酶标仪基本知识及其检测原理

2010-03-07 23:35:27 作者：佚名 来源：互联网 浏览次数：1 网友评论 0 条

酶标仪基本知识及其检测原理，文章简要介绍了酶标仪的原理和及应用。

光是电磁波，波长100nm-400nm称为紫外光，400nm-780nm之间的光可被人眼观察到，大子780nm称为红外光。人们只所以能够看到色彩，是为光照射到物上被物反射回来。绿色植物之所以是绿色，是

为植物吸收了光中的红色光谱。酶仪测定的原理是在特定波

长下，检测被测物的吸光值。

检测单位：

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量定量系。

检测单位用OD值表，OD是opticaldelnsity（光密度）的缩写，表被检测物吸收掉的光密度，OD=10g（1/trans），其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度下述

系：

E=OD=logⅠ0/Ⅰ其中E表被吸收的光密度，Ⅰ0为在检测物之前的光强度，Ⅰ为从被检测物出来的光强度。

OD值由下述公式计算：

E=OD=C×D×E

其中：C为检测物的浓度；D为检测物的厚度；E为摩尔子。

在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造检测结果的不准确。此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。

但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

Anthos酶仪检测值计算

仪器中的检测器接收透过被检测物的光能量，转换二进位数字信号，最大为4095.仪器定义没有光源下的透光值为0%，没有检测物的透光值为100%。则实际检测中，检测物的透光值均在0%一100%之间。

透光值的计算如下：

T=（Meas-Min）/（Max-Min）

其中T为透光值，Meas为检测的二进位数值，Min为在0%的情下检测的二进位数值，Max为在100%的情下检测的二进位数值，举例如下：

Anthos酶仪的中心定位

仪器会自动对酶孔进行中心定位，中心定位是消除酶孔底的凸凹引起的厚薄不均带来检测的不准确。在对每一个酶仪进行检测时，仪器其实进行35个点的测量，选取最中间的5个点的均值为本孔的OD值。

光源的参照通道

参照通道是用来校准由电压不稳或灯泡磨损带来的影响。

酶仪的用途和其它提

用ELISA试剂的测定，广泛用各种实验室，包括临床实验室。

质量控

质量控是试剂检测的重素。请按照试剂说明书的求进行质量控。

空白校正

有一些试剂盒的说阴书将空白孔设置为空气，其它大多数空白孔的设置是用试剂来设置的，请按照试剂盒的说明书求进行。

检测结果的解释

由有相当多的素会影响检测的结果，如不同的酶板，检测试剂的积，都会造OD值的不，此，只有使用同一酶板反应的试剂检测结果才能比较和分析。对结果的临床解释请依照试剂盒的说明书进行。

酶仪的使用注意事项

1、工作环境

酶仪是一种精密的光学仪器，此良好的工作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够延长其使用寿命。根据DINVDE0871条例，仪器应放置在无磁和干扰电压的位置。依据DIN45635-19条例：

仪器应放置在低40分贝的环境下。

为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。

操作时环境温度应在15℃-40℃之间，环境湿度在15%-85%之间。

操作电压应保持稳定。

操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。

保持干燥、干净、水的工作台面，以及足够的操作空间。

2、操作注意事项

酶仪的能是用来读取酶联免疫试剂盒的反应结果，此得到准确结果，试剂盒的使用必须规范。许多医院在使用酶仪之前是通过目测判断结果，操作过随意性较大，在使用酶仪后如果不能及时纠正操作习惯，会造较大误差。在酶仪的操作中应注意以下事项：

使用加液器加液，加液头不能混用。

洗板洗干净。如果条件允许，使用洗板机洗板，避免交叉污染。

严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。

在测量过中，请勿碰酶板，以防酶板传送时挤伤操作人员的手。

请勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完后请洗手。

如果使用的样品或试剂具有污染性、毒性和生物学危害，请严格按照试

剂盒的操作说明，以防对操作人员造损害。

如果仪器接触过污染性或传染性物品，请进行清洗和消毒。

不在测量过中闭电源。

对佳效果。

试剂盒问造的测量结果的偏差，应根据实际情及时修改参数，以达到最

使用后盖好防尘罩。

出技故障时应及时与厂联系，切勿擅自拆卸酶仪。

酶仪及洗板机选购指南

酶仪（MicroplateReader）是对酶联免疫检测（EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗上的酶催化显色底物进行的，反应结果以颜色显，通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断本中待测抗或抗原的浓度。

酶仪广泛地应用在临床检验、生物学研、农业科学、食品和环境科学中，特别在近几年中，由大量的酶联免疫检测试剂盒的应用，使得酶仪在生殖保健领域中应用越来越广泛，同时促进了生殖健康技水提。

目前国内许多计生站系统开了酶免检测项目，如：乙肝五项、爱滋病检测、优生优育系列检测、激素检测等。过去多数采用目测方法，报出的结果缺乏科学的依据。例如：某弓形虫检测试剂盒中，临界值规定为：阴性对照品的OD值×2.5,通过目测无法判断本孔的反应颜色是否超过临界值。肉眼进行两孔之间的颜色比较可能还行，但比较一孔的颜色是否超过另一孔颜色的2.5倍就不可能。

