实验九 差示分光光度法测定维生素B1片的含量

一、实验目的

1．掌握差示分光光度法的基本原理。 2．熟悉标准曲线定量的操作方法。

二、实验原理

(一）差示分光光度法（简称△A法），它保留了通常的分光光度法简便、快捷、直接读数的优点，又无需事先分离，并能消除干扰。

方法：取两份相等的供试液，分别制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸或碱，改变pH或在其一中加能与供试品发生某种化学反应的试剂），然后将它们稀释至同样浓度后，分置于样品池和参比池中，于适当波长处，测定吸光度的差值(△A）。

应用条件:①供试品在不同的化学环境中以不同的分子形式存在,它们的吸收光谱有显著的差异；②干扰物的吸收不受测定时化学环境的影响，光谱行为不变。

定量依据:设x、y分别代表在两种不同的化学环境中供试品的存在形式，它们在测定波长处的吸光度以Ax 、Ay表示，背景和干扰的吸收度以AZ表示，AZ不受测定时化学环境改变的影响。根据吸光度加和性原则:

即在供试液的一定浓度范围内△A值与其浓度C呈线性关系，并消除了AZ的干扰，可用标准曲线法或对照法定量。

（二)维生素B1片的测定

维生素B1分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收,其紫外吸收随溶液pH的变化而

1%变化.在pH7的磷酸盐缓冲液中具有两个吸收峰，在232~233nm处,E1cm=345;在266nm1%1%处,E1=255。在pH2时，最大吸收在246nm处，Ecm1cm=425。可用于维生素B1片的差示分

光光度法的测定.

三、实验方法

（一）测定波长的选择

精密称取维生素B1100mg，用水溶解并稀释成100ml，精密量取2ml二份，分别用缓冲液(pH 7.0）和盐酸液(pH 2.0）稀释成100ml，以相应溶剂为空白，测定紫外吸收光谱。

再将前者放于参比池，后者放于样品池，绘制差示吸收光谱（见图11)。差示光谱图表明在247nm处有最大差示吸收值(△A)，确定247nm为测定波长。

（二）标准曲线绘制

精密称取干燥至恒重的维生素B1100mg，置100ml量瓶中， 用水溶解并稀释至刻度，摇匀,作为贮备液。精密量取1。0、1.5、 2.0、2.5、3.0ml贮备液各二份，分别置100ml量瓶中，一份用 缓冲液稀释至刻度；另一份用盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。取 上述五组浓度相同,pH不同的溶液，在247nm处分别测定差 示吸收值(△A).以浓度C为横坐标，以差示吸收值△A为纵坐 标绘制标准曲线或进行回归，求得回归方程和相关系数。

（三）样品测定

取本品20片，精密称定,研细。精密称取适量粉末（约相 当于维生素B1 50mg），置50ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻 度,摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml二份，分 别置100ml量瓶中，分别用缓冲液和盐酸液稀释至刻度，摇匀。 将前者置参比池中，后者置样品池中，在247nm波长处测定差 示吸收值。由标准曲线求得维生素B1，浓度，计算维生素Bl片的 标示量%。

本品含维生素Bl(C12H17ClN4OS·HCl)应为标示量的90。0%～110。0%.

四、注意事项

1．由于仪器波长可能存在差异，所给测定波长仅供参考,可照“测定波长的选择\"项下自行测定。

2．测定标准系列各细溶液的△A时，一定要遵循先稀后浓的原则，尽可能消除测定误差.

五、思考题

1．差示分光光度法的优点是什么？ 2．差示分光光度法是怎样消除干扰的？