肉品安全与检测．◆． 由凌工业 ＭＥＡＴ ＩＮＤＵ Ｙ ２０１７年第２期 总第４３０期 ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ检测猪肉中３种 大环内酯类药物残留量 李烈飞 岑海容 汤祝华 余欢欢 １．海南省食品药品检验所三亚分所 海南三亚５７２０００ ２．海南省食品药品检验所琼海分所海南琼海５７１４００ ３．海南省食品检验检测中心 海南海口５７０１００ 摘要建立了瘦猪肉中大环内酯类抗生素红霉素、替米考星、林可霉素的超高效液相色谱一串联质谱／质谱 检测方法。猪肉样品经０．１％甲酸乙腈水（８０：２０）溶液提取、Ｏａｓｉｓ ＰＲＩＭＥ ＨＬＢ固相萃取小柱通过式净化、反相液 相色谱分离后进行质谱分析，在电喷雾正离子（ＥＳＩ ）模式，多反应监测（ＭＲＭ）下进行特征母、子离子对信号采集。 根据保留时间和母离子及两个特征子离子信息进行定性分析，以基峰离子进行定量。结果表明：红霉素、替米考 星、林可霉素在１．０～２０ Ｌ浓度范围内线性关系良好，相关系数（ｒ２）均大于０．９９，空白样品加标回收率范围为 ７３．６％～１０３．６％。相对标准偏差小于１０．Ｏ％。红霉素、替米考星、林可霉素（目标化合物）方法检出限（ＬＯＤ）为１．０ｗｅ＇ｋｓ。 该方法操作简便、准确、灵敏、重现性好、基质干扰少，适用于瘦猪肉中红霉素、替米考星、林可霉素的测定。 关键词大环内酯类药物ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ红霉素替米考星林可霉素 Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｐｏｒｋ ｂｙ ＵＰＬＣ——ＭＳ／ＭＳ Ｌ／Ｌｉｅｆｅｉ，ＣＥＮＨａｉｒｏｎｇ，ＴＡＮＧ Ｚｈｕｈｕａ，ＹＵＨｕａｎｈｕａｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ａｎ ｕｌｔｒａ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ——ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃ—・ ｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ｔｉｌｍｉｃｏｓｉｎ ａｎｄ ｌｉｎｃｏｍｙ— ｃｉｎ ｏｆ ｍａｅｒｏｌｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ｌｅａｎ ｐｏｒｋ．Ｐｏｒｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．１％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ａｅｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（８０：２０）．Ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｏａｓｉｓ ＰＲＩＭＥ ＨＬＢ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ ａｎｄ ｓｅｐ－ ａｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｖｅｒｓｅｄ—ｐｈａｓｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅ— ｔｒｙ．Ｕｎｄｅｒ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＥＳＩ ）ｍｏｄｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＭＲＭ），ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌｓ ｏｆ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｐａｒｅｎｔ ｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｕｂ—ｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅ－ ｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔ ｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｓｕｂ—ｉｏｎｓ，ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｐｅａｋ ｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｅｒｙｔｈ— ｒｏｍｙｃｉｎ，ｔｉｌｍｉｃｏｓｉｎ ａｎｄ ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ ｉｎ １．