国内多权威机构，如卫生部临床检验中心和计生育系统等多次强调酶仪的重性，并求酶联免疫检测试剂应使用酶仪判读，酶免试剂的质控也应使用酶仪，并提供酶仪测定的原始数据，而各厂的试剂盒说明书没有是让用目测的。同时酶免检测的项目往往是一些实质性的感染和病变（如：肝炎、爱滋病、优生优育等），判读更求严谨，由误诊引起的纠纷很难处理。另外，住院手病人前的丙肝、爱滋等EIA试剂检测是避免输血引起感染引发的医疗事故纠纷的必手段，正逐渐被许多单位所采用。

我国免疫诊断方法如下：

有如下三种：酶免（EIA）、放免（RIA）和发光，在市上的情

各种方法所处市周期：放免衰退期，酶免长期，发光进入期。

放免技由试剂的污染和有效期等问在国际和国内市逐渐被淘汰，而化学发光试剂和设备比较昂贵，使得其在国内的普及特别在计生系统普及需较长时间，EIA技稳定，试剂价格合理，供应充，酶免技在中国市处

长期，此购买酶仪正合适宜。

尤其提到的是，在中国的计生育和妇幼保健系统配备酶仪已经迫在眉睫。早在几年以前，世界卫生组织已建议对孕妇进行TORCH五项常规筛查，但是遗憾的是由缺乏酶仪和洗板机等设备，RCH的检测在中国还未能普遍开。TORCH感染在围产医学中称为TORCH综合症，由孕妇，胎儿和新生儿都易被感染，它已受到全世界妇产科和儿科的极大重视。

妊娠期感染不仅危害母，往往还可对胎儿和新生儿产生严重影响。通过胎盘可引起子宫内感染而导致流产、早产、死胎或胎儿生长迟缓和畸形，通过产道和母乳可引起新生儿感染。如累及神经系统可造不同度的智力障碍以及各种瘫痪、失聪ORCH感染与优生优育有极为重的系。此，RCH（IgG和IgM）检查通常也称为优生优育十项检查。目前，

TORCH的检测方法有放免（RIA）和酶免（EIA）。由放免方法需特殊仪器，且有放

射危害，目前正被酶免（EIA）方法取代。EIA方法具有特异性强，灵敏度，简单快速，本低等优点，只配备有酶仪和其他相应的设备，多数普通实验室均可方便地开。很显然，尽快在计生系统普及酶仪等设备是一个迫切的需求。

这项工作的落实将有助提诊治水，降低母婴发病率，从而提整个国民的健康素质。目前市上提供的EIA试剂越来越多，如：T3、T4、TSH、TORCH系列、不孕系列、各种癌症志物、伤寒、副伤寒等，另外通过母婴传播的性传播疾病（如淋病、梅毒、HIV）和肝炎（如HBV、HCV），以及胎儿的抗，新生儿TSH的测定，疫苗反应等，市上也都有套EIA试剂盒供应。使用酶仪有利拓检测项目，提检测水，其社会效益和经济效益并举。

酶仪的使用方法

作为微孔板比色计的酶仪，其基本能不外乎一个比色测定，所不同的是在测定波长范围、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板能、温度控、定性和定量测定软件能等方面的差异，当然全自动酶免疫分析系统还具有自动洗板、温育、加样等能。在临床实验室实际工作中，实验人员在使用酶仪进行测定操作时，有时难免会对酶仪的一些性能指产生迷惑，甚至对酶仪的应用产生错误的理解。如诸如使用酶仪较用肉眼观察测定的阳性率明显增加这样的问。

一、测定波长 一般酶仪的测定波长在400~750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA的显色测定。目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的记用酶均为辣根过氧化物酶（HRP），底物通常为四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD），其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为2,2,-二氨基偶氮苯（DAB）和联苯醌。当pH值为5.0左右时，

DAB在450nm波长处有最大吸收，当pH值降为L 0时，最大吸收波长移至492 nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深，而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H:O:和TMB过量时，则形蓝色的阳离子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min.此，450nm和492 nm两个波长是目前ELISA测定最常用的。各种酶仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装6~8片滤光片，所配备的滤光片均应包括上述两个波长，有的酶仪以490nm滤光片替代492nm滤光片，影响不大。除了这两个基本滤光片外，考虑到双波长比色的需，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，其他滤光片可根据自的需选择。有时，有的实验室希望用酶仪作微量生化测定，故酶仪生产厂对其生产的酶仪扩了紫外检测能，此时需一个340nm波长滤光片。此时，酶仪的测定波长范围就为340-750nm或800nm。

酶仪有单波长和双波长检测能有时使用者不知在什么情下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630 nm进行测定，酶仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630 nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。

二、测定的吸光度范围

通常，酶仪的吸光度测定范围在。0-2.5之间即可以满足ELISA的测定求。早期的酶仪可测定的吸光度一般在0-2.5之间，但在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2的吸光度测定范围为0-3.5，而Multiskan Ascent的吸光度测定范围（Abs）达0-4.0，在0-4.0范围，线

性误差不超过±2.0%，在0.3-3.0吸光度范围内，测定精密度CV小±0.2%；3.0-4.0 Abs范围内，测定精密度CV小的吸光度范围，

士0.2%。此，对酶仪的吸光度范围不必去刻意追求大

看在一定的吸光度范围内的线性和精密度如何。

三、光学系统

酶仪的光学系统采用的是垂直光路多通道（通常为8或12通道，亦有单通道）检测，一般为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的酶仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。酶仪的光学系统能如何，均可通过酶仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等

