洋地黄的初探

对洋地黄的初探

摘要：洋地黄强心苷类药物是治疗充血性心力衰竭(心衰)的主要药物之一,同时还具有治疗室上性心律失常、心绞痛及抗肿瘤的作用。但是,洋地黄强心苷类药物存在排泄缓慢、易于蓄积中毒,而且治疗量和中毒量接近(治疗量约为中毒量的60%)的缺点。因此，本文从洋地黄强心苷的理化性质、分离与提纯、生物活性等方面对其进行初探，希望得到对洋地黄强心苷更普遍的认识。

关键词：洋地黄 强心苷 理化性质 分离与提纯 生物转化

一、引言

洋地黄制剂，如地高辛、洋地黄毒苷、毛花苷丙等都是治疗心力衰竭的特效药，而洋地黄原是一种植物，将它引入临床正式使用的，是英国医生威瑟林。1775年，威瑟林听人谈起，有一位农村老妇能用一种家传的秘方治疗水肿病(实际上是心力衰竭导致的水肿)，他发现老人在混合汤药的材料中，经常使用一种叫洋地黄的植物。于是，威瑟林对洋地黄展开深入的研究分析，他发现洋地黄在开花之前，其叶片磨成粉后应用，对消除心衰病人的水肿最为有效。经九年的实验，他用洋地黄一共治疗了163名病人，积累了大量经验。1785年他发表了题为《关于洋地黄》的专著报告，让更多的人了解了洋地黄[1]。

当然，直接使用洋地黄有许多缺点，如含杂质较多、不易准确掌握剂量等，这些都会直接影响疗效，甚至有致死的危险。尽管威瑟林在著作中已提到了使用洋地黄可能出现的不良反应，但是仍有一些病人因使用剂量过大而死亡，这严重影响了洋地黄的推广应用[2]。人们逐渐认识到，只有提取出洋地黄的有效成分，才能严格掌握用药剂量和防止发生严重的副作用。1874年，德国优秀的药物学家施密迪勃格终于从植物洋地黄中提取出了有效的

强心成分：一种苷类。至至今，现代医学临床上经常使用的就是从植物洋地黄提取得来的苷类，称为强心苷[1]。

二、洋地黄的概况

洋地黄:别名毛地黄、毒药草、紫花毛地黄、吊钟花，二年生或多年生草本，全体密被短毛。根出叶卵形至卵状披针形，边缘具钝齿，有长柄。第2～3年春于叶簇抽出花茎，高达1～1.5m，茎生叶长卵形，边缘有细齿，有短柄或近无柄。总状花序顶生，花冠钟形，下垂，偏向一侧，紫红色，内面带深紫色斑点。蒴果圆锥形，种子细小。花期5～6月，果期 6～7月。原产于欧洲中部与南部山区。现中国浙江、上海、江苏与山东等地已有大量栽培。

洋地黄品种很多，主要有毛花洋地黄和紫花洋地黄。由毛花洋地黄叶分离出的强心苷已达30多种，是由五种强心苷苷元，即洋地黄毒苷元、羟基洋地黄毒苷元、异羟基洋地黄毒苷元、双羟基洋地黄毒苷元和吉他洛苷元与不同的糖缩合所形成，大多数是次级苷，属于一级甙存在的如毛花苷A、B、C、D、E，分子中还连有乙酰酯基。由紫花洋地黄叶中分离出的强心苷已达20多种，由三种不同的苷元即洋地黄毒苷元、羟基洋地黄毒苷元和吉他洛苷元三种强心苷苷元衍生的，大多数亦为次级苷，属于一级甙存在的有紫花洋地苷A、B和葡萄糖吉他洛甙等。

三、强心苷的理化性质[3,4,5,6]

（一）性状

多为无色晶体或无定形粉末，中性物质，有旋光性。C17位上的侧链为β- 构型者味苦，而α- 构型者味不苦，但无疗效。对粘膜有刺激性。

（二）溶解性 1. 溶解性

强心苷一般可溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂，难溶于乙醚、苯、石油醚等非极性溶剂。弱亲脂性苷略溶于氯仿-乙醇（2∶1），亲脂性苷略溶于乙酸乙脂、含水氯仿、氯仿-乙醇（3∶1）等。