０—２０ １ｘｇ／Ｌ ｈａｄ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ＣＯ— ｅｆｉｃｉｆｅｎｔ（ｒ ）ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ０．９９，ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ７３．６％～１０３．６％，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １０％．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ（ＬＯＤ）ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ｔｉｌｍｉｃｏｓｉｎ ａｎｄ ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ（ｔａｒｇｅｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）ｗａｓ １．０ ｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｅｉｎ，ｔｉｌｍｉｃｏｓｉｎ ａｎｄ ｌｉｎｃｏｍｙｃｉｎ ｉｎ ｌｅａｎ ｐｏｒｋ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ；ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ；ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ；ｔｉｌｍｉｃｏｓｉｎ；ｌｉｎｅｏｍｙｅｉｎ ｋｇ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｌｅｓｓ ｍａｔｒｉｘ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉ— 大环内酯类抗生素（ＭＡＬｓ）属中谱抗生素，对革 兰氏阳性菌和支原体具有突出的抗菌活性，临床上 主要用于治疗敏感菌引起的呼吸道、消化道和泌尿 生殖系统感染…．已广泛用于畜禽细菌性和支原体 ２０１７年第２期 总第４３０期 由痍工业 ＭＥＡＴ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ．．．肉品安全与检测．：． 感染的化学治疗，在低剂量下具有良好的促生长作 贮备溶液至１００ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀释至刻度， 一用。食品中的大环内酯类抗生素残留易引起过敏和 携带耐药因子菌株的扩散。我国２００２年农业部公 １８￣（２避光保存。 精密吸取浓度约为１０ｍｇ／Ｌ混合标准贮备溶液 １．４．３混合标准工作溶液（约１００１ｘｇ／Ｌ） 告第２３５号规定．红霉素在动物组织中的最大残留 限量（ＭＲＬ）为２００１￣ｇ／ｋｇ；林可霉素在动物组织中 ＭＲＬ为１００ｌｘｇ／ｋｇ；替米考星在动物组织中ＭＲＬ为 １００ｔｘｇ／ｋｇ［ 。 １ｍＬ于ｌＯＯｍＬ的容量瓶中。用甲醇稀释并定容至刻 度．一１８℃避光保存。 １．４．４基质标准工作液 目前国内外对大环内酯类抗生素残留的检测方 法主要有微生物法［１］，光学生物传感器法＿３］，薄膜色 分别吸取１０．０、２０．０、５０．０、８０．０、１００．０、 ２００．０１ｘＬ混合标准工作溶液（１．４．３），用样品空白提 谱法 ，气相色谱法 ．液相色谱法 。 以及液质联 用技术［ 挖］。 本文采用超高效液相色谱一串联质谱法（ＵＰＬＣ— ＭＳ／ＭＳ）。建立了瘦猪肉中大环内酯类抗生素红霉素 （ＥＲＭ）、替米考星（ＴＩＬ）、林可霉素（ＬＩＮ），简便、快 速、高效的检测方法。 取液定容至１．ＯｍＬ，配成１．０、２．０、５．０、８．０、１０、 ２０￣ｇ／Ｌ浓度系列基质标准工作溶液。用前配制。 １．５样品处理 １．５．１提取 称取２．５ｇ样品至５０ｍＬ塑料离心管。加入一定 浓度的标准品，再加入１０ｍＬ０．１％甲酸乙腈水，漩涡 混匀３０ｓ，超声３０ｍｉｎ。在１０ ０００ｒ／ｍｉｎ下离心６ｍｉｎ １材料与方法 １．１实验材料 后，将上清液移人另一离心管中，加入约３０ｐ￣Ｌ氨水， 使ｐＨ值范围在６～８之间。 １．５．２净化 市售新鲜瘦猪肉。 １．