白酒酒醅中两种多肽的鉴定及其抗氧化和降血压功能评价

孙金沅; 姜云松; 刘国英; 李贺贺; 吴继红; 孙啸涛; 孙宝国 【期刊名称】《《食品与发酵工业》》 【年(卷),期】2019(045)018 【总页数】8页(P1-8)

【关键词】白酒酒醅; 多肽; 抗氧化能力; 血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性 【作 者】孙金沅; 姜云松; 刘国英; 李贺贺; 吴继红; 孙啸涛; 孙宝国

【作者单位】北京工商大学 北京食品风味化学重点实验室 北京 100048; 北京工商大学 食品质量与安全北京重点实验室 北京 100048; 安徽古井贡酒股份有限公司 安徽 亳州 236800 【正文语种】中 文

酒醅是白酒酿造过程中，高粱、小麦、糯米、玉米、大麦等原料蒸煮后与糖化发酵剂混合，并在微生物的作用下发酵后，预备蒸馏取酒的原料[1]。由于制作酒醅的原料中存在较高的蛋白含量，其中一定含量的蛋白能够在微生物的作用下分解为多肽。目前，对酒醅中功能性多肽的分析研究较少，仅有课题组前期研究中在芝麻香型白酒酒醅中分离鉴定出了多肽Val-Asn-Pro(VNP)和Tyr-Gly-Asp(YGD)，并进行了初步的生物活性研究[2]。

生物活性肽的来源广泛，可以直接从动植物蛋白中获取，如鱼肉[3]、火腿[4]、稻米[5]和麦芽[6]等。目前，多肽常用的提取分离方法有酶解法[7]、碱提酸沉淀法

[8]、碱酶两步法[9]、超声辅助酶解法[10]等复合法以及微生物发酵法[11]，常用的分离纯化方法有大孔吸附树脂纯化[12]、凝胶层析[13]、制备型液相色谱和蛋白纯化仪[14]，而多肽结构鉴定通常采用氨基酸分析仪[15]、高效液相-四级杆-飞行时间质谱(high performance liquid chromatography- quadruple-time of fly -mass spectrum/mass spectrum, HPLC-Q-TOF-MS/MS)[16]、聚丙烯酰胺凝胶电泳[17]、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱[18]等方法。

抗氧化功能是多肽具有的主要功能之一[19]。2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸法(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl, DPPH)、还原力法、氧化自由基吸收能力法(oxygen radical absorbance capacity, ORAC)和亚铁螯合力测定法[20]等是较为常用的抗氧化能力测定方法。随着对多肽研究的不断深入[21-22]，血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制活性同样也是部分多肽所具有的功能之一， ACE抑制肽可以同时阻碍ACE催化水解血管紧张素I以及使缓激肽失活这2种生化反应过程，来达到降血压的作用[22]。目前，吴继红等[23]已从白酒中鉴定出具有ACE抑制活性的多肽脯氨酸-组氨酸-脯氨酸(PHP)，其半抑制浓度(ICSO)为446 mmol/L。

多肽沸点较高，但是由于白酒采用独特的固态甑桶蒸馏方式，蒸馏过程中甑内酒醅中的酒精及其他微量成分经过多次汽化-冷凝-汽化的过程达到多组分浓缩和提取的效果，也会有少量难挥发的组分进入酒中[24]，例如多肽以及一些高沸点的酸类等，但是含量非常少。本研究将在前期对芝麻香型白酒酒醅研究[2]的基础上，以浓香型白酒古井贡酒酒醅为研究对象进行未知多肽的提取、纯化和鉴定，并对其体外抗氧化活性和ACE抑制活性进行测定，旨在进一步研究白酒酒醅中对人体健康有益的物质，为后期通过改进蒸馏工艺增加其在白酒中的含量，为提高白酒的健康属性