出来。光学系统好的话，则上述指也应较佳。测定的精密度与测定通道

之间的均一性有直接系。单通道可避免通道不同所致的差异。

四、检测速度

酶仪的检测速度是指其完比色测定所需的时间。检测速度快，有利提检测的精密度，即避免由测定过中，测定时间不同所致的各微孔间吸光度间的差异。目前市上常见的酶仪检测速度都非常快，通常在数秒钟内，如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2和MK-3检测96孔只需2s（连续模式）或5s（步进模式）。Multiskan Ascent为单通道检测，亦只需9s（连续模式）或14s（步进模式）。又如BioRad公司的Benchmark的检测速度单波长为7s，双波长为15s。

五、震板能

酶仪的震板能是指酶仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行振荡混匀，使板孔内颜色均一。目前市上常见的酶仪均有震板能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋转等方式及振荡幅度等任意调，如Labsystems的MK-2；有的则较为固定，

如BioRad 550。使用有震板能的酶仪，在进行ELISA测定显色反应完加入终止剂后，可不必振荡混匀，直接放人酶仪上测定即可。

六、温育能

温育能是指酶仪本身能按求自动精确地控仪器内部的温度，使得ELISA测定中微孔板条的温育过可在仪器内部完，而无需再外配温箱。目前，只有少部分酶仪具有此种能，如Labsystems公司的Multiskan Ascent，BioRad公司的Benchmark和Biotek公司的ElxS08等。温育能只是酶仪的一个附加能，是否具有并不能说明酶仪档次的低及仪器的优劣。作为实验室是否选择，则可根据自实验室的条件及需来决定。

七、软件能

软件能是指酶仪所具有的对ELISA定性和定量测定及其他测定方式如酶动力学、紫外和凝集等数据的统计分析并报结果的能。软件能是中档酶仪的一个非常重的能。如果硬件方面区别不大，则软件就为判定酶仪优劣的惟一指。对用户来说，好的软件能，对实际工作会有较大的帮助。ELISA定性测定，酶仪如具有阳性判断值（cut-off）及其测定“灰区”（即指测定吸光度处cut-off周围的一定区域，此区域内结果应为“可疑”）的统计计算能，不但方便了实验室工作人员，而且在某些特定的情下，有很的实用价值。如血站实验室为筛检献血员血进行HBsAg、抗HCV和抗HIV等的ELISA测定时，常会遇到测定吸光度处cut-off附近但又低

cut-off的血，按照试剂盒的准，

可判为阴性，血为合格血，可用患者输血，但直觉诉我们，这样的血如输给患者，导致输血后相应疾病发生的可能性较大，这是由ELISA有的测定技的不确定性所造的，也就是ELISA测定的“灰区”的存在使得ELISA测定试剂盒cut-off的设定只是相对的准确，此时的假阳性和假阴性出的可能性较低。此，在血站筛检献血员血时，如以测定“灰区”

的下限作为判断献血员血筛检不合格准，就可以避免“灰区”所致结果判断错误而引起输血后疾病发生的可能性。合适的软件能对ELISA定量测定同样很重。有研表明，四参数方能较好地反映免疫测定的剂量反应曲线，最为适合定量酶免疫测定的曲线拟合。此，如目的是定量测定，则在酶仪的软件能中，最好有这种曲线回归方计算分析能。其他诸如连点、直线等回归计算，则可根据酶仪的应用目的而定，如兼用微量生化测定，则此类回归计算就很有必。

此外，酶仪兼做酶动力学、凝集反应测定所需的软件是否应具备，当然也应根据使用目的而定。由此类软件一般都较为昂贵，酶仪常另外单独按需配备，如果不是实验室特殊需，就不必强求这种软件能。

八、语言界面

通常进口的中档酶仪人机对话多采用英文。这对某些基层实验室可能会存在语言方面的困难，从而难以最大限度地发挥酶仪的作用。为解决这方面的问，已有一些酶仪采用了中文界面，如Labsystems的MK-3。这样就大大方便了广大基层实验室技人员的使用。

综上所述，尽管酶仪的发极为快速，种类繁多，能也不断加强，但其最根本的用是不变的，即比色测定。大凡比色测定，其基本求就是在一定吸光度范围内有好的测定准确性、线性和精密性。同样的吸光度范围，测定的准确性、线性和精密性越好则酶仪亦越佳。

而且，由用酶仪比色测定的为多孔（通常为96孔）微孔板条，为保证测定的孔

间重复性，则测定速度也是一个较重的性能指。至其他如震板、温育及有的软件能，则可根据各自实验室的需去比较选择。

Western Blot详解

2010-03-07 23:16:12 作者： 来源：互联网 浏览次数：2 网友评论 0 条

Western Blot详解，Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗作为一抗进行检测，对新基的表达产物，可通过融合部分的抗检测。

本文通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技:

一、原理

二、 分类

i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色

三、 试剂

四、 步骤

五、 实验常见的问指南 1.参考书推荐

2.针对样品的常见问 3.抗

4.滤纸、胶和膜的问 5.Marker的相疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析

一、 原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗，“显色”用记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载以非共价形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗起免疫反应，再与酶或同位素记的第二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基表达的蛋白分。该技也广泛应用检测蛋白水的表达。

二、分类

常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，同水和实验条件的是用第一种方

法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只买

的试剂盒就行，操作也比较简单，

原理如下（二抗用HRP记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

三、试剂

1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利溶解双丙稀酰胺)的去离子水配含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至 100ml。)储棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配。如有沉淀，可以过滤。

2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配，室温保存。

3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCl (pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/L HCl 混合，加水稀释到100ml终积。过滤后40℃保存。

4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/L Tris-HCl (pH6.8):6.05gTris溶40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCl调至pH6.8加水稀释到100ml终积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱备，再用HCL调PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配数ml，临用前配

.

