第４２卷第４期 ２ ０ １ ５年７月 酿 酒 Ｖｏ１．４２．№．４ ＮＧ ＬＩＱＵＯＲ ＭＡＫＩＪｕｌｙ，２０１５ 文章编号：１００２—８１１０（２０１５）０４—０１０５—０３ 白酒酿造微生物鉴定方法的研究进展 杨光，陈 丽，赵平，丁松乔，王哲明 哈尔滨１５００２８） （黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江摘要：介绍了白酒酿造微生物的传统分类鉴定方法、两种分子生物学鉴定方法的原理、基本步骤、实例及优缺 点。通过对白酒发酵过程中微生物群落的分析，可进一步了解白酒的形成过程及机理。 关键词：白酒；微生物；鉴定 中图分类号：ＴＳ２６２．３；ＴＳ２６１．１ 文献标识码：Ｂ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｄｖａｎｃｅ ｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｆｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｌｉｑｕｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＹＡＮＧ Ｇｕａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｌｉ，ＺＨＡＯ Ｐｉｎｇ，ＤＩＮＧ Ｓｏｎｇ－ｑｉａｏ，ＷＡＮＧ Ｚｈｅ－ｍｉｎｇ （Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｈａｒｂｉｎ １５００２８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅｒ－ｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉ１．Ｔｈｉｓａ ｐａｐｅｒ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｎｍ￣ｏｄｓｕｓｅｄ ｔｈｅＣｈｉａｅｓｅ￣ｑｕｏｒ ８１＂ｃａ，ｉｎｔｈｅ ａｓｐｅｃｔｓｏｆｔｈｅＢｒｙ，ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｌｉｑｕｏｒ；ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；ｉｄｅｎ曲ｃａｔｉｏｎ ０前言 数法，可直接测定样品中有繁殖能力的微生物数量； 三是最大可能数法（ＭＰＮ法），该法适用于测定混杂 微生物群落中具有特殊生理功能的类群。 第三，富集培养。在此步骤中可扩大微生物的数 中国传统白酒被列为世界著名六大蒸馏酒之 一。中国传统白酒是以富含淀粉质的粮谷类为原 料，以中国酒曲为糖化发酵剂，采用固态、半固态或 液体发酵，经蒸馏、贮存和勾调而成的含酒精的饮 料【”。白酒的特殊风味来源于参与白酒发酵的微生 物种类和数量。酿酒微生物之间的协同作用形成了 白酒中醇、酯、酸、醛等特殊的风味物质。白酒酿造 过程中，酿酒微生物的活动对白酒品质有着至关重 要的作用。 １ 白酒中酿造微生物的鉴定方法 １．１传统微生物分类鉴定方法 量，便于分离纯化和进一步的分析研究。 第四，菌种分离。采用梯度稀释方法进行平板划 线分离，从而得到不同菌种的单菌落，并对单菌落进 行观察并记录菌落形态。 第五，生化试验。参照相应的微生物鉴定手册， 挑取菌落进行生化试验。生化试验结果结合菌落形 态和显微观察，最终对菌株进行鉴定。 传统微生物分类鉴定方法的部分应用见表１。 １．２分子生物学方法 鉴定白酒酿造过程中的微生物最直接的方法 即为传统的微生物分类鉴定方法。其过程为采样、 计数、培养、分离、鉴定等步骤。 第一，样品的采集。针对酒曲、酒醅或酒醪、窖 １．２．１聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳 （ＰＣＲ—ＤＧＧＥ）技术 该方法可分离长度相同但是碱基不同的ＤＮＡ 片段的混合物，其凝胶在聚丙烯酰胺凝胶中添加了 线性梯度的变性剂尿素与甲酰胺，这样就可以形成 从低到高的线性梯度【５１。在一定的温度下，不同序列 泥、酿造用水空气等不同的对象进行样品的采集。 第二，微生物计数。对个样品中的微生物进行 记数。可采用三种记数方法：一是显微镜计数法，该 收稿日期：２０１５—０４—２５ 法简单快捷，但不可区分活菌与死菌；二是活菌计 ＤＮＡ片段解链的程度是不同的，因此会造成电泳迁 作者简介：杨光（１９８２－），女，硕士研究生，工程师，黑龙江省质量监督检测研究院，从事食品检测和质量管理工作，主要研究方向为微生物学 与分子生物学。 第四期 酿 酒 ２０１５ 移率发生变化。将ＤＮＡ片段在含变性剂的凝胶中 进行电泳，他们就会在凝胶的不同位置停止迁移， 从而使长度相同序列不同的ＤＮＡ片段得到分离。 品的复杂性。条带数量的多少能反应样品中微生物 组成的差异，条带的亮度能反映样品中微生物的多 少。目前，ＰＣＲ—ＤＧＧＥ技术在微生物群落结构的分 将ＰＣＲ和ＤＧＧＥ结合起来在变性条件适当的情况 析和动态研究方面得到了广泛应用【７］。