提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂

白酒酒醅，由安徽古井贡酒股份有限公司提供；XAD-16非离子型大孔树脂、NaOH(纯度≥ 96%)，麦克林上海有限公司；Sephadex G-15 凝胶，北京索莱宝科技有限公司；甲酸(HPLC级，纯度≥ 99%)、乙腈(HPLC级，纯度≥ 99.9%)，北京迪马科技有限公司；马尿酰-组氨酰-亮氨酸(hyaluronyl-histidyl-leucine，HHL)、马尿酸(hippuric acid，HA),(纯度≥99.0%)，上海源叶生物科技有限公司；血管紧张素转换酶(1UN)、ABTS试剂盒、DPPH试剂盒、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox)，美国Sigma-Aldrich试剂公司;Val-Pro-Asp(VPD)、Leu-Gly-Ala(KGP)标准品(纯度≥ 98%)，上海吉尔生化有限公司；H2SO4(纯度≥ 98%)，国药集团化学试剂有限公司；FeCl2(纯度>98%)，北京伊诺凯科技有限公司；FeCl3(纯度≥98%)、铁(纯度≥99.5%)、过硫酸钾(纯度≥ 98%)、苯酚，西陇科学股份有限公司；2,2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride，AAPH) (纯度≥ 98%)，比利时Acros试剂公司；EDTA Na2(纯度≥ 99%)，北京博奥拓达科技有限公司；pH值为7.4和6.6的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline， PBS)，上海碧云天生物技术有限公司；啡咯嗪(ferrozine)，北京拜尔迪生物技术有限公司；三氯乙酸，阿法埃莎(中国)化学有限公司。 1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限公司；KH-500DE型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Pellicon超滤装置，德国Merck Millipore公司；1 kDa超滤膜，

EMD Millipore有限公司；MB99-2自动液相色谱分离层析仪、HD-3紫外检测器，上海青浦沪西仪器厂；Agilent1 260液相色谱、Agilent 1200制备型液相、Agilent1 290高效液相-四级杆-6 530飞行时间质谱，美国Agilent公司；Xbridge Peptide BEH C18反相色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Xbridge Peptide BEH C18反相色谱柱(150 mm×10 mm，5 μm)，爱尔兰Waters公司；FD-1B-80型冷冻干燥机，南京普森仪器；Molecule M2酶标仪，美国分子仪器有限公司。 1.3 酒醅中肽的提取

准确称取-20 ℃冷冻状态保存的酒醅400 g，在50 ℃下烘干至恒重，粉碎后与色谱纯正己烷以1∶5(g∶mL)的比例混合，脱脂3 h，烘干后加入到pH值为9的超纯水中，在57 ℃下提取1 h后，超声辅助(40 kHz、500 W)提取33 min，抽滤，得到滤液，浓缩后得到酒醅水溶性提取物。向其中加入等体积15%(体积分数)的三氯乙酸，混合静置1 h，在4 ℃、6 500 r/min条件下离心25 min，沉淀大分子蛋白质，所得上清液即为酒醅肽提取液。 1.4 超滤

在室温，压力0.05 MPa条件下，使用1 kDa超滤膜应用Pellicon超滤装置对酒醅水溶性提取物进行超滤，选取分子质量<1 kDa的组分[25]。使用旋转蒸发仪在0.09 MPa，50 ℃条件下浓缩，随后-4 ℃低温保存备用。 1.5 大孔吸附树脂对酒醅肽的分级洗脱及除糖

根据ZHANG等[2]的方法选用XAD-16树脂对多肽提取液进行分级洗脱,并在50 ℃，0.1MPa条件下真空浓缩得到除去糖分的酒醅多肽溶液。 1.6 凝胶过滤层析纯化酒醅肽

将Sephadex G-15 凝胶装入Φ1.6 cm×70 cm层析柱中，加入4 mL样品，用超纯水以0.5 mL/min的速度进行洗脱，用紫外检测器检测214 nm下吸光度，按

峰收集洗脱液，并将各组分进行冷冻干燥获得多肽冻干粉。 1.7 半制备高效液相色谱制备酒醅肽

将各个组分样品冻干粉配制成5 000 mg/L的样品溶液，经0.45 μm针式过滤器过滤，手动进样。色谱条件参考前期的研究方法[2]。 1.8 HPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定多肽氨基酸序列及含量测定

在HPLC-Q-TOF-MS/MS上对各个纯化组分进行序列鉴定。具体色谱条件与ZHANG等[2]的方法一致。采用外标法测定酒醅提取液中多肽浓度，通过合成标准品配制50，100，250，500，1 000，2 000 mg/L的标准品溶液，并通过高效液相色谱建立峰面积-浓度的标准曲线，从而测定样品中多肽的浓度。高效液相色谱方法参考前期的工作[2]。 1.9 体外抗氧化活性测定