6、 SDS- PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。

8、 转移缓冲液：配1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。

9、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即丽春红S使用液。使用后应予以废弃。

10、 脱脂奶粉5%(w/v)。

11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶磷酸缓冲盐溶液(PBS)。

12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCl(pH7.5)，500mmol/LnaCl。

13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

14、 过氧化物酶记的第二抗。

15、 NBT(溶70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

16、 BCIP(溶100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

17、 100mmol/LTris-HCl(pH9.5)。

18、 100mmol/L NaCl。

19、 50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，5mmol/L EDTA。（可以参看分子克隆）

四、步骤

生物秀为您搜集了阶段几乎网上所有的Western Blot的中英文资料，仅供实验参考，可以根据自实验的实际情进行调整：Western Blot PROTOCOL;

五、 实验常见的问指南

根据问的类型分以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）;

1. 参考书推荐

A. 对初学者看什么资料比较好？

解答：《抗技实验指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。

2. 针对样品的常见问

B. 做线粒膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写Western Blot），提取线粒后冻存（未加蛋白酶抑剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原？蛋白酶抑剂单加PMSF行吗？

解答：怀疑是样品问，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑剂。同时，建议检查Western Blot过， 提一抗浓度。对MSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑剂。

加蛋白酶抑剂来说，一般加P

C. 同一蛋白样品能同时进行两种子的Western Blot检测吗？

解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

D. 如果目蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需注意什么？

解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就温和得多，这时最好加上NaF去抑磷酸化酶的活性。

E 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？

解答：你可以加大上样量，没有问，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。

F. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？

解答：260kd的蛋白不好做， 分离胶用6％， Stacking Gel 3.5％。

G. 如果上样量超载，用什么方法来增加上样量？如果需加大上样量使原来弱的条带能看清楚。

解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的 comb。

H. 蛋白变性后可以存放多久？

解答：－80℃，一两年没有问。最化掉(也是被酶水解了)。

两条：不被蛋白酶水解掉；不被细菌消

I. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？

解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

J. 接下来我准备采用DAB显色技，二抗是生物素化的多克隆抗，三抗是亲和素生物素系，不知采用这样的方案后，封闭液是否作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生，是吗？

解答：不能使用脱脂奶粉，为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点．

K. 还有一问，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有系吗？

解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有

系，也与显色时间长短有

。开始摸条件时，为了拿到阳性结

果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。拿到好的结果，如果抗好的话比较容易，抗不好的话就需反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。

L. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？

解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需注意抑蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋白酶抑剂 cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗，使用BSA也是不错的选择。

M. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western注意什么呢？

解答：做200kd蛋白的Western Blot时注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时小心；转移时间需相应延长；做分子量参照（否则出杂带不知道如何分析）。

N. 有什么方法可以提上样量？

解答：可以浓缩样品；增大上样积来增大上样量。

O. 我检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？

解答：如是需提取膜蛋白，（而不是只需提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非只提取膜蛋白就用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。

P. 蛋白的上样量有没有什么具的求？

解答：上样量根据实验的求来定， 如果求是定量和半定量的Western Blot 则上样量均等， 如果只是定性，则没有太大的系， 尽量多上就行了， 但是不超过0.3μg/mm。

2

Q. 一抗，二抗的比例是否重？

解答：比较重，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

3. 抗

R. 做细胞信号传导，做磷酸化某子Western Blot，其二抗有何求？

解答：对二抗无求，看你实验条件来选择，一般推荐用HRP记的二抗。

S. 同一公司的另外抗用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就四天才看的到结果了。

解答：不同抗，即使是同一公司的抗，其最佳的抗稀释度也是不一样的，需你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至具的转膜时间，还看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短 Western Blot时间的话，可以增一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗说明书。至一抗和二抗得稀释度，你可以一抗 1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会省你的时间！

T. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗吗？

解答：免疫组化时抗识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属构型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含

有；构型表位由受蛋白空间结构限，煮后变性会消失。如果你所用的抗识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗可同时用免疫组化和Western，而如果抗识别构形表位，则只能用免疫组化。一般抗说明书上都有注明此种抗识别的氨基酸区间。（限单抗）

U. Western Blot 中抗的重复应用问

解答：抗工作溶液一般不张储存反复使用，但是如抗比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

4. 滤纸、胶和膜的问

V. NC膜\\ PVDF膜\\ 尼龙膜怎样鉴别？

解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介二者之间。就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm，对200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm。就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐温，特别适合蛋白印迹。就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。就重复性而言：尼龙膜可反复用分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。

22

2

W. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？

解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

X. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？

解答：可以。

AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好不是很好，为什么？

解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？

解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。

CC. 采用tank system有什么讲？

解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如 28V 14－16hrs。

DD. 做HSP WESTEN定量，同样的抗免疫组化能做出，而WESTEN却不能？

解答：这多半是抗的问，看抗的说明，是否能做Western Blot和IHC。

EE. 膜一般如何处理？

解答：一般用甲醇泡泡就可以了。

FF. 如果是6×8转印膜，加多少一抗？

解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育积一般最少为3－5ml。

GG. 上下槽缓冲液有何求，怎样才能达到最佳效果。

解答：无求。

HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原呢？是有的分不对吗？

解答：没什么问，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问，你可以重新配一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问麻烦。脱色液中甲醇的含量太也会造胶缩。