该方法在鉴 下能分辨出一个碱基对的差异悯，分辨率较高。染色 定白酒酿造过程中的微生物上面应用较为广泛，具 后的凝胶通过图谱分析可以在一定程度上反应样 体应用见表２。 表１ 传统微生物分类鉴定方法的应用情况 序号年代研究人员 研究情况 １ ２００１施安辉等利用传统微生物分类鉴定法得出细菌、霉菌和酵母的构成比例，鉴定出中温及中高温大区中的优势霉菌１２１。 ２ ２００７李健容等鉴定了民间传统酒曲中的主要霉菌及酵母【３Ｊ。 ３ ２００７岳元媛等对泸州老窖不同窖龄窖底和窖壁泥样的可培养兼性厌氧细菌进行了分类计数，并将窖泥中兼性厌氧细菌 进行了分类鉴定。最终得到１６株菌株，并鉴定到属。分离出的大部分进行厌氧细菌属于芽孢杆菌属 （Ｂａｃｉｌｕｓ）和芽孢乳杆菌属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ），还存在分枝杆菌属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｄｕｍ）、假单胞菌属（Ｐｓｅｕ— ｄｏ－ｍｏｎａｓ）、微杆菌属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｄｕｍ）、棒状杆菌属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｄｕｍ）、黄杆菌属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、梭菌属 （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）￣。 １．２．２ ｒＤＮＡ基因同源性分析方法 重要的方法【１３１。即在１６Ｓ／１ ８Ｓ ｒＤＮＡ扩增基础上对全 ｒＤＮＡ基因同源性分析方法是综合应用多项分 序列进行系统学分析，并进行同源性分析，构建系 子生物学技术对微生物中ｒＤＮＡ基因进行分析，从 统发育树。其部分应用见表３． 而揭示微生物多样性，这是分子微生物生态学中最 表３ ｒＤＮＡ基因同源性分析方法的应用情况 ２传统分类鉴定方法与分子生物学鉴定方法的比较 ２．１ 传统微生物分类鉴定方法的局限性 传统分离纯化方法鉴定菌种，需要一系列大量 的生化试验，鉴定程序比较繁琐。一般情况下需要 黼 第四期 杨光，等：白酒酿造微生物鉴定方法的研究进展 种的最终鉴定将结合两者共同进行。 ２０１５ 结合菌种的培养条件、形态特征、显微结构、生理生 化反应、繁殖方式与生活史等结果对菌种进行综合 判定。自然界微生态系统中可培养的微生物被认为 只占微生物总数的０．１％～１０％ｔ阍，而且分离培养会 改变原始菌群的微生态构成，无法分析不同微生物 之间以及微生物与环境之间的相互关系［１７，１ ８ｊ。 因此，传统的分离培养方法远远不能满足微生 物多样性研究的需要。随着近代分子生物学的快速 发展，大量分子生物学方法应用于酿酒微生物群落 的研究，克服了传统微生物分离鉴定方法对白酒酿 造过程中的微生物生态学的研究局 。 ２．２分子生物学方法的不足及改进措施 ２．２．１样品保存环境的影响 酿酒过程中的微生物处于厌氧环境，但微生物 在环境样品在提取核酸前的存放过程中不可避免 地会产生变化。例如，真菌在０～４ｃＩ＝仍可以观察到 明显的生长现象［１９】。因此，取样之后尽快进行实验操 作可以有效解决该问题。 ２．２．２环境中成分的影响 酒醅样品中的成分会对分析产生影响。每次提 取ＤＮＡ的效率不同，造成结果重复性差 。酵母细 胞存在情况下，尤其是酵母细胞大于３ Ｘ １０ 时，会 对ＰＣＲ产生干扰。研究发现，在酵母大量存在的情 况下，Ｎｅｓｔｅｄ—ＰＣＲ可以较好地解决这一矛盾。 ２．２＿３菌体细胞裂解程度不同 细胞裂解程度不均一，不易裂解的细胞丰度过 低ｆｌ９、２ｏ］，直接影响扩增结果，因此，针对酒醅环境的微 生物ＤＮＡ提取方法的深入研究有着重要的意义。 ２．２．４在真核生物上的应用尚浅 由于真核生物的核糖体的编码基因以及调节机 制比较复杂，所以对镇和生物的研究还不够透彻，现 今应用在真核微生物生态学的分析上还是比较少。 ３展望 分子生物学鉴定微生物的技术已在白酒酿造 中广泛应用，除上述介绍的两种方法外，ＲＥＰ—ＰＣＲ 指纹法、ＰＣＲ—ＲＦＬＰ分析法等方法也得到了普遍应 用。目前的分子生物学鉴定方法已经相对成熟，具 备敏感性高、特异性强、稳定性好、精确性高等优 点。随着分子生物学的不断发展进步，酿酒微生物 鉴定的方法也将不断更新。虽然传统微生物有其不 可避免的缺陷，但他在菌种鉴定方面有着不可动摇 的地位。虽然分子生物学鉴定手段日益进步，但菌 【参考文献】 【１】余乾伟．传统白酒酿造技术【Ｍ】．北京：中国轻工业出版社，２０１０． ［２】施安辉，关纪奎，张文璞等．徐坊大曲的微生物区系及其优势菌的 鉴定【Ｊ】．酿酒科技，２００１，６：２６—２８． ［３１李健容，蔡爱群．民间传统酒曲主要微生物的分离及鉴定［Ｊ】．酿酒 科技，２００７，５：１１１－１１５． ［４］岳元媛，张文学，刘霞，等．浓香型白酒窖泥中兼性厌氧细菌的分 离鉴定［Ｊ］．微生物学通报，２００７，３４（２：）：２５１—２５５． 