以酒醅中2种多肽的含量为基础，在低于和高于这个浓度方向上分别设立多肽的梯度浓度(5 000、2 500、1 000、500、250、100、50、10 mg/L的多肽标准品(纯度> 98%)最终根据标准曲线来计算出样品的总抗氧化能力，样品的TEAC值(trolox equivalent antioxidant capacity)或EEAC值(EDTA- Na2 equivalent antioxidant capacity)，以μmolTE/μmol样品或μmolEE/μmol样品表示。ABTS法还原力的测定参照ZHENG等[26]的方法。DPPH法参照等[27]的方法。ORAC法参考GARRETT[28]的方法。亚铁螯合能力测定基于CANABADY-ROCHELLE等[20]的方法。

氨基酸残基位置对多肽抗氧化能力的影响实验同样以ABTS、DPPH、ORAC、还原力和亚铁螯合力5种方法进行测定。合成另外4条与已经鉴定出的多肽氨基酸组成相同，但排列顺序不同的多肽，即Gly-Lys-Pro, Gly-Pro-Lys、Val-Asp-Pro、Pro-Asp-Val，对它们采用与上述一致的方法进行抗氧化能力的测定。 1.10 ACE抑制活性的体外评价方法

参考吴继红等[23]采用的方法，使用高效液相色谱法测定两种多肽的ACE抑制活性。

1.11 数据分析

所有测定实验均重复至少3次，实验结果以平均值±标准偏差(SD)表示。数据通过IBM SPSS Statistics 19.0进行单因素方差分析，并以Duncans多重比较法进行显著性差异的分析,不同字母表示不同组别之间存在显著性差异(P < 0.05)。 2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂XAD-16分离纯化酒醅肽

采用对酒醅中多肽吸附效果较好的XAD-16树脂对样品进行分离，结果如图1所示。由图1可以看到，在体积分数为20%、40%、和60%的乙醇水溶液的解吸过程中，整体出峰情况呈现先增加后减少的趋势，出峰效果较为明显。

a-20%乙醇解吸；b-40%乙醇解吸；c-60%乙醇解吸图1 大孔吸附树脂XAD-16洗脱图Fig.1 Macroporous adsorption resin XAD-16 elution diagrams 2.2 凝胶过滤层析分离纯化酒醅肽

为进一步分离纯化，将已除去糖分的酒醅肽溶液通过凝胶色谱依据分子质量进行分离，最终得出经过体积分数为40%的乙醇水溶液洗脱后的组分分离效果较好，并在其P3组分中分离出A、B、C 3种组分，如图2所示。 2.3 半制备高效液相色谱分离纯化酒醅多肽

使用半制备液相色谱将经过凝胶层析的A、B、C 3个组分进行分离，为了保证每个组分的纯度，舍弃分离度较低、杂峰过多的组分。从图3中可以看出，通过半制备高效液相色谱分离过后，凝胶柱洗脱分离组分A中收集到了A1～A5五个组分，组分B中收集到了B1～B2两个组分，组分C中收集到了C1、C2两个组分。

图2 40%乙醇洗脱组分凝胶层析色谱图Fig.2 Gel permeation chromatogram of 40% ethanol elution fractions

a-A组分半制备液相图;b-B组分半制备液相图;c-C组分半制备液相图图3 A、B和C组分半制备液相色谱图Fig.3 Semi-preparation liquid chromatography diagrams of components A, B and C 2.4 HPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定多肽序列

通过Agilent Masshunter B.06.00电脑工作站对A、B、C 3个组分中的子组分分别进行一级质谱分析，其中发现A4中m/z=330.180 5([M+H+])的组分峰。将m/z=329.180 5的离子作为母离子，进行二级质谱解析。母离子m/z=330.180 5的MS/MS结果如图4所示。