II. 膜、滤纸、胶大小有何讲？

解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。

JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge， 湿转36V ， 3－5hrs就可以了， 可以根据你实验室的经验调；170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs。

KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？

解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技手册》)，为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提转移电压／电流；增加转移时间。

LL. 如何选择最合适的蛋白杂交膜？

解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技。选择质量上层、合乎求、方便适用的杂交膜是决定这项实验败的重环。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等素，我们量裁衣，从杂交膜的材质、孔和规格上都做出合理的选择。

硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而亲和力的结合在一起，虽然这其中的机还不是十分清楚，但由硝酸纤维素膜的这个特性，而且易封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔的硝酸纤维素膜。为随着膜孔的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔如果小0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小20kD的蛋白就用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的

。从膜的质地上来看，最重的指就是单位面积上

与膜的硝酸纤维素的纯度有，市上

能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力

有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。由 100%的纯度，而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需考虑的素。常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。

PVDF转移膜：PVDF是一种强度、耐腐蚀的物质，通常是用来造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用蛋白质的序列测定，为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然 PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜，但由它的稳定、耐腐蚀使它为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都

，

非常适合低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。

离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素

的 DEAE

阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些

其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转

移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研。这种0.45μm孔的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，还可以用核酸结合研。

还有一种离子交换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用氨基酸系列分析或微测序。

5. Marker的相疑问

MM. 我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

？怎

解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。

NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗（Anti-V5-HRP）。但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！

解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问可能还有其他的方面的问，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。

2、“前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。

3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗（Anti-V5-HRP）。”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照？你做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。

6. 染色的选择

OO. Western Blot哪种染色好？

解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到 1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。

（2）胶金，灵敏度，检测范围可到pg级，但染色比稳定。

（3）生物素化灵敏度位1、2之间，可用任何一种膜。

7. 参照的疑问

PP. 是否Western Blot实验半定量一定加ACTIN内参？

解答：对发表文章的实验最好加内参，实验严谨。

QQ. 用BANDSCAN分析结果行吗？

解答：分析一般的结果没问。

RR. 核内抗原Western Blot内参选择什么合适？

解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当内参，在网上查查就可以选出你的内参。

SS. 转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm，一般1小时左右？

2

解答：不是的， 半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。

TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot，内参B-actin，GAPDH，那个好？

解答：选用beta-actin就可以。

8. 缓冲液配方的常见问

UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？

解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris－HCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而。

VV. 准备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？

解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。

WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。

XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问。1、检测GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不！用的是 1:100。如果是一抗的原，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为 0.1%，不会是封闭液的问吧？

解答：可以在下面几个问上找找原。1. 封闭液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有问。

YY. 加甲醇的目的是什么？

解答：加甲醇起着一定的固定作用，为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。

ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？

解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 50

0ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.

AAA. 封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在我就在室温里做，或者在4度下?

解答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。

BBB. 实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鲜加入：65mM DTT 蛋白酶抑剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v) 是用抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用抽提细胞全蛋白（是否可行？

改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl， 50 mmol/L， pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%; 脱氧胆酸钠， 0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L; Leupeptin， 2 μg/ml)不知对膜蛋白效果如何？此外该方中的EDTA， 是否用做蛋白酶抑剂？

是想得到其中的膜蛋白）

解答：做2-D对不推荐使用NP-40（为即使进口的NP-40也不纯，，其中的杂质会影响质谱结果）。对动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，为7M尿素+2M硫脲+4%CHAPS构的变性环境已经足以抑大部分蛋白酶的活性，2M硫脲+4%CHAPS对抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基去垢剂的方法。EDTA用灭活金属蛋白酶（

是其鏊合作用）。加过多的蛋白酶抑剂可以导致蛋白质的修饰，做WB无所谓，

做MAILDI时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：提供连续的PH梯度，从很大度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除

一部分核酸)；也不推荐采用SDS，SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实在用，终浓度降到0.1%以下。

METHOD2

（50ml总量）：?-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至 50 ml。

方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。 该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。

METHOD3

1、beta-metaptoethanol 35μl

2、10%SDS 1ml

3、tris (0.5M，pH6.7) 625μl

4、dH2O 3.34ml 50-55℃，30min。

METHOD4

stripping buffer应该是可以放置很久的。不过我习惯captoethanol 以后太难闻了，配了就用；而且，有了

配——毕竟，加了β-mer

的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液，

配还是很方便的。每次用量5ml少了点，我每次用50ml。

METHOD5

0.5M NaCl，0.5M HAc；室温摇床15min。

METHOD6

将用过的膜泡在1*TBS中室温振摇过夜，中间可以换液2-3次，然后封闭，加一抗，二抗（同第一次发光），实践证明方法完全可行。

不管用那种方法，洗脱后都用PBS或TBS再洗几次。

9. 条件的摸索

DDD. 用的是Santa Cruz的抗，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问，但是不知道与Marker对应的条带是否是我的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑

剂。冰上裂解 -80度冻存的细胞，4度12000g离心5分钟，

取上清，与分子克隆（第二版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上样。不知道是哪里出了问？

解答：建议：1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应该在几-20微克/微升。

2、若是蛋白没问，哪就看是不是电泳的问，首先看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10％和12％的胶。60-80V，1小时左右。跑过积层胶与分离胶的线时，换用100V，3-4小时。

3、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时，但和45分钟的区别并不大。

4、根据MARKER的条带（我的是7条带：14、18、25、35、45、66、116KD），您根据MARKER的条带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条带。这样第一，可以省抗，第二，您的目的条带肯定在上面。