2. 影响溶解性的因素

强心苷的溶解性随着分子中所含糖基的数目、糖的种类以及苷元中所含的羟基多少和位置不同而异。

（三）脱水反应

强心苷混合强酸（3～5％HCl）加热水解反应的同时，苷元往往发生脱水反应，生成缩水苷元。比较容易脱水的羟基有：C14-OH、C16-OH、5β-OH等等。

OO紫花洋地黄苷A[H2O]强酸HO+3洋地黄毒糖+葡萄糖

缩水羟基洋地黄毒苷元

（四）水解反应

水解法是研究强心苷组成的常用方法，分化学方法和生物方法两大类。化学方法主要有酸水解，碱水解和乙酰解；生物方法主要有酶水解。强心苷的苷键水解难易因组成糖的不同而异，水解产物亦不同。

1．酸水解法

（1）温和酸水解

用稀酸如0.02～0.05mol/L的盐酸或硫酸在含水醇中经短时间（自半小时至数小时）加热回流，可使Ⅰ型强心苷水解成苷元和糖。此法可水解苷元和α－去氧糖之间的苷键或α－去氧糖与α－去氧糖之间的糖苷键，对α－去氧糖与葡萄糖之间的苷键不易切断，对苷元的影响小，不致引起脱水反应，对不稳定的α－去氧糖亦不致分解，故常得到双糖和叁糖。此法不适用于16位有甲酰基的洋地黄强心苷类。

（2）强烈酸水解

Ⅱ型和Ⅲ型强心苷中的糖，均非α－去氧糖，由于α－羟基阻挠了苷原子的质子化，使水解反应较为困难，不能用上法使之水解，必须增高酸的浓度（3～5％），增加作用时间或同时加压，在这种情况下，才能得到定量的葡萄糖，但易得到缩水苷元。此外，常用冰乙酸-水-浓盐酸（35∶55∶10）混合液（Kiliani混合液）来水解强心苷类，沸水浴上加热1小时即能水解完全。

（3）氯化氢丙酮法（Mannich和Siewert法）

Mannich和Siewert曾将乌本苷置于1％氯化氢丙酮中，经20℃放置2周并时时振摇，得到了乌本苷元单丙酮化合物和氯代L-鼠李糖丙酮化合物，再经稀酸水解即得乌本苷元。用此法对铃蓝毒苷及多数Ⅱ型苷进行水解，证明它是得到原来苷元的有效方法，对Ⅲ型苷推想亦应有效（Ⅲ型强心苷主要用酶解法）。此法多用于单糖苷中能溶于丙酮者，难溶于丙酮的苷类可用丁酮等代替丙酮。

2. 酶水解法

在含强心苷的植物中，有水解葡萄糖的酶，无水解α－去氧糖的酶，所以能水解除去

分子中的葡萄糖而保留α－去氧糖。除了植物中与强心苷共存的酶外，其他生物中的水解酶也能使某些强心苷水解，尤其是蜗牛酶（是一种混合酶）几乎能水解所有的苷键，能将强心苷分子中的糖逐步水解，直至获得苷元，常用来研究强心苷的结构。糖及苷元的类型不同，被水解难易也有区别。

3. 碱水解法

碱试剂可使强心苷分子中的酰基水解，内酯环裂开、△20(22)转位及苷元异构化等。

（1）酰基水解

常用来水解强心苷中酰基的碱有碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙、氢氧化钡，前二个碱主要使α－去氧糖上的酰基水解，而α－羟基糖及苷元上的酰基往往不被水解；后二个碱可以使α－去氧糖上的、α－羟基糖上的、苷元上的酰基水解。氢氧化钠的碱性太强，不但能使糖基和苷元上的酰基全部水解，而且还使内酯环破裂，故不常用。