２仪器设备 Ｏａｓｉｓ ＰＲＩＭＥ ＨＬＢ小柱（３ｃｃ，６ｍｇ）安装在预先 准备的真空提取装置上，不需要进行活化和平衡，取 １ｍＬ上清液通过Ｏａｓｉｓ ＰＲＩＭＥ ＨＬＢ小柱并收集滤 Ｗａｔｅｒｓ Ｖｅｖｏ ＴＱ—Ｓ超高效液相色谱一串联质谱 仪、ＩＫＡ ＭＳ３ ｉｇｉｔａｌ漩涡混合器、Ｈｏｒｉｚｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ氮 吹仪、梅特勒ＰＨ调节计、ＳＩＧＭＡ ３—３０ｋ台式冷冻离 心机、梅特勒万分之一精密天平、ＰＲＩＭＥ Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ 固相萃取柱（６０ｍｇ，３ｍＬ）。 １．３主要试剂及标准物质 液，氮气吹干，用ｌｍＬ甲醇复溶，过０．２２１ｘｍ滤膜，供 液相色谱一串联质谱仪测定。 １．６仪器条件 １．６．１高效液相条件 甲醇（色谱级）、氨水（色谱级）、甲酸（色谱级）、 乙腈（色谱级）。 标准物质：红霉素标准品，批号４０５２８，来源 于ＬＧＣ： 色谱住为ＡｃＱｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｃ１８，１．７ｔｕｎ，２．１×１００ｒａｍ； 柱温为４０￣Ｃ；流速为０．３ｍＬ／ｍｉｎ；进样量５１ｘＬ；流动 相Ａ乙腈。流动相Ｂ ０．１％甲酸水。梯度洗脱程序见 表１ 表１梯度洗脱条件 林可霉素标准品，批号３１１２０，来源于ＬＧＣ； 替米考星标准品，批号１３０４３２—２０１５１０，来源于 中国食品药品检定研究院。 １．４标准溶液的配制 １．４．１标准贮备溶液 准确称取１０．Ｏｍｇ的红霉素、林可霉素、替米考 星标准品，用甲醇分别配制成约１ ０００ｍｇ／Ｌ的标准 贮备液．保存于一１８￣Ｃ冰箱内。 １．４．２混合标准贮备溶液（约ｌＯｍｇ／Ｌ） １．６．２质谱条件 电离方式：电喷雾电离（ＥＳＩ ）。 扫描方式：多反应监测（ＭＲＭ）。 分别吸取１ ｍＬ红霉素、林可霉索、替米考星标准 ．．．肉品安全与检测．．． 毛细管电压：０．５０ＫＶ。 离子源温度：１５０。Ｃ。 由凌工业 ＭＥＡＴ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ２０１７年第２期 总第４３０期 进样６次，结果见表３。 表３精密度试验结果 脱溶剂温度：５００ｃＣ。 碰撞气流量：１５０ｍＬ／ｍｉｎ。 脱溶剂气流量：１ ０００Ｌ／ｈ。 被测物名称、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞电 压、离子丰度比见表２；提取的离子色谱图见图１。 表２被测物名称、母离子、子离子、锥孔电压、 碰撞电压、离子丰度比 被测物名称母离子 子离子 锥孔电压／ｖ碰撞电压／Ｖ离子丰度比 从以上结果可以看出３种物质的相对标准偏差 均小于２．０％，精密度良好。 ２．２线性范围 ２．２．１ 溶剂曲线 分别精密吸取混合标准工作溶液．制成混合外 标浓度为１．０．２．０，５．０、８．０、１０．０、２０．０ｔｘｇ／Ｌ系列标 准曲线，供液相色谱串联质谱测定，结果见表４。 定量离子／定性离子 表４线性关系试验结果 从以上图谱中可以看出三种外标的线性范围在 ０．１—２０１￣ｇ／Ｌ内，峰面积与相应浓度呈良好的线性 关系，相关系数（ｒ ）均大于０．９９。红霉素的检出限 为０．２ ｋｇ，替米考星的检出限为０．Ｏ８ｗｇ／ｋｇ，林可 霉素的检出限为０．４１ｘｇ／ｋｇ，均小于标准方法检出限 １．０ｔｘｇ／ｋｇ，能满足实验要求。 ２．２．２基质曲线 称取６个阴性样品经过提取、净化、氮吹定容后 获得样品空白提取液，分别吸取混合标准工作溶液， 用样品空白提取液定容．配成混合外标浓度为１．０、 ２．０、５．０、８．０、１０．０、２０．０１￣ｇ／Ｌ系列标准曲线，供液 相色谱串联质谱测定。 基质实验的线性范围在１．０～２０１￣ｇ／Ｌ内。峰面 积与相应回收浓度呈现良好的线性关系。且峰型良 好，相关系数（ｒ ）均大于０．９９，基本符合实验要求。 ０．５０ １．００ １．５０ ２．３ 回收率 图１提取的离子色谱图 用空白基质样品进行２．０、５．０、１０．０￣ｇ／Ｌ ３个 ２方法验证 ２．１精密度 水平的添加回收实验，每个水平取６个平行样，以下 按１．５中１．５．１的提取方法进行操作，供液相色谱 串联质谱测定。其平均回收率和相对标准偏差结果 见表５。 重复将浓度为５．０ｎｇ／ｍＬ的３种混合标准溶液 ２０１７年第２期 总第４３０期 由凌，业 ＭＥＡＴ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ．：．肉品安全与检测夸 表５ ３种大环内酯类药物的平均回收率及相对标准偏差 ＰＲＩＭＥ ＨＬＢ柱净化样品能有效去除磷脂等非极性干 扰物 ¨ ，且回收率相对较高。综合考虑了这３种净 化柱的选择。最终选择采用Ｏａｓｉｓ ＰＲＩＭＥ ＨＬＢ柱来 进行实验净化。 ４ 结论 说明本方法对猪肉中３种化合物的提取是稳定 的，受到基质的干扰是比较小的。 本方法前处理操作简便、精密度和准确度较高， 分析时间短、净化效果好，可对猪肉中大环内酯类抗 生素在定性测定的同时进行定量测定。 ３实验条件的优化 参考文献 ３．１提取溶液的选择 实验分别采用乙腈水、０．１％甲酸乙腈水、０．２％ 甲酸乙腈、０．５％甲酸乙腈水来提取同一浓度的目标 化合物的对照溶液，供ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ测定，根据结 １李俊锁，邱月明，王超等．兽药残留分析［Ｍ］．上海：上海 科学技术出版社。２００２． ２ 中华人民共和国农业部．中华人民共和国农业部２３５号 公告［Ｂ］．２００２． ３ Ｇ￣ｄｏｗ Ｍ．，ｓｔｅａｄ ＳＬ．，Ｄａｙ Ｊ．，ｅｔ ａ１．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ ｃｈｅｍ， 果发现．经０．１％甲酸乙腈水提取的目标化合物回收 率最好，过酸会造成红霉素降解，但适当的酸化会对 提取目标化合物有促进作用，可能加入甲酸有助于 待测液的电离。因此，本实验采用１．０％甲酸乙腈水 ２００５，５３（１９）：７３６７ ４ Ｐｅｔｚ Ｍ．，Ｓｏｌｔｙ Ｒ．，Ｌｙｍｂｕｍ Ｍ．，ｅｔ ａ１．Ｊ．ＡＯＡＣ，１９８７， （３７）：１０５ ５ Ｂａｒｂｉｅｒｓ ＡＲ，Ｎｅｆｆ ａ ｗ，Ｊ．ＡＯＡＣ，１９７６，５９：８４９ ６ Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ ＣＤＣ．，Ｒｉｇｂｙ ＣＥ．，Ｃｈａｎ Ｗ．Ｊ．．ａｇｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． １９８９，３７：１０５ ７ Ｔａｋａｙｓｕ￣Ｋ．，Ｓｕｚｋｍ Ｓ．，Ｓａｔｏ Ｎ．，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｔ，１９９８，１２３：１２７９ ８ Ｓｏｎｄｅ￣Ｐ，Ｄｅｌｅｐｉｎｅ Ｂ，Ｂｉｏ１．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏ．，１９９４，２３：３６９ 作为提取液。 ３．２定溶液的选择 实验采用的是电喷雾正离子（ＥＳＩ ）模式，定溶 液考虑６种，分别为（ａ）０．１％甲酸水：乙腈＝９：１、 （ｂ）２０％乙腈水、（ｃ）２０％甲醇水、（ｄ）甲醇、（ｅ）乙 ９ ＧＢ／Ｔ ２０７６２—２００６禽畜肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉 素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素、 腈、（ｆ）甲酸铵，根据测定结果得知，实验发现用（ａ） （ｂ）（ｄ）这３种定容液会使林可霉素分出两个峰，用 （ｅ）定容时，滤膜无法过滤，采用（ｃ）（ｄ），３种目标化 交沙霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法［ｓ］． １０ ＧＢ２９６８４—２０１３水产品中红霉素残留量的测定液相色 谱一串联质谱法［Ｓ］． １１王凤美，陈军辉，林黎明等．ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ法对动物源 性食品中１２种大环内酯类抗生素残留的测定［Ｊ］．分析 测试学报，２００９，２８（７）：７８４—７８８ 合物的峰型良好，且灵敏度高，但采用（ｄ）目标物质 的响应值大于用（ｃ）定溶液，可能是甲醇纯溶剂溶解 效果更好［１ 。因此。本次实验选择甲醇为定容液。 ３．３净化柱的选择 实验采用Ｏａｓｉｓ ＰＲＩＭＥ ＨＬＢ柱、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ柱、 １２许辉．王风美．汤志旭等．液相色谱一串联质谱法检测动 物源性食品中８种大环内脂类药物残留量．『会议论 文］．２０１１． ＭＣＸ固相萃取柱对待测液进行净化。在使用阳离 子交换柱ＭＣＸ时，需要条件ｐＨ值至酸性，而酸性条 １３徐锦忠，储晓刚，胡小钟等．液相色谱在线净化一电喷雾 串联质谱测定水产品中大环内酯和林可胺类药物残留 件下一些大环内酯药物如红霉素会分解＿１ 。实验 中比较了ＨＬＢ和ＭＣＸ固相萃取柱，ＨＬＢ柱上，所有 的大环内酯类药物的回收率都在７０％以上。而在阳 离子交换柱ＭＣＸ上，红霉素、替米考星、林可霉素回 收率不到４０％。而相对于Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ柱，Ｏａｓｉｓ ［Ｊ］．分析试验室，２００９，２８（１２）：２６—３０ １４黄德凤，Ｋｉｍ Ｖａｎ，Ｍｉｎｈａｅｌ Ｓ．Ｙｏｕｎｇ，Ｊｅｒｅｍｙ Ｃ．Ｓｈｉａ等．０ａ— ｓｉｓ ＰＲＩＭＥ ＨＬＢ—ＵＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ测定猪肉中７８种兽药 残留．Ｗａｔｅ￣应用纪要．２０１１． （收稿日期２０１６—１２—１９）