溶菌酶结晶实验的步骤及其注意事项 (1)

溶菌酶晶体培养实验

获得质量较好的晶体是开展X-射线衍射技术的前提。溶菌酶结晶实验就是要让学生亲自动手实验来获得实实在在的晶体。溶菌酶易于结晶，结晶条件简单，通常被选来作为蛋白晶体入门教学。

原理和方法：

溶菌酶（lysozyme）是由129个氨基酸组成的，分子量为14307Da的较稳定的无毒的碱性球蛋白。

蛋白质结晶通常是利用气相扩散（Vapor Diffusion）的原理来完成：也就是将含有高浓度的蛋白质（5-50mg/ml）溶液加入合适的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沉淀状态时，蛋白质分子将整齐的堆积形成晶体，包含纯化蛋白、缓冲液和沉淀剂的小液滴，与大样品池中相似缓冲液和更高浓度的沉淀剂之间形成平衡。起初，蛋白质溶液中的小液滴包含了低浓度的沉淀剂，随着水分的蒸发并转移到大样品池中，沉淀剂浓度也增大到最合适蛋白结晶的水平。当系统处于平衡状态，这种最佳条件就继续维持直至晶体产生。

利用气相扩散原理获得晶体的实验操作方法有两种，分别是：悬滴法和座滴法。此次实验采用的是悬滴法。

下面是模式图：

这次实验所用的为5mg/ml,10mg/ml,20mg/m,30mg/ml的溶菌酶溶液（已经在实验前准备好了）。

池液：A液0%(M/V)的NaCl溶液，pH=4.8

B液30%(M/V)的NaCl溶液，pH=4.8

实验步骤：

1. 将16孔板向下轻磕几下，将孔内可能存在的杂物磕出来，并用洗耳球吹几次。 2. 向针管中装填真空脂。

3. 用针管在16孔板的边缘涂真空脂，确保均匀。

4. 向16孔板中的每个孔按照一定的比例加入A液和B液，总体积为300微升，

接着用移液将池液吹打混合均和。下附参考的池液混合比例表（也可自行安排混合比例，标准的生长溶菌酶的条件：20mg/ml的溶菌酶溶液和10%的NaCl溶液。过高浓度可能会发生沉降，过低浓度可能会生长的晶体太小，但是作为探究性试验，可以在标准的附近拉一下梯度。）

5%NaCl+5mg/ml溶菌酶 10%NaCl+5mg/ml溶菌酶 15%NaCl+5mg/ml溶菌酶 20%NaCl+5mg/ml溶菌酶 5%NaCl+10mg/ml溶菌酶 10%NaCl+10mg/ml溶菌酶 15%NaCl+10mg/ml溶菌酶 20%NaCl+10mg/ml溶菌酶 5%NaCl+20mg/ml溶菌酶 10%NaCl+20mg/ml溶菌酶 15%NaCl+20mg/ml溶菌酶 20%NaCl+20mg/ml溶菌酶 5%NaCl+30mg/ml溶菌酶 10%NaCl+30mg/ml溶菌酶 15%NaCl+30mg/ml溶菌酶 20%NaCl+30mg/ml溶菌酶 5. 取出一个硅化好的玻璃片，确保光滑面朝上，用洗耳球吹干净其表面。

6. 用晶体吸取1微升蛋白液点到玻璃片，然后另取相应孔内1微升池液点到蛋

白液滴上（每位同学点一板晶体，所以晶体可能不够用，可以选择点1.5微升的蛋白和1.5微升的池液，这样就可以用10微升量程的移液了）。应避免气泡的产生。

7. 将点好蛋白和池液的玻璃片反盖到孔上，轻轻压紧，也可以稍微转动玻璃片，

使得液滴与孔内的池液能够在一个密闭的空间内。

8. 将16个孔都点好后，在晶体板上标好蛋白名称及其浓度，实验人员姓名，日

期，池液名称及浓度等相关信息。

9. 盖好盖子，放到晶体室。第二天在晶体室观察长出的晶体。

注意事项：

1. 整个实验最好在16摄氏度下进行，可供选择的恒温地点是：北楼晶体观

察室；晶体室；层析间。

2. 晶体板和玻璃片都要保持洁净，晶体板可以通过轻磕和用洗耳球吹来去除

可能的杂物，玻璃片需要注意正反面，用前需要用洗耳球吹干净。 3. 溶菌酶溶液在用前需要在4摄氏度离心机中12000rpm离心10分钟，需

要在冰上放置。吸取蛋白时，如果不够熟练可以用手将EP管从冰中拿出来，但是每一次吸取完都应该及时放到冰上。 4. 池液用之前要进行抽滤。 5. 真空脂要涂均匀。 6. 先点蛋白，再点池液。

7. 若要点一个液滴，需要点到玻璃片的中心；若要点两滴，需要两滴相互之

间连线的中点在玻璃片的中心上，并且千万不要将液滴点到玻璃片的边缘。 8. 由于吸取的量较少，因此吸取和打出蛋白液和池液的时候要缓慢，将其完

全打出。一定要避免在液滴中产生气泡。 9. 玻璃片一定要盖严实，保证孔内是密闭的空间。

10. 在板子上做好标记，不要只在盖子上做标记，因为盖子容易搞混，所以最

好在板子上也做上标记。