5、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度。

6、我买的也是Santa Cruz的抗，我觉得质量还可以，我想您应该先找其他方面的原。

EEE. 电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问应该出在抗原和一抗上，不知对不对。

解答：电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80－100伏。

FFF. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），当电流过，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情下，就很容易烧胶。就转膜时，是采取恒压还是恒流的问，我想和大探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很，有20 v左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min后，电流就降到8OmA，30min后就稳定在40mA，不就相当恒流吗？

解答：恒流时电压逐渐升的原是湿滤纸逐渐变干而电阻逐渐增大的缘故，如果电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。

GGG. 我想尽量提转膜的效率（我的实验求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些办法？

解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或过度转移（电压过大时间过长）的问，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建议把胶切两半，比如以35KD为界，分别进行转膜，下半时间短，上半时间长一点，应该会好一些。

HHH. 请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？

解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。尼龙膜

通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常

用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

III. 1、煮好后的样品，若没有及时上样分离，应如何保存，可以保存多久？2、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽，有没有操作手册？3、湿式转移时是否必须用bio-rad的专用滤纸？4、恒压转移的条件如何确定，为我分离小至21KD，中至66KD，大致 170KD的蛋白质，转移条件能够相同吗？5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在这个范围内也能分离，只是就不是线性范围了？

解答：1、煮好后的样品，放到-20，我们在一个月后此样品，效果一样。

2、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的页Bio-Rad USA上有。

3、转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。

4、转移条件是和蛋白质大小有的：以次确定电压和时间。具可让ptglab帮你定夺。

5、凝胶的浓度也是和分离蛋白质大小有。不是随心所欲选的，否则分离效果可能不是你所期望的。

JJJ. 怎样设计实验来确定最佳的条件？

解答：随便说一点， 具的还是需自想：

1、在每个上样孔里上同样的蛋白样品，量也一样，最好是组织样，（也可以跑1 个大 well， 不插梳子，多上样，）SDS-page；

2、转移， 设定电流或电压；

3、每隔 1（or n） 小时，取一点膜染色，看转移效果。

KKK. 我测两种抗，一种为磷酸化的目的蛋白，一种为总的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分钟，似乎没什么效果？

解答：你可以加巯基乙醇（loading buffer 一样的浓度），56度， 30mins，看看。

LLL. 1、在用PBS洗涤抗原-抗-ProteinA-Agarose复合物时，每次重悬多长时间合适？2、最后用2xSDS重悬抗原-抗复合物离心后，由

2XSDS中已经加入了溴芬兰，

此下面的Agarose珠子几乎看不到，所以吸取上清加样时也不知道里面是否吸进了 Agarose。不知有什么方法可以解决这个问，或者即使吸进了一些Agarose也不紧呢？

解答：1、不用重悬多久，重悬起来了就可以离心了。

2、加2X BUFFER前大上已经知道有多少胶粒了，吸到那个位置时小心点就是了。我也试过一些次，首先离心稍微长一点，长20秒吧，希望胶粒能沉得结实点（我想的），再吸取。如果感觉枪头不是很顺畅的时候可能就是碰到胶粒了。很难一点胶粒也吸取不上来的，尽力做好就是了。

MMM. 磷酸化抗的检测样本备时是否一定加NaF等？

解答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。我做的时候从未加过，都做出来了。

NNN. Western Blot中block的最短时间?

解答：每一步1小时足够了，中间换抗洗的话多换液几次，每次时间10分钟就够，

洗3次只半小时。跑胶1小时，转移1小时，block半小时就行，1抗1小时，洗半小时，2抗1小时，洗半小时，显色10分钟。一般跑两块胶，一块染色，一块western。一天肯定完事，一般不用等到第二天。

OOO. 想用Western检测基转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白（定性），分子量为20KD，浓度约为几百ng/ml。蛋白样品需浓缩、纯化吗？如何浓缩、纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件？

解答：按照你提供的浓度，如果做Western Blot，是不用浓缩样品的. 对20kd的小分子的蛋白，Western Blot中注意的是：

1、转移时的时间，

2、转移时的电流或电压.

3、transfer buffer 中加20%的甲醇.

4、可以用13-15%的分离胶.

PPP. 蛋白分子量大小分别为21kd、28kd，用的是湿转，请问多大电流，多长时间比较合适？

解答：分子量比较小，最好是用干转，湿转效率太，易转过了。干转的话，用2.5 A/cm， 30min就应该够了。湿转，按照bio-rad的说明，用100mA，也得半个多小时吧。

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QQQ. 需测同一种蛋白质的总量与磷酸化的量，但相互间干扰太大，怎么办？

解答：将膜放入stripping buffer（SDS 2%，Tris·Cl (PH=6.7) 62.5mM，beta-巯基乙醇 100mM）中，50℃孵育30分钟，TTBS西三次，再重新加入一抗，进行另一种抗原的检测。

RRR. 做Western Blot实验时，发转膜时的电流总是偏小，转膜的效率也偏低. 100V恒压转膜时的电流只有190mA左右，而以前都有250mA。系和条件都和以前一样，只是环境温度比以前低了很多。

解答：有可能重复使用了转移缓冲液，随着离子的逐渐减少，电阻越来越大，当然恒压时电流越来越小了。建议更换转移缓冲液。反复使用不超过三次。环境温度低是有利转移的。

SSS. 我电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问应该出在抗原和一抗上，不知对不对。一抗我买的是单抗，推荐的稀释度是1：100——1：1000。我用的是1：100。难道非用多抗吗？按道理单抗也应该出条带