【５】楼士林，杨盛昌．基因工程［ＭＩ．北京：科学出版社，２００２． ［６］ＺＡＫＪ Ｃ，ＷＩＬＬＩＧ Ｍ Ｒ，ＭＯＯＲＨＥＡＤ Ｄ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉ— ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆｍｉｃｒｏｂｉｌａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ： ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．Ｓｏｉｌ Ｂｉ－ ｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４，２６（９）：１ １０１—１ １０８． ［７】徐玲玲，刘亚洁，李江，等．变性梯度凝胶电泳在微生物多样性分 析中的应用及其技术发展Ⅱ】．东华理工学院学报，２００７（３）： ２７９—２８２． 【８】张文学．ＰＣＲ技术对浓香型白酒糟醅细菌菌群的解析［Ｊ１．四川大学 学报：工程科学版，２００５，３７（５）：８２—８７． 【９］施思，邓宇，李波，等．ＤＧＧＥ法在盛夏习酒酒醅的微生物菌群结构 解析中的应用［Ｊ】．酿酒科技，２０１０（３）：５１—５３． ［１０】张文学，乔宗伟瑚承，等．浓香型白酒糟醅中真菌菌群的多样性分 析ｆＪ］．四川大学学报：３２程科学版，２００６，３８（５）：９７一１０１． ［１ １１７＝海燕，张晓君，徐岩，等．浓香型和芝麻香型白酒酒醅中微生物 菌群的研究［Ｊ］．酿酒科技，２００８，２：８６—９１． 【１２】施思，王海英，张文学，等．浓香型白酒不同窖泥的微生物群落特 征分析［Ｊ】．酿酒科技，２０１１，５：３８—４１． 【ｌ３】沈才萍，李德林，敖宗华，等．酒醅微生物的分子生物学研究［Ｊ】．技 术与市场，２０１３，２０（６）：４Ｏ－４２． ［１４］吴飞，陈红英，胡承，等．浓香型白酒糟醅中可培养酵母１８Ｓ ｒＤＮＡ 全序列的系统学分析［Ｊ］．酿酒科技，２００６（４）：２３—２５． ［１５ 俊成．酒醅中芽孢杆属细菌的１６Ｓ ｒＤＮＡ全序列系统学分析［Ｊ】． 酿酒科技，２００７（２）：１７—１９． ［１６］Ｂｒｃｏｋ，Ｔ，Ｄ．Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｓｉｔｕ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｂ－ ｌｅｍｓ．ｉｎ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃａｍ－ ｂｒｉｄｇｅ）【ＳＹＭＰ．ＳＯＣ．ＧＥＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（ＣＡＭＢ．）．】【Ｍ】．１９８７． 【１７］Ｋｌｅｒｋｓ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａ１．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃ ８ｅｒｏｖａｒ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒａｌ ｃｏｎｔｏｒ１．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｏｒｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．２００６，７２（６）： ３８７９－３８８６． 【１８］Ｆａｂｌｅ，Ｇ．Ａ．ａｎｄ Ｓ Ｈ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｉｘ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ＤＮＡ ｅｒｔｒｃａｔｉｏｎ ｋｉｔｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｓｐｉｋｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，３８（１Ｏ）： ３８６０—３８６３． ［１９ｌＳｔｅｗａｒｔ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｔ．Ｍ．ＤＯＷＮＨＡＮＩＣＫ，Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｌａｃｔｉｃ ｃａｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｅｓｔｅｄ ｐｏｌｙ－ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ［Ｊ］．１９９６，５４（２）：７８—８４． ［２０］袁丽，高瑞昌．ＰＣＲ技术在酿酒中的应用田．酿酒科技２００４（６）：７０—７１．
