RDP-p53融合蛋白对小鼠炎症细胞因子的影响

赵博;孙梅;刘婷;赖利金;付爱玲;徐兴然

【摘 要】研究不同剂量RDP-p53融合蛋白对小鼠炎症细胞因子的影响.通过大肠杆菌Rosetta表达蛋白并纯化,SDS-PAGE确定RDP-p53融合蛋白准确性.同时,将昆明小鼠分为空白对照组和RDP-p53融合蛋白高、中、低剂量组,经腹腔注射给药,摘眼球取血,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量.RDP-p53融合蛋白在上清和沉淀中均获得表达.ELISA测定结果表明,与对照组比较,低、中剂量组小鼠血清炎症因子水平没有明显变化(P＞0.05),高剂量组的IL-1β和TNF-α含量显著升高(P＜0.05).成功制备RDP-P53融合蛋白,并为进一步研究RDP-p53融合蛋白抗神经胶质瘤药理作用时给药剂量的确定提供了实验依据. 【期刊名称】《科学技术与工程》 【年(卷),期】2014(014)010 【总页数】4页(P1-3,10)

【关键词】p53;RDP;炎症细胞因子;细胞穿膜肽 【作 者】赵博;孙梅;刘婷;赖利金;付爱玲;徐兴然

【作者单位】西南大学药学院,重庆400715;西南大学药学院,重庆400715;西南大学药学院,重庆400715;西南大学药学院,重庆400715;西南大学药学院,重庆400715;西南大学药学院,重庆400715 【正文语种】中 文

【中图分类】R963

p53基因是重要的肿瘤抑制基因，编码的p53蛋白在细胞周期调控、DNA修复和诱导细胞凋亡等方面均具有关键性作用，人类50%以上的肿瘤组织中存在p53基因突变，是所检测到的最常见的基因突变，有研究人员指出，野生型p53蛋白功能的缺失是肿瘤发生的必要条件［1］。将p53蛋白导入肿瘤细胞就可以发挥较好的的抗肿瘤功效，但是p53蛋白作为大分子物质自身难以穿过细胞膜进入肿瘤细胞，使其应用受到了一定限制。

Kumar等研究发现来源于狂犬病毒衣壳糖蛋白的衍生肽段(rabies virus

glycoprotein derived peptide，RDP)能携带抗病毒的siRNA通过血脑屏障特异性地传递到感染了脑炎的小鼠脑中，大大提高患脑炎小鼠的存活率，并且RDP作为载体具有较高的安全性［2］。Kumar等对RDP的开创性研究为解决大分子难以穿过细胞膜及血脑屏障入脑的问题提供了很好的基础，我们实验室前期成功利用RDP携带大分子蛋白质BDNF快速特异性进入脑内［3］。以往研究中一般通过往细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPP)携带大分子进入细胞［4］，RDP 多肽作为新型脑靶向递药载体克服了CPP无组织特异性的缺陷。

实验利用生物技术通过大肠杆菌表达RDP-p53融合蛋白，以期通过脑靶向递药载体RDP携带p53穿过血脑屏障，用于开发治疗脑肿瘤比如神经胶质瘤的新型药物。p53除具有抗肿瘤作用外，还与炎症介质之间存在一定联系，p53可以影响炎症细胞因子(inflammatory cytokine)的分泌［5］;融合蛋白作为机体的外源性物质，可能会激活机体自身的免疫反应［6］，引发自身免疫性炎症。研究表明机体释放的一系列炎症细胞因子可以对药物代谢酶的表达和功能产生调控，机体对药物的处置过程会发生显著改变［7］。因此，炎症细胞因子可能会影响RDP-p53融合蛋白的药理作用。实验通过ELISA检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α的水平来分析腹腔

注射不同剂量的RDP-p53融合蛋白对小鼠血清炎症细胞因子水平的影响，为研究RDP-p53融合蛋白抗神经胶质瘤的药理作用奠定基础。 1 材料

1.1 主要试剂和仪器

蛋白宽分子量Marker(TaKaRa);Ni-NTA柱、IPTG(上海生工);Mouse IL-1β Elisa Kit、Mouse IL-6 Elisa Kit和Mouse TNF-αElisa Kit(美国RD公司)。凝胶成像系统(Bio-Rad);JY92—Ⅱ型超声细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技有限公司);ELX800型酶标仪(德国Invitek公司)。 1.2 质粒、菌株和动物

质粒pET28a-RDP-p53、大肠杆菌Roseta均由本实验室保存。昆明雄性小鼠，体重(20±2)g，由重庆腾鑫比尔动物科技有限公司提供。 2 方法

2.1 RDP-p53融合蛋白的制备

将重组质粒pET28a-RDP-p53导入感受态大肠杆菌Rosetta，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选阳性单克隆，接种于含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃160 r/min培养过夜，次日以1/50比例转接于含卡那霉素的LB培养基中，在32℃220 r/min条件下1.0 mmol/LIPTG进行诱导表达6 h，5 500 g离心30 min，收集菌体、超声波破碎，离心后收集上清液和沉淀，进行12%SDSPAGE，以未诱导的含pET28a-RDP-p53质粒的重组菌作为对照。经Ni-NTA柱分离后得到纯化的RDP-p53融合蛋白，并通过Lowry法测定蛋白浓度。 2.2 给药方法

取昆明小鼠20只，分为4组:空白对照组(等容生理盐水)、RDP-p53高、中、低剂量(4 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg)组，每组 5只，腹腔注射，每隔 2 d给药1次，连续14 d。

