPand5-HTimmunoreactivityinmono2aminergicbrainregionsofrat[J].JournalofChemicalNeuroanatomy,2004,27(2):129～138.〔7〕　RandyL.Smith,CraigH.Kennedy.Increasesinavoidance

respondingproducedbyREMsleepdeprivationorserotonindepletionarereversedbyadministrationof5-hydroxytryp2tophan[J].BehaviouralBrainResearch,2003,140(1):81～86.

〔8〕　AhmedAmer,JeffBreu,JanineMcDermottetal.5-Hy2

水平

280221∶15390331∶20表2　正交实验结果

序号

1234567ⅠjIIjIIIjIj/3IIj/3IIIj/3RR/3Sj提取温度1112223330.27210.30180.30840.09070.10060.10280.2602320.0867440.000249提取时间提取次数料液比5-羟基色氨酸含量(%)

1118.052229.523339.12310.072319.7631210.3513210.292139.6232110.930.28410.28020.28740.20.30520.30160.30920.29690.2933G=0.88230.09470.09340.0958CT=0.050.0963330.1017330.1005330.1030670.09670.0977670.2598380.2598090.2595860.0866130.0866030.0865290.0001180.0001083.39E-05　　R=Ij2+Ⅱj2+IIIj2

西北药学杂志　2006年4月　第21卷　第2期

droxy-L-tryptophansuppressesfoodintakeinfood-de2

privedandstressedrats[J].Pharmacology,BiochemistryandBechavior,2004,77(1):137～143.〔9〕　P.A.Sargent,D.J.Quested,P.J.Cowenetal.Clomipra2

mineenhancesthecortisolresponseto5-HTP:implica2tionsforthetherapeuticroleof5-HT2receptors[J].Psy2chopharmacology,1998,140:120～122.〔10〕　许海琴,许列琴,许洪苇.常用天然提取物质量标准参

考手册[M].北京:化学工业出版社,2003.285～286.

(收稿日期:2005-05-09)

2.2　标准曲线和线性范围考察　精密吸取对照品溶

液0.2,0.5,1.0,2.0和3.0mL置10mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,再分别精密吸取2mL置10mL量瓶中以甲醇定容至刻度,摇匀,待测定。分别精

密吸取定容液50μL注入液相色谱仪(以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,甲醇-醋酸-水35∶4∶65为流动相),分别得到峰面积为11.58,29.41,60.02,114.98和176.14。所得数据经统计学处理,得回归

HPLC法测定骨碎补酊中柚皮苷

方程:Y=1.19450512X+0.2939272,r=0.9999

(n=5)。结果表明,柚皮苷在9.76～146.4ng范围

含量

张红旭,郭　辉(江苏省徐州市第三人民医院,江苏徐州

221005)

内呈良好线性关系。

2.3　精密度考察　精密吸取对照品溶液1mL共5

份,照“样品测定”项下方法,自“置于10mL量瓶中”起,同法测定,测得5份对照品溶液柚皮苷含量的

RSD=1.72%(n=5)。

2.4　稳定性考察　同一样品溶液在24h内不同时

摘要:目的　建立骨碎补酊的质量标准。方法　采

用HPLC法测定柚皮苷含量。结果　柚皮苷在9.76～146.4ng范围内呈良好线性关系,平均加样回收率为98.9%,RSD为1.5%。结论　本法可用于骨碎补酊的质量控制。

关键词:骨碎补酊;柚皮苷;质量标准中图分类号:R927.2　　　文献标识码:A文章编号:100422407(2006)0220063202　　骨碎补酊是我院皮肤科的协定处方,是由水龙骨科植物槲蕨Drynariafortunei(kunze)J.Sm.的干燥根〔1〕

茎经科学提取加工而制成的酊剂,经多年临床验证,外用治疗白癜风、斑秃,疗效确切。制剂的活性成分是以柚皮苷为主的二氢黄酮类化合物。为有效控制骨碎补酊质量,笔者研究了其柚皮苷的含量测定方法。1　仪器与试药1.1　仪器　UV-2401紫外分光光度仪(日本岛津公司);LC-6A高效液相色谱仪(日本岛津公司);中北色谱工作站(大连化物所);SPD-6AV可见-紫外检测器(日本岛津公司)。1.2　试药　柚皮苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110721-200308);骨碎补酊(本院制剂室自制);甲醇、醋酸为色谱纯(天津四友生物医学技术有限公司)。

〔2,3〕

2　方法与结果2.1　对照品溶液的制备　精密称取在110℃干燥至恒重的柚皮苷对照品20mg,置100mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,精密吸取3mL,置10mL量瓶中,以甲醇定容至刻度,摇匀,即得(每1mL中含柚皮苷60μg)。

间照“样品测定”项下方法操作,测定5次,其柚皮苷含量的RSD=1.%(n=5),表明在24h内具有良好的稳定性(样品批号041011)。2.5　重复性考察　精密吸取同一批号样品5份(批

号031101),分别照“样品测定”项下方法操作,测定,其含量的RSD=1.7%(n=5)。

2.6　加样回收率考察　精密吸取供试液(批号041103,现已知含量)10mL共5份,每份精密加入柚

皮苷对照液500μL,按“样品测定”项下方法操作,测定,结果平均加样回收率为98.9%,RSD=1.5%(n=5)。

2.7　样品测定　取本品10mL,置水浴上蒸干,残渣

以甲醇溶解、转移于10mL量瓶中并稀释至刻度,摇匀,再分别精密吸取2mL,置于10mL量瓶中以甲醇定容至刻度,摇匀,分别精密吸取定容液50μL注入液相色谱仪,测定,由标准曲线计算含量。

表1　骨碎补酊中柚皮苷含量测定结果(n=5)批号040902040905041001041002041104柚皮苷含量/(g・L-1)4.504.614.494.524.50RSD(%)1.71.91.61.81.63　讨论

骨碎补酊是将骨碎补中粉以60%乙醇为溶剂回流提取制成的酊剂,骨碎补的活性成分是以柚皮苷为主的二氢黄酮类化合物。作为中药制剂,以往我们对骨碎补酊在质量控制上只进行定性分析,存在局限性。在以往工作的基础上,我们研究了其活性成分柚皮苷的含量测定方法,结果准确,重复性好,且易于操

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