图4 VPD MS/MS质谱图Fig.4 MS/MS spectrum of VPD

采用从头测序法解析各个离子的二级质谱碎片信息。肽键的酰胺键断裂，C端形成y型离子，N端形成b型离子。分析母离子m/z=329.180 5的二级质谱图推测m/z=197.090 4的离子碎片为y2离子，可能是Val-Pro;推测m/z=229.112 1的离子碎片为b2离子，可能是Pro-Asp;推测m/z=116.070 2的离子碎片为y1离子，可能是Val；推测m/z=132.115 6的离子碎片为b1离子，可能是Asp。综上所述，推测m/z=330.180 5的氨基酸序列可能是Val-Pro-Asp。采用同样的方法发现B1中m/z=300.95([M+H+])的组分峰。将m/z=300.95的离子作为母离子，进行二级质谱解析。母离子m/z=300.95的MS/MS结果如图5所示。分析母离子m/z=300.95的二级质谱图推测m/z=114.11的离子碎片为b1离子，可能是Pro;推测m/z=186.29的离子碎片为y2离子，可能是Lys-Gly；推测m/z=242.29的离子碎片为b2离子，可能是Gly-Pro。综上所述，推测

m/z=300.95的氨基酸序列可能是Lys-Gly-Pro。

图5 KGP MS/MS质谱图Fig.5 MS/MS spectrum of KGP

与合成的多肽标准品进行比对，从保留时间和质谱结构上并没有发现明显区别，因此可以确定，鉴定出的两种多肽的结构分别为Val-Pro-Asp和Lys-Gly-Pro。 2.5 酒醅中KGP和VPD提取含量的计算

对首次从酒醅中鉴定出的两种多肽KGP和VPD的含量通过高效液相色谱外标法进行了测定，结果如图6所示，最终测得酒醅提取液中VPD的含量为 569.5 mg/L，而KGP的含量为463.9 mg/L。目前已有研究[23]检测出白酒中存在多肽Pro-His-Pro(PHP)，但其存在于白酒中的含量极低。酒醅中存在的相对较高含量的多肽可以为后续调整蒸馏条件，提高多肽蒸馏入酒的含量奠定基础。 2.6 体外抗氧化实验结果

应用ABTS、DPPH、ORAC、还原力、亚铁离子螯合能力5种抗氧化能力评价方法对多肽的抗氧化能力进行了测定，Trolox和EDTA-Na2作为标准抗氧化剂，结果如图7所示。

a-VPD标准曲线;b-KGP标准曲线;c-多肽提取量图6 KPG和VPD标准曲线及提取量Fig.6 Standard curves and extraction contents of KPG and VPD注：组间不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

a-KGP、GKP、GPK抗氧化能力;b-VPD、VDP、PDV抗氧化能力图7 多肽的体外抗氧化活性Fig.7 The results of antioxidant activity of peptides in vitro 由图7可以看出，VPD的ABTS自由基清除能力要强于KGP，这可能与VPD两端的残基Val-和Asp-与ABTS作用，从而抑制了ABTS+·的形成有关。在ORAC

实验中VPD的螯合能力同样略高于KGP。在DPPH实验中VPD的TE值(0.778 μmol TE/μmol VPD)高于KGP的TE值(0.656 μmol TE/μmol KGP)。两种多肽的还原力和亚铁螯合能力实验中也表现出一定的活性，VPD和KGP的TE值和EE值分别为0.445 μmol TE/μmol VPD，0.369 μmol EE/μmol VPD和0.448 μmol TE/μmol KGP，0.258 μmol EE/μmol KGP。从以上结果可以看出，Val-和Asp-相比于Lys-和Pro-在多肽两端时能够表现出更高的ABTS、DPPH自由基清除能力、还原力以及螯合力。

由以上实验结果可以看出，VPD和KGP两种多肽在3种浓度下均表现出了一定的体外抗氧化能力。两种多肽之间存在的抗氧化能力上的差异很可能是由于多肽C端和N端的氨基酸残基的不同造成的。同种多肽之间的氨基酸排列顺序的差异也会对最终的抗氧化能力造成一定的影响。鉴于2种多肽是从酒醅样品中分离提取鉴定出来的，氨基酸的种类已经决定，因此对多肽中氨基酸排列对多肽抗氧化性造成的影响进行了一定的研究。