甲酰基较乙酰基活泼易水解，提取分离用氢氧化铅处理时已有使甲酰基水解的危险。

（2）内酯环的水解

NaOH或KOH水溶液可使强心苷内酯环开裂，酸化后又闭环，但在强心苷的醇溶液中加NaOH或KOH内酯环开裂，酸化后不再有可逆变化。甲型强心苷在醇性氢氧化钾溶液中，通过内酯环的双键转移和质子转移形成C22活性亚甲基，是许多颜色反应的基础，乙型强心苷则无此反应。

4.乙酰解法

在研究强心苷的结构时，乙酰解常用来研究糖与糖之间的连接位置，如葡萄糖之间的1，6糖苷键很容易乙酰解，而1，4糖苷键较难乙酰解。

五、强心苷的检识方法--颜色反应[6]

强心苷的颜色反应很多，根据颜色反应发生在分子的不同部位可以分为以下数种：

1.作用于甾体母核的反应

一般在无水条件下，经强酸（如硫酸、磷酸、高氯酸）、中等强度的酸（如三氯乙酸）或lewis酸（如三氯化锑、二氯化锌等）的作用，甾体化合物经脱水形成双键、双键移位，分子间缩合形成共轭双键系统，并在浓酸溶液中形成多烯阳碳离子的盐而呈现一系列的颜色变化。常见的反应有：

（1）乙酐浓硫酸反应（Liebermann-Burchard反应）：取试样溶于冰醋酸，加浓硫酸-醋酐（1∶20）混合液数滴，反应液呈黄→红→蓝→紫→绿等变化，最后褪色。

（2）Tschugaev反应：取试样溶于冰醋酸，加无水氯化锌及乙酰氯后煮沸，或取试样溶于氯仿或二氯甲烷，加冰醋酸、乙酰氯和氯化锌煮沸，反应液呈紫→红→蓝→绿等变化，B环有不饱和双键的作用更快。

（3）磷酸反应

（4）Salkowski反应：将试样溶于氯仿，沿试管壁加入浓硫酸，静置，氯仿层呈血红色或青色，硫酸层有绿色荧光。

（5）三氯乙酸氯胺T（chloramine T）反应：将试样醇溶液点在滤纸（或薄板）上，喷以三氯醋酸-氯胺T试剂（25%三氯醋酸乙醇溶液4 ml加3%氯胺T水溶液1ml混匀），待纸片干后，100℃加热数分钟，于紫外光下观察。该反应可初步区别洋地黄类的苷元。

（6）三氯化锑反应

2. 作用于α、β不饱和内酯环的反应

甲型强心苷在碱性醇溶液中，双键由20（22）转移到20（21），生成C22活性亚甲基，能与下列活性亚甲基试剂作用而显色，乙型强心苷不能产生活性亚甲基，故无此类反应。具体的有：

（1）亚硝酰铁试剂（Legal反应）

（2）间二硝基苯试剂（Raymond反应）：反应机理是间二硝基苯与活性亚甲基缩合后，又经过量间二硝基苯氧化成醌式而显色。此法可用于薄层色谱和纸色谱显色，喷雾后显紫红色，5～10分钟褪色。

（3）3，5-二硝基苯甲酸试剂（Kedde反应）：原理与间二硝基苯试剂反应类似，本试剂可作为强心苷纸色谱和薄层色谱的显色试剂，喷雾后显紫红色，几分钟后褪色。

（4）碱性苦味酸试剂（Baljet反应）：《药典》以此法测定强心苷类药物含量。

以上反应均呈红或紫红、橙红色。

3. 作用于α- 去氧糖的反应

（1）Keller-Kiliani（K-K）反应：该反应为α- 去氧糖的特征性反应，对游离的α- 去氧糖或在此条件下能水解产生游离α- 去氧糖的苷都能反应。

（2）过碘酸-对硝基苯胺反应：该反应原理是：过碘酸将α- 去氧糖氧化成丙二醛，丙二醛与硝基苯胺试剂反应呈深黄色。

（3）对-硝基苯肼反应

（4）对-二甲氨基苯甲醛反应：分子中含有α- 去氧糖的强心苷可显灰红色斑点。

五、强心苷的提取与分离[6,7,8]