呀！细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？

解答：1、建议您用恒压进行电泳，先用70V，等跑过积层胶与分离胶的界限时，换用90-100V，再跑3小时左右。2、转膜可用恒流，但根据你的膜的面积及所检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小，一般来讲，0.8-3.0mA/CM，分子量大的蛋白就用的电流大些，譬如，你膜的面积是30CM，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM的条件进行，你就可以60mA的电流进行。3、我觉得你的抗应该没问。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我们实验事都是保存在-20度的，提出蛋白分装保存在-20度。

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TTT. 目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就显细胞中mRNA表达不，估计将培养上清冻干浓缩后采用Western Blot还可能检测不出，但如果用western，是否一定用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE电泳，电泳时分别管三层凝胶，分离胶用40%T丙稀酰胺（2.6%C）浓度为16.5%，另外两层都用30％丙稀酰胺，中间一层浓度为10%，积层胶浓度为4%，凝胶厚度1mm，转膜的条件试过30V70分钟，膜上可见到小分子蛋白marker的条带，似乎见到目的条带，上样量为60μg细胞胞浆总蛋白，转膜的条件怎么样合适？

解答：一定用0.2μm的膜，并且转移的条件摸索一下，小分子的Western不好做，根据你的实验器材来定，一般你是有prestained marker就可以参照一下，如果相应的分子量大小的marker转移的好就可以了。

UUU. 怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上样的量很重，罐胶有什么技巧吗？想跑漂亮，是不是应该先小电压，再电压，总上电压小些会跑的好些?还有前面有人说电泳液玻璃板会使电泳条带漂亮些?

解答：影响跑胶跑的质量，有以下几个素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定充分混匀，玻璃板一定干净，双蒸水隔离时，一定比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。

VVV. 为什么提大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原?

解答：小分子的蛋白在转移过中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。

WWW. 上次转染了1.6*106细胞，收集，收集到了400微升积，加6*loading buffer， 95度煮5分钟，-20度，交替3次，离心，上样，7%分离胶，先80v跑进分离胶，在100v电泳至溴酚兰出胶，biorad半干转PDVF膜，15v转30分钟，预染marker全部进膜，转移后的胶考马斯亮兰染，可见残留的蛋白带，大分子量多些.blot时，封闭用5%奶粉TTBS 1小时，抗稀释液TTBS，一抗(1:10，单抗上清，2000年备)1小时，二抗(1:2000)1小时，均在室温.结果，50kd的小分子显色，160kd大分子未显色。

原分析及准备改进：转染大容量的质粒(融合蛋白的质粒)的效率会相对较低，大分子量表达也会相对较低，加上大分子量蛋白的转移不完全，可能是我没有拿到大分子量条带结果的原。另外背景稍微有一些脏(背景整均匀一致)，估计是二抗的浓度了些，准备降至 1:5000，另外抗稀释液准备改用5%奶粉TTBS，封闭改为室温2小时。这个过有没有问？

解答：首先分析你的整个实验步骤。我发了两个比较大的毛病：

1、一抗用TBST稀释。按照我的理解，一抗最好用5%的TBST脱脂牛奶稀释，和你的封闭液相一致，这样可以降低背景。

2、 “biorad半干转PDVF膜，15v转30分钟”，你是这么做的吗？为我大部分时间是做的恒流转移，用的是0.1mA/膜，100kd-- 200kd转2小时。到最后电压会升到20v左右。你用恒压法，我不是很肯定你转30分钟能将大分子（160kd）的抗原转上去。我建议你最好能将时间延长，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒压，可摸索一下，适当延长时间。有时候你的marker也有可能欺骗你，为marker的量比较大，是很容易转上去的，实际上目蛋白的量远远少marker量。

我对你的结果分析如下：

1、你的结果很好，估计离目不远了，很快就可以。

2、 没有160kd的带是为你的转移时间过短，适当延长转移时间（我怀疑这是问）。

的

3、你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000，背景会低一点。

10. 方法的介绍

XXX. 我想将hbx转到hepg2 细胞里 通过检测hbx蛋白的水来 检验转染的效率 不知道可不可行?

解答：Western Blot检测HBX蛋白的表达来检测转染效率不是一个好办法，建议还是：

1、最好是带有荧光签的HBX转染来看转染效率，最可靠

2、其次，HBX和荧光载共转染，相对说明问

3、荧光载单独转染，是看细胞好不好转了呵呵

转染效率低荧光显微镜下一目了然了。有的细胞荧光强，有的细胞荧光弱，有的没有。所以HBX表达强很可能是少数细胞荧光强的结果，不代表转染效率。

YYY. 半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小好像都有系，那么湿法转移是不是所有的转移条件都一样呢？一般的条件是怎样的？

解答：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。

ZZZ. 转膜时何为湿法，何为半干法？

解答：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移系的叫半干法。

AAAA. 为什么浓缩胶和分离胶的电压不一致？同样的电压可以吗？

解答：浓缩胶的目的使得loading 的样品能够在同一条水线上进入分离胶，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离是理论上（实际上也是）小电压长时间分离的效果会更好，但是在操作过中没有必等那么长的时间，所以就用大电压快点跑。

BBBB. 如果目的蛋白比较小，21和38kd，转膜时（Biorad的湿转仪）时间是否能缩短些？100伏电压，甲醇的量是否也可以相应增加？

解答：如果是小蛋白可以用小电压28V－36V，4－6hours，（4度）。甲醇10％－20％就可以了。

DDDD. 显色目的条带又细又浅，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc，应该是表达。每个涌道上50-70μg蛋白，开始用半干转移，后来用湿转14v，16h，用PVDF膜转移。胶转移后染色检测，发

小分子量的基本转移走了，可是为什么条带老是不粗不浓呢?