实验结果中测得了具有明显不同的排列顺序的另外2种多肽的抗氧化活性，并与原始多肽的抗氧化能力进行了比较。在KGP多肽中分别选择了GKP和GPK作为不同氨基酸排列的多肽进行了5种抗氧化能力的测定。其中在ABTS实验中GKP表现出了最强的抗氧化能力，其TE值为1.384 μmol TE/μmol GKP，同样GPK也表现出了强于KGP的抗氧化能力，其TE值为1.256 μmol TE/μmol GPK。而在DPPH实验中,GKP和GPK的抗氧化能力分别为0.457和0.531 μmol TE/μmol GPK，两者都低于KGP，因此Lys-在C端和Pro-在N端能够起到强DPPH自由基清除能力。在ORAC实验中所表现出的实验结果与ABTS中基本一致，GKP具有最高的TE值1.236 μmol TE/μmol GKP，GPK略低，TE值为1.115 μmol TE/μmol GPK。在还原力实验中GKP具有最高的TE值为0.665 μmol TE/μmol GKP，而GPK的还原力TE值最弱为0.236 μmol TE/μmol GPK。

在亚铁螯合能力实验中GPK表现出了相对较强的能力，其EE值为0.334 μmol EE/μmol GPK，而GKP的亚铁螯合能力最低EE值为0.158 μmol EE/μmol GPK。在VPD多肽中分别选择了VDP和PDV作为不同氨基酸排列的多肽进行了5种抗氧化能力的测定。不同于KGP，在VPD的实验中，3种多肽并没有表现出明显的差异性，仅在DPPH实验中表现出了最为明显的区别，其中VDP表现出了3种多肽中最强的能力，其TE值为0.961 μmol TE/μmol VDP，PDV次之，其TE值为0.884 μmol TE/μmol PDV，两者都高于酒醅中已鉴定出的多肽VPD。在亚铁螯合能力测定实验中,VDP表现出了略强于其他两种多肽的抗氧化能力，其EE值为0.387 μmol EE/μmol VDP，其他两种多肽的抗氧化能力并没有显著性的差异。 通过对以上的结果进行分析可以得出，多肽之间不同的氨基酸排列顺序对于多肽的抗氧化能力有着一定程度的影响。在KGP结构关系实验中，以GKP为基准对比其他两种多肽，GKP在AAPH实验中表现出了最强的抗氧化能力，由此可以推断Pro-在N端和Gly-在C端所表现出的ABTS自由基清除能力要更强一些。在DPPH实验中酒醅肽KGP具有最强的抗氧化能力，由此推断Lys-在N和C端都可以表现出较强的DPPH自由基清除能力。在ORAC实验中可以看出GKP具有最强的抗氧化能力，对比3种多肽结构可以推断出Gly-在C端和Pro-在N端具有较高的抗氧化能力。在还原力实验中可以推断出Gly-在C端对还原力具有一定的促进作用。在亚铁螯合力实验中可以看出，Lys-在C端和N端都具有较强的抗氧化能力。在VPD的结构关系实验中，3种多肽只有在DPPH和亚铁螯合能力实验中表现出了一定的差异，通过比较可以得出，Pro-在多肽的两端是能够表现出较强的DPPH自由基清除能力。在亚铁螯合能力实验中同样可以推断出Pro-在N端时能够体现出相对较强的抗氧化能力。以上研究为后续依据氨基酸的种类和排列顺序初步确定酒醅中多肽的抗氧化能力提供了参考。 2.7 ACE半抑制浓度测定

用 0.1 mol/L pH 8.3 的硼酸-硼砂缓冲液配制40、20、10、5及2.5 mmol/L的Lys-Gly-Pro和Val-Pro-Asp标准品溶液来测定其对ACE酶的半抑制浓度IC50。以lg(ACEI)对lg[R/(1-R)]作图，如图8所示，得到KGP的方程y=0.1 5x-0.176 5，当Y=0时X为1.07，IC50为2.91 mmol/L；VPD的方程y=0.178 9x-0.134 2，当Y=0时，X为0.75，IC50为2.11 mmol/L。因此两种多肽具有一定的ACE抑制活性。

a-KGP的ACE抑制活性标准曲线;b-VPD的ACE抑制活性标准曲线图8 KGP和VPD的ACE抑制活性标准曲线Fig.8 ACE inhibitory activity standard curves of KGP and VPD

