水中总大肠菌群的测定—多管发酵法
一．原理
总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
三．仪器
(1)高压蒸气灭菌器。 (2)恒温培养箱、冰箱。 (3)生物显微镜、载玻片。 (4)酒精灯、3mm接种环。
(5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶、移液枪。
四．培养基及染色剂的制备
1．乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
2．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。
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3．伊红美蓝培养基：
①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解。再加2.0g邻酸二氢钾及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL，调节溶液pH值为7.2～7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121℃高压灭菌15min，贮于冷暗处备用。
②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2%伊红水溶液（0.4g伊红溶于20mL水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g美蓝溶于13mL水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。
4．革兰氏染色剂：
①结晶紫染色液：将20mL结晶紫乙醇饱和溶液（称取4～8g结晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL 1%草酸铵溶液混合、过滤。该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
②助染剂：将1g碘与2g碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分振荡，待完全溶解后，用蒸馏水补充至300mL。此溶液两周内有效。当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。为易于贮备，可将上述碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中，临用前再加水稀释。
③脱色剂：95%乙醇。
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④复染剂：将0.25g沙黄加到10mL95%乙醇中，待完全溶解后，加90mL蒸馏水。
五．测定步骤 水源水
①于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管）分别加入1mL 1∶10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。
②平板分离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落：
a．伊红美蓝培养基上：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色，中心色较深的菌落。
③取上述特征的群落进行革兰氏染色：
a．用以培养18～24h的培养物涂片，涂层要薄；
b．将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去；
c．滴加助色剂，1min后用水洗去；
d．滴加脱色剂，摇动玻片，直止无紫色脱落为止（约20～30s），用水洗去；
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e．滴加复染剂，1min后用水洗去，晾干、镜检，呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为阴性菌。
④复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。
结果与分析： 初发酵实验
10ml原水+5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基：5管有产酸产气现象 1ml原水+10ml普通浓度乳糖蛋白胨培养基：2管有产酸产气现象，1管有产酸现象
1ml1：10稀释水样+10ml普通浓度乳糖蛋白胨培养基：1管有产酸产气现象
复发酵实验：
10ml原水+5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养基：5管有产酸产气现象 1ml原水+10ml普通浓度乳糖蛋白胨培养基：2管有产酸产气现象 1ml1：10稀释水样+10ml普通浓度乳糖蛋白胨培养基：1管有产酸产气现象
结论：从最可能数（MPN）表中查检验结果5～2～1，得知100mL
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水样中的总大肠菌群数为70个，故1L水样中的总大肠菌群数为70×10=700个。
对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应做1∶10、1∶100、1∶1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。
如果接种的水样量不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值：
MPN值MPN指数10(mL)
接种量最大的一管(mL)
附表1 大肠菌群检数表
接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份） 10mL水量的阳性管数 0 1L水样中大肠菌群数 0 1 <3 3 100mL水量的阳性瓶数 1 1L水样中大肠菌群数 4 8 2 1L水样中大肠菌群数 11 18 第 5 页 共 8 页
2 3 4 5 6 7 8 9 10
7 11 14 18 22 27 31 36 40 13 18 24 30 36 43 51 60 69 27 38 52 70 92 120 161 230 >230 附表2 最可能数（MPN）表
（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值） 出现阳性份数 每100m10m1 0.1 L水mL样中细菌第 6 页 共 8 页
95%可信限值 下限 上出现阳性份数 每100m95%可信限值 下限 上限 10m1 0.1 L水mL样中细菌L管 mL限 L管 mL
管 管 数的最可能数 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 4 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 2 3 0 0 1 1 1 2 2 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 2 0 1 <2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 17 17 13 17 17 21 26 22 26 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 <0.5 7 7 11 7 11 15 15 15 13 46 46 31 46 46 63 78 67 78 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 管 管 数的最可能数 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 3 0 1 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 49 70 94 79 110 140 180 130 170 1 1 2 2 3 1 2 2 4 4 17 17 21 21 28 19 25 25 34 34 17 130 23 170 28 220 25 190 31 250 37 310 44 500 35 300 43 190 第 7 页 共 8 页
4 4 4 5 5 5 5 5 5 3 3 4 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 27 33 34 23 34 43 33 46 63 5 5 3 5 5 7 9 7 9 9 11 12 7 11 15 11 16 21 80 93 93 70 89 110 93 120 150 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 5 5 5 5 5 5 2 3 4 0 1 2 3 4 220 280 350 240 350 540 920 1600 57 700 90 850 120 1000 68 750 120 180 300 640 1000 1400 3200 5800 5 ≥2400
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