王瑞娟;熊晔蓉;涂家生
【摘 要】目的 建立大鼠血浆中铂含量测定的方法学,探讨顺铂经静脉注射给药后在大鼠体内的药动学过程.方法 采用浓硝酸消解法石墨炉原子吸收光谱(GFAAS)法测定血浆中铂含量.结果 第一步干燥温度100℃,时间20 s,第二步干燥温度150℃,时间30 s;灰化温度1500℃,时间30 s,升温速率150℃·s-1;原子化温度为2700℃,净化温度2800℃下,此法测定铂标准曲线方程为:A=0.00249C+0.0072,相关系数为R2=0.9997;检出限为1.93 ng·mL-1.结论 石墨炉原子吸收光谱法测定血浆中铂含量的方法准确可靠,简便易行. 【期刊名称】《药学研究》 【年(卷),期】2018(037)006 【总页数】4页(P315-317,331) 【关键词】顺铂;石墨炉;原子吸收 【作 者】王瑞娟;熊晔蓉;涂家生
【作者单位】中国药科大学,江苏 南京210009;中国药科大学,江苏 南京210009;中国药科大学,江苏 南京210009 【正文语种】中 文 【中图分类】R969.1
石墨炉原子吸收光谱(graphite furnace atomic absorption
spectrometry,GFAAS)法是以石墨材料为原子化器，利用电流加热原子化进行原子吸收分析的方法。相较于其他原子吸收光谱法，此法具有灵敏度高、选择性好、样品制备简单、背景扣除技术成熟、基体干扰较少等优点，被广泛应用于医药化学等各领域金属元素的痕量[1-3]。顺铂(cis-dichlorodiammine platinum-Ⅱ，CDDP)是金属铂类药物中疗效最为显著的一线抗癌药物，能广泛治疗包括睾丸癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、颈癌和非小细胞肺癌等在内的一系列癌症[4-7]。但顺铂的低溶解度和非挥发性导致生物样品中铂浓度的测定比较困难。
近年来，不少文献报道了关于顺铂的体内分析方法和检测技术[8-10]。①紫外吸收法：顺铂的紫外吸收强度很弱，需要对样品进行衍生化，以二乙基硫代氨基甲酸钠等物质对样品进行前处理，操作非常烦琐；②高效液相色谱法：高效液相色谱法所需样品量少，灵敏度高，操作简便、迅速，广泛应用于顺铂的体内分析。由于顺铂与血浆中的蛋白和DNA结合力很强，如果使用常规的紫外检测器，仍然需要对样品进行柱前衍生或柱后衍生。其他的电化学检测器操作简便，但是检测费用较高。此外还有电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、气相色谱法等。
血浆中铂含量反映了顺铂在体内的吸收、分布和排泄的平衡过程，本文旨在建立GFAAS法测定大鼠血浆中铂含量的方法，并对其在大鼠体内的药动学进行初步考察，为金属铂类药物在临床上的进一步研究提供参考。 1 仪器与材料
1.1 仪器 Thermo iCE 3000 石墨炉原子吸收分光光度计(Thermo,USA)；HH-4 智能数显恒温水浴锅(南京科尔仪器设备有限公司)；ZNJR-B 140-140平板加热器(南京科尔仪器设备有限公司)；HC-2062高速离心机(安徽中科中佳科学仪器公司)。
1.2 试剂 铂国家标准液(1 000 μg·mL-1，国家有色金属及电子材料分析测试中心)；浓硝酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；肝素钠(美国Sigma-Aldrich
公司)；顺铂(山东铂源药业有限公司，批号：20141006)；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
1.3 动物 健康雄性大鼠[SPF级，体重200～220 g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，生产许可证号：SCXK(浙)2014-0001]。在温度(25±2)℃和
(65%±5%)相对湿度自然光照条件下自由进食和饮水。所有动物实验均在国家健康指导协会的指导下进行，并由中国药科大学动物伦理委员会批准。 2 方法
2.1 仪器条件 铂含量测定采用Thermo iCE 3000石墨炉原子吸收分光光度计：四线氘灯背景校正：空心阴极灯测定波长265.9 nm，ELC石墨管(Extended Lifetime Cuvettes)；自动进样器进样体积20 μL；载气为高纯氩气；采用如表1所示升温程序和载气流速控制。
表1 升温程序和载气流速控制步骤温度/℃时间/s升温速率/℃·s-1氩气流速/L·min-111002020.2215030150.231 500301500.242 70030052 800300.2 2.2 标准曲线的制备 精密吸取铂标准溶液(1 000 μg·mL-1)适量，加入一定量空白血浆，用浓硝酸消解，用3%稀硝酸稀释并配置浓度为40、80、120、160 和200 ng·mL-1的铂标准溶液。以3%稀硝酸为空白溶液，分别取20 μL于石墨炉原子吸收分光光度计测定吸光度值A，由吸光度值A对铂标准溶液浓度C做回归计算，得到标准曲线。
2.3 准确度 准确度用回收率表示。精密吸取铂标准溶液适量，加入一定量空白血浆，用浓硝酸消解，用3%稀硝酸稀释配制40、120、200 ng·mL-1 3种浓度的铂标准液。以3%稀硝酸为空白溶液，分别取20 μL于石墨炉原子吸收分光光度计测定，将所测铂含量与加入的铂含量进行比较，计算回收率及其相对标准偏差。 2.4 精密度 精密吸取铂标准溶液适量，加入一定量空白血浆，用浓硝酸消解，用3%稀硝酸溶液分别配制40、80、160 ng·mL-1 3种浓度的铂标准液，连续测