解答：可能跟你的一抗有系，还有应该表达，那实际做的阳性对照是否是表达；还有跟抗原量相，你多上点蛋白会好的多；跟显色条件相。

EEEE. 背景很花，当然条带也很淡，如果我在显影液中多洗一会儿，背景就很深，以致无法辨认，但有时条带又很明显，背底很淡。

解答：这跟你washing的时间和强度有，很可能你在这方面没有掌握好。显影时间是有范围的，久了肯定不行。

FFFF. 纯化过的目的带包括其上下都出了色带，而且对照菌也出了条带，会是什么原?

解答：一抗有问，效价太低，且未纯化；表达量太低；提蛋白时可能出了问。

GGGG. 做Western Blot的检测的时候，用DAB显色还能看出条带，但是换ECL的时候什么样结果都没有。我用的NOVA公司的发光底物，胶片是普通的X片，定影液和显影液都是别人留下来的，不知道是什么原？

解答：一般的说，Ecl比DAB更灵敏，但是DAB是HRP最敏感的底物，所以有几种可能： ECL底物失活了，你可以检测一下；敏感度正好不到ECl底物的范围。DAB能显色可不能催化ECL底物；显影液没用了。

HHHH. 怎样分析结果，需什么软件?

解答：如果你做定量或办定量，至少用到一个光密度扫描分析软件，如果不是，直接分析就可以了。

IIII. 积层胶、分离胶一般多少左右合适？

解答：一般电泳是积层胶60-80v，分离胶100v。

JJJJ. 采用生物素记的二抗－SABC-DAB检测系统做western，非特异性的条带和背景？总蛋白考染的时候发接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么原，如何解决？sds－page的时候恒压和恒流哪个好？

解答：非特异性的条带和背景：可能性太多了，一抗，二抗，封闭的原都可能。 总蛋白考染的时候发接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么原，如何解决？正常的，另外，是否是你的积层胶有问。sds－page的时候，恒压和恒流都可以用。

KKKK. 血清样品进行Western Blot 分析，目的蛋白21kD，结果显色出来后，目的条带很淡，而白蛋白和IgG条带很浓？

解答：可能是为白蛋白为67kD和目的蛋白相差教大，且他的浓度较低，你可以以底物二氨基联苯胺和0.01%过氧化氢溶液显色的时间延长为30分钟，再用去离子水漂洗以终止反应;也可能是抗的特异性不好。把封闭的时间延长，同时提封闭液的浓度，可以减少以下背景噪音。同时洗的时候彻底，而目的条带弱，说明浓度不足，如果不考虑后续能的话，你可以过G-50（细）柱子，纯化你的靶蛋白，接着真空冷冻浓缩，可以得到很漂亮的结果。

LLLL. Western转膜已经了，但是Marker泳道未见蛋白条带（正常应该有6条），

其余各泳道均有清晰的蛋白条带，经考马斯亮蓝染胶，结果相同。经5%的脱脂牛奶封闭1小时45分钟后，进行一抗孵育（1：200，建议起始浓度）过夜，二抗孵育5个半小时（1：2000），均在室温下，DAB显色，虽出蛋白条带，但较弱，且出非特异性条带。请问：1、Marker是MBI公司的，可分离14-116KD的蛋白，买了大概有一年的时间，是否有问？2、一抗（为多克隆抗）、二抗的浓度及孵育的时间是否合适？ 3、封闭的时间是否太短？

解答：1. marker 有可能被降解了， 也有可能是它称的上样量太少，不够，我做过一个称每次5μl 可我上了20μl 才行的。

2.建议，一抗4度过夜也很好， 建议1:100，室温2hrs就够了，

3. 二抗室温1小时，1:2000，我喜欢4度封闭过夜（室温2hr就够了），1抗室温1hr，2抗室温1hr，最好是一抗4度过夜（或室温2小时）1:200，2抗室温1小时1:2000， 换ECL法。

变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。

最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有0.1％的SDS(Laemmli, 1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低

而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。

19)转膜

将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。

1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).

2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).

3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).

4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).

Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations 20)、清洗

将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！） 21)、封闭

1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).

2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃. 22)、一抗孵育

一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。

Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.

23)、清洗

将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。 24)、二抗孵育

二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。 25)、清洗

同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。 26)、显色

按如下配方配制显色液：

1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C 将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。

Considerations:

Perhaps the most common problem in western blotting is the occurrence of background staining. The best remedy for high background (in many cases) is simply to dilute the primary antibody further. Other solutions include ensuring that detergent is used in the blocking reagent, using an alternate blocking reagent (casamino acids, BSA, serum), and decreasing the amount of protein applied to the electrophoresis gel.

• Occurrences of extra bands in the blot can be resolved by several strategies. Run a control blot omitting the primary antibody to determine if the secondary antibody is the source of the problem. Replacing the secondary antibody with a different lot or a similar reagent from a different source can provide resolution. Spurious bands below the targeted molecular weight suggest that the protein is being degraded in the experiment; inclusion of protease inhibitors can help.

• No or low signal can be remedied by loading more protein in the gel or increasing the amount of primary and/or secondary antibody applied to the blot.

• Some antibodies will not bind in the presence of detergent; consult the datasheet for each antibody prior to performing any procedure