2.3 小鼠血清炎症细胞因子含量测定

14 d后摘眼球取血，室温血液自然凝固30 min，离心15 min左右(3 000 r/min)，仔细收集上清，于－70℃贮藏备用。血清中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量测定采用ELISA法，操作按照RD公司ELISA试剂盒使用说明书进行。 2.4 统计学方法

数据采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，数值以均数±标准差(x ±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。 3 结果

3.1 RDP-p53融合蛋白的制备

含有重组质粒pET28a-RDP-p53的大肠杆菌Rosetta的诱导表达产物经

12%SDS-PAGE分析，于66 kD左右处出现一条特异的融合蛋白条带(融合蛋白实际大小为58 kD左右)，推测是由于His-tag中的碱性氨基酸的作用造成蛋白在SDS-PAGE中迁移变慢，而导致偏差［8］。诱导表达的RDP-p53融合蛋白在上清和沉淀中均获得表达;上清经Ni-NTA柱亲和层析柱纯化后，测定蛋白浓度为1.42 mg/mL。见图1。 图1 融合蛋白的SDS-PAGE分析

3.2 RDP-p53融合蛋白对小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的影响

小鼠血清 IL-1β、IL-6和 TNF-α水平与 RDP-p53融合蛋白的剂量成正相关。与空白对照组比较，低、中剂量组小鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 含量未达到显著差异水平，高剂量组的IL-1β和TNF-α含量显著升高。见表1。 4 讨论

p53作为重要的肿瘤抑制基因，其编码产物p53蛋白可通过不同的途径来抑制或杀伤肿瘤细胞，基于p53的药物研究和开发也成为肿瘤治疗的热点领域。有文献

报道利用细胞穿膜肽TAT的蛋白转导作用，将p53携带进入肿瘤细胞［9］。近年来通过对p53途径机制的研究，设计能够干扰p53-MDM2蛋白相互作用的小分子抑制剂，激活p53抑癌活性是肿瘤治疗的策略之一［10］。2003年深圳赛百诺基因技术有限公司研制的重组腺病毒p53注射液(今又生)上市，成为世界上第一个基因治疗产品，为许多晚期肿瘤患者带来了新的希望。以往以p53为靶标的抗癌药物没有很高的选择性，在杀死肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有一定的伤害，因此，靶向性抗癌药物成为当前研究热点。

表1 RDP-p53融合蛋白对小鼠血清炎症细胞因子的影响注:与空白对照组比较，*表示P＜0.05，＊＊表示P＜0.01。组别 IL-1βIL-6TNF-α含量/(ng·L－1) P 值 含量/(ng·L－1) P 值 含量/(ng·L－1) P 值空白对照组 63.33±3.55 128.60±4.25 324.55±7.84低剂量组(1 mg/kg) 63.41±2.49 0.963 129.41±5.88 0.834 325.45±7.50 0.907中剂量组(2 mg/kg) 64.27±2.19 0.579 131.76±8.28 0.419 330.61±9.19 0.439高剂量组(4 mg/kg) 68.09±1.95* 0.011 135.14±4.83 0.105 350.90±19.53＊＊ 0.003

RDP由狂犬病毒糖蛋白上的29个氨基酸片段与含有9个Arg的CPP连接而成，研究中通过罗丹明B标记的RDP能快速通过血脑屏障，并在中枢神经系统中呈现高分布，而在外周组织中几乎没有分布，这说明RDP具有很强的组织特异性［11］。中枢神经系统疾病严重威胁人类的健康，但至今治疗中枢神经系统疾病的药物仍然缺乏，其主要原因在于血液和脑之间血脑屏障的存在，使得大量具有治疗潜力的药物分子难以通过，近些年来发展起来一种新的技术，即使用具有穿透血脑屏障的多肽，引导外源物质入脑转运，RDP多肽为治疗脑部疾病药物的靶向转运提供了一个很好的途径［12］。基于此，现制备了有潜在特异性治疗脑肿瘤作用的RDP-p53融合蛋白，为抗脑肿瘤药物的研制提供了新的设计思路。 p53与炎症细胞因子相互作用关系及其机制的研究尚处于初始阶段，有待进一步

的挖掘。巨噬细胞、Kupffer细胞释放以 IL-1β、IL-6、TNF-α 为代表的炎症细胞因子，许多研究已表明炎症细胞因子能够下调药物的代谢活性，药物转运体的调控与炎症细胞因子的表达量相关［8］。炎症细胞因子可能会影响药物的清除、血浆半衰期和组织分布，改变药效/药动学，使在非临床研究中观察到的效应可能并非药物真正的药理反应，因此需要评价RDP-p53融合蛋白对小鼠血清炎症细胞因子的影响。TNF-α是引起炎症反应的关键细胞因子，TNF-α过度的产生会导致 IL-1β 过度表达［13］，IL-1β 促进其他细胞因子如IL-6的释放［14］。实验结果表明:小鼠炎症细胞因子的含量呈剂量依赖，与空白对照组相比，低、中剂量组小鼠血清 IL-1β、IL-6、TNF-α 含量未达到显著差异水平。因此，1 mg/kg和2 mg/kg剂量下对小鼠重复多次腹腔注射RDP-p53融合蛋白不会促使炎症细胞因子水平显著升高，为RDP-p53融合蛋白腹腔注射给药剂量的确定提供了实验依据，可在此给药剂量条件下进一步通过动物实验来研究RDP-p53融合蛋白抗神经胶质瘤效果。 参考文献

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