多肽的ACE抑制活性的强弱与组成多肽片段的氨基酸的种类、疏水性以及其在肽链中的位置都密切相关。CHEUNG等[29]认为，ACE抑制肽的活性主要取决于C端的氨基酸种类，若C端氨基酸为芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)和脯氨酸时，其抑制活性较高。此外，N端为疏水性的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或碱性氨基酸，与ACE的亲和力较强，因此抑制活性也较高。而高亲水性氨基酸由于亲水性使其无法接近ACE活性部位，从而导致氨基酸的抑制活性较弱或无抑制活性[30]。本研究中VPD和KGP肽段具有一定的ACE抑制活性，推测可能与其结构中C端存在的脯氨酸、天冬氨酸和N端存在的疏水性缬氨酸、赖氨酸有关。 3 结论

本文以浓香型白酒古井贡酒酒醅为研究对象，通过超滤、大孔吸附树脂、凝胶层析和反向高效液相色谱法等方法对酒醅水溶性提取物进行多步分离制备，从而获得高纯度肽。实验通过HPLC-Q-TOF-MS/MS首次鉴定出两种肽，其氨基酸序列分别为Val-Pro-Asp和Lys-Gly-Pro，并发现2种多肽具有一定的抗氧化能力和ACE

抑制能力，以及不同种类的氨基酸处于C端和N端时对抗氧化能力有一定的影响。研究发现酒醅中存在具有生物活性的小分子肽，这将为白酒企业后续改进蒸馏方式从而增加白酒中多肽含量提供理论基础。

在未来的实验中，需要研究KGP和VPD两种多肽中的每一种氨基酸分别在C端和N端时对抗氧化能力的影响，以及这2种多肽的细胞水平和动物水平的抗氧化和降血压实验，同时酒醅中存在的其他尚未确定结构及活性的多肽仍有待研究。 参考文献

【相关文献】

[1] ZHENG X W, HAN B Z. Baijiu (白酒), Chinese liquor: History, classification and manufacture [J]. Journal of Ethnic Foods, 2016, 3(1): 19-25.

[2] ZHANG L, JIANG Y, YIN Z, et al. Isolation and evaluation of two angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from fermented grains (Jiupei) used in Chinese Baijiu production [J]. RSC Advances, 2018, 8(65): 37 451-37 461.

[3] BORDBAR S, EBRAHIMPOUR A, ZAREI M, et al. Alcalase-generated proteolysates of stone fish (Actinopyga lecanora) flesh as a new source of antioxidant peptides [J]. International Journal of Food Properties, 2018, 21(1): 1 1-1 559.

[4] GALLEGO M, MORA L, TOLDR F. Characterisation of the antioxidant peptide AEEEYPDL and its quantification in Spanish dry-cured ham [J]. Food Chemistry, 2018, 258: 8-15. [5] MORITANI C, KAWAKAMI K, FUJITA A, et al. Isolation of activating factors of serotonin N -acetyltransferase from rice peptides [J]. Journal of Functional Foods, 2018, 41: 148-1. [6] CHEN S, LIN D, GAO Y, et al. A novel antioxidant peptide derived from wheat germ prevents high glucose-induced oxidative stress in vascular smooth muscle cells in vitro[J]. Food & Function, 2017, 8(1): 142-150.

[7] AGRAWAL H, JOSHI R, GUPTA M. Isolation, purification and characterization of antioxidative peptide of pearl millet (Pennisetum glaucum) protein hydrolysate [J]. Food Chemistry, 2016, 204: 365-372.

[8] FENG Y X, RUAN G R, JIN F, et al. Purification, identification, and synthesis of five novel antioxidant peptides from Chinese chestnut (Castanea mollissima Blume) protein hydrolysates [J]. LWT-Food Science and Technology, 2018, 92: 40-46.

[9] WANG L, DING Y, ZHANG X, et al. Isolation of a novel calcium-binding peptide from wheat germ protein hydrolysates and the prediction for its mechanism of combination [J]. Food Chemistry, 2018, 239: 416-426.

[10] 李华, 刘恩岐,唐仕荣,等. 酶法制备黑豆抗氧化肽及其分离纯化与氨基酸组成分析[J]. 食品科学, 2013, 34(9): 271-276.

[11] 肖怀秋, 李玉珍,林亲录,等. 响应面优化冷榨花生粕酶法制备多肽工艺的研究[J].中国浪游学报，2013, 28(9): 50-55.