定5次，计算日内相对标准偏差。各浓度一周内重复测定3次，计算日间精密度，用随行标曲分别计算铂含量，并与加入的铂含量进行比较。
2.5 检测限和定量限考察 配制一系列低浓度的铂标准溶液，加入一定量空白血浆，用浓硝酸消解，以3%稀硝酸为空白溶液，分别取20 μL于石墨炉原子吸收分光光度计测定吸光度值A，以信噪比S/N为3∶1时对应的铂标准溶液浓度作为此分析方法的检测限(LOD)，以信噪比S/N为10∶1时对应的铂标准溶液浓度作为此分析方法的定量限(LOQ)。
2.6 血浆中铂含量的测定 SPF雄性大鼠10只，随机分成两组。一组为氯化钠注射液对照组，另一组为顺铂实验组。采用尾静脉注射给药，给药剂量10
mg·kg-1。给药前禁食12 h，实验过程中自由饮水。给药后取血时间点为5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，眼眶取血后，于低温下8 000 rpm离心5 min分离血浆，4 ℃冰箱中保存。准确吸取上清液适量，80 ℃浓硝酸消解30 min，用超纯水稀释定容至10 mL容量瓶中，取20 μL于石墨炉原子吸收分光光度计测定其吸光度，代入标准曲线求出铂溶液浓度，并计算上清液铂含量。 3 结果
3.1 仪器条件 石墨炉升温程序的最佳参数选择：干燥程序设置为两步，第一步干燥温度为100 ℃，升温速率为2 ℃·s-1，干燥时间为20 s；第二步干燥温度上升为150 ℃，升温速率为15 ℃·s-1，干燥时间30 s，通过设定分步干燥，逐步调整升温速度，可以有效防止干燥过程中干燥速度过快带来的溶液起泡及损失，保证测定的精密度和可靠性。灰化过程和原子化过程是石墨炉升温程序的关键步骤，实验证明1 500 ℃的灰化温度和2 700 ℃原子化温度较为合适；净化过程参数设置温度略高于原子化温度，时间宜短，以2 800 ℃/3 s为宜。在上述原子吸收光谱仪的工作条件下，空白血浆的吸光值与3%硝酸稀释液的吸光值一致，显示血浆中
其他物质对铂元素检测无干扰，方法专属性良好。
3.2 标准曲线 以吸光度A对铂标准溶液浓度C(ng·mL-1)进行线性回归，得到标准曲线，如图1所示回归方程为A=0.002 49C+0.007 2(R2=0.999 7)，在0～200 ng·mL-1范围内线性良好，符合定量分析要求。 图1 用石墨炉原子吸收光谱法测定铂的标准曲线
3.3 准确度 回收率结果如表2所示，平均回收率在97%～101%范围内，符合方法学要求。
表2 铂的回收率(n=3)浓度/ng·mL-1回收率/%RSD/%4097.133.7512097.881.89200100.132.19
3.4 精密度 同一工作日，配制3份不同浓度样品溶液：40、80、160 ng·mL-1铂标准液，用随行标曲分别计算。日内精密度和日间精密度结果如表3所示。高、中、低3浓度的日内RSD分别为5.39%、2.96%、1.94%；日间RSD分别为5.72%、4.82%、2.40%。
表3 铂的日内和日间精密度浓度/ng·mL-1日间(n=5)日内(n=3)均值±SDRSD/%均值
±SDRSD/%4034.67±1.875.3934.34±1.965.728072.53±2.142.9676.20±3.674.82160148.43±2.881.94147.76±3.542.40
3.5 检测限和定量限考察 分别以信噪比S/N=3和S/N=10时对应的浓度为检测限和定量限，测得本系统条件下检测限为1.93 ng·mL-1，定量限为6.14 ng·mL-1由于顺铂在血浆中蛋白结合率高，游离药物浓度较低，石墨炉原子吸收法的高灵敏度优于其他常见方法。
3.6 血浆中铂含量测定 按照给药方案中的取样时间点采集大鼠血浆后，低温下，8 000 rpm离心取上清，浓硝酸消解，使得铂离子游离后，用石墨炉原子吸收光谱仪测定相应时间点下血浆中的铂含量，并记录吸光度值A，运用DAS 2.0药动
软件计算药动学参数，血药浓度随时间变化率如图2所示，随着取样时间的延长，血浆中铂含量呈现下降趋势。对大鼠尾静脉注射给药顺铂后，测得药动学参数如表4所示，其中Tmax为5 min，T1/2为(5.83±1.77)h，MRT0-t为(5.59±1.15)h，表明顺铂在大鼠体内5 min达到峰浓度后迅速消除，在体内滞留时间很短，与文献报道一致。
图2 单次静脉注射CDDP(10 mg·kg-1)后大鼠血浆中铂浓度的药时曲线(平均值±SD，n=5)表4 单次静脉注射10 mg·kg-1CDDP后的药代动力学参数 (n=5) 参数单位CDDPCmaxmg·L-114.62±3.91Tmaxh0.083T1/2h5.83±1.77AUC0-th·mg·L-137.41±15.80AUC0-infh·mg·L-143.30±19.25CLL·h-10.28±0.16MRT0-th5.59±1.15VssL·kg-12.07±0.43 4 讨论和总结
通过上述方法学验证结果，可以看出在100 ℃和150 ℃两种温度下分步干燥，灰化温度1 500 ℃，时间30 s，升温速率150 ℃·s-1，原子化温度为2 700 ℃，净化温度2 800 ℃的条件下，石墨炉原子吸收测定铂标准曲线线性良好，检出限低，能够满足血浆中铂含量测定的要求。因此，用石墨炉原子吸收法测定血浆中铂含量的方法操作简便、准确可靠、灵敏度高。此外，也表明用石墨炉原子吸收测定血浆中铂含量的方法可以推广到其他铂类药物的血药浓度的测定，为临床上其他铂类药物的药动学研究提供参考。 参考文献：
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