[12] LIU J, SONG H, LIU Y, et al. Discovery of kokumi peptide from yeast extract by LC-Q-TOF-MS/MS and sensomics approach [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2015, 95(15): 3 183-3 194.

[13] ZHUANG M, LIN L, ZHAO M, et al. Sequence, taste and umami-enhancing effect of the peptides separated from soy sauce [J]. Food Chemistry, 2016, 206: 174-181.

[14] FAN F, TU M, LIU M, et al. Isolation and Characterization of lactoferrin peptides with stimulatory effect on osteoblast proliferation[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2017, 65(33): 7 179-7 185.

[15] 徐云强, 孙卫青,熊光权,等. 低盐鲫鱼鱼露发酵过程中的氨基酸分析[J]. 中国调味品, 2018, 43(10): 90-95.

[16] SALAMPESSY J, REDDY N, PHILLIPS M, et al. Isolation and characterization of nutraceutically potential ACE-Inhibitory peptides from leatherjacket (Meuchenia sp.) protein hydrolysates [J]. LWT-Food Science and Technology, 2017, 80: 430-436.

[17] 侯艳霞, 古丽巴哈尔·卡吾力,高晓黎. SDS-PAGE电泳法对4种鲜奶蛋白质组分的分析研究[J]. 医科大学学报2017, 40(5): 6-650；658.

[18] CORVER J, SEN J, HORNUNG B V H, et al. Identification and validation of two peptide markers for the recognition of Clostridioides difficile MLST-1 and MLST-11 by MALDI-MS [J]. Clinical Microbiology and Infection, 2018, 1 198.

[19] AGRAWAL H, JOSHI R, GUPTA M. Isolation and characterisation of enzymatic

hydrolysed peptides with antioxidant activities from green tender sorghum [J]. LWT-Food Science and Technology, 2017, 84: 608-616.

[20] CANABADY-ROCHELLE L L, HARSCOAT-SCHIAVO C, KESSLER V, et al. Determination of reducing power and metal chelating ability of antioxidant peptides: Revisited Methods [J]. Food Chemistry, 2015, 183: 129-135.

[21] CORRONS M A, LIGGIERI C S, TREJO S A, et al. ACE-inhibitory peptides from bovine caseins released with peptidases from Maclura pomifera latex [J]. Food Research International, 2017, 93: 8-15.

[22] 李锐, 邹茜,孙玉林,等. 克氏原螯虾虾头模拟胃肠道消化产物中ACE抑制肽的分离纯化与鉴定[J]. 食品与发酵工业, 2019, 45(6): 139-146.

[23] 吴继红, 孙宝国,赵谋明,等. 白酒中血管紧张素转换酶抑制肽的发现与研究[J]. 中国食品学报,

2016, 16(9): 14-20.

[24] 余乾伟. 传统白酒酿造技术[M]. 北京:中国轻工业出版社, 2013.

[25] SHAZLY A B, HE Z, EL-AZIZ M A, et al. Fractionation and identification of novel antioxidant peptides from buffalo and bovine casein hydrolysates [J]. Food Chemistry, 2017, 232: 753-762.

[26] ZHENG L, ZHAO Y, DONG H, et al. Structure-activity relationship of antioxidant dipeptides: Dominant role of Tyr, Trp, Cys and Met residues [J]. Journal of Functional Foods, 2016, 21: 485-496.

A, HAMPEL D, et al. ABTS and DPPH methods as a tool for studying antioxidant capacity of spring barley and malt [J]. Journal of Cereal Science, 2017, 73: 40-45.

[28] GARRETT A R, WEAGEL E G, MARTINEZ A D, et al. A novel method for predicting antioxidant activity based on amino acid structure [J]. Food Chemistry, 2014, 158: 490-496. [29] CHEUNG H S, WANG F L, ONDETTI M A, et al. Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme. Importance of the COOH-terminal dipeptide sequence [J]. Journal of Biological Chemistry, 1980, 255(2): 401-407.

[30] MOAYEDI A, MORA L, ARISTOY M C, et al. Peptidomic analysis of antioxidant and ACE-inhibitory peptides obtained from tomato waste proteins fermented using Bacillus subtilis[J]. Food Chemistry, 2018, 250(1): 180-187.