（一）提取

1.冷浸提取法: 取洋地黄愈伤组织5克, 分次加入10ml 95%乙醇研磨后, 浸泡震荡2小时以上, 离心除去沉渣, 所得上清液即为强心昔提取液。

2.温浸法: 将洋地黄愈伤组织放入索氏(Soxhlet)提取器,在索氏提取器和下部烧瓶中各加入一定量的95%乙醇作为提取剂，室温浸泡5～6 小时，于85℃的水浴中进行液-固萃取1～2小时后，再浸泡、萃取，如此重复2次，下部烧瓶中的清液即为强心苷提取液。

3.洋地黄毒苷的提取

(1)发酵、提取、析胶：取紫花洋地黄叶粉，加等量水充分混均，通过8～10号筛孔制成颗粒，平铺恒温（28～31℃）放置8～10h（防止水分挥发）。发酵的温度和时间要视原料新鲜程度而定，新鲜原料酶活性大，时间可缩短。发酵好的洋地黄叶加2.7倍量的70%

乙醇，于50度左右浸渍2h，随时搅拌，再继续保温5h，放冷，离心甩过滤，滤渣先后用0.6倍乙醇和0.3倍水洗涤，合并滤液和洗液，浓缩至半量，浓缩液中含醇量应为20%，降温至28～31度，放置4～6h，使胶质（叶绿素等脂溶性杂质）充分沉淀，倾出上清液，过滤。

(2)脱色、析晶：合并上清液和滤液，用CHCI3萃取三次（30度左右），合并CHCI3液，加5%NaOH水溶液洗涤，洗去有色杂质，然后用水洗至中性，再用蒸馏水洗两次，CHCI3液用无水硫酸钠脱水后，回收CHCI3，至无CHCI3味，加入等量无水丙酮，于0～5度放置24h，滤取结晶，用少量丙酮冲洗，至结晶呈淡绿色。于50℃干燥，即为粗制洋地黄毒苷。

(3)精制：粗品磨成粉，加40倍量的CHCI3放置8h，溶解后过滤，滤液加活性炭（为粗品的5%～8%），脱色4h，过滤，回收CHCI3至浓稠状，并有细微结晶析出，趁热加入等量丙酮，于0～5℃放置24h，滤集结晶，用少量丙酮洗涤，50～60℃烘干，即为洋地黄毒苷成品。

4. 洋地黄强心苷的提取[10]

（1）将洋地黄新鲜叶洗净, 加75%乙醇适量灭活,搅碎后,用10倍于鲜叶重量的70% ～75%乙醇加热至70℃温度浸泡12h,提取3 次后去除残渣, 减压回收乙醇,沉淀过滤除杂质；

（2）接着用乙醚处理浓缩滤液, 弃醚层；

（3）再在水溶液中加饱和碱式醋酸铅水溶液, 过滤去沉淀；

（4）然后将滤液通入H2S气体之后再次过滤去沉淀；

（5）浓缩滤液静置可析出结晶或快速风干成固体状物质, 便得到洋地黄强心总苷。

（二）分离

分离混合强心苷，通常采用溶剂萃取法、逆流分溶法和色谱分离法等，对于少数含量高的成分，可采用反复重结晶的方法得到单体。但在多数情况下往往需要多种方法配合使用，反复分离才能得到单一成分。

1.溶剂萃取法：利用强心苷在两相溶剂间的分配系数不同而达到分离。如：毛花洋地黄总苷（混合苷）中苷甲、乙、丙的分离。利用毛花洋地黄苷甲、苷乙、苷丙在氯仿中溶解度不同，采用甲醇-氯仿-水混合溶剂系统，可将苷丙与苷甲、苷乙分离。

2.逆流分溶法：也是利用强心苷在两相溶剂间的分配系数不同而达到分离。

3.吸附色谱法：吸附色谱法一般用于分离亲脂性强心苷（单糖苷或次生苷），常用中性氧化铝（或硅胶）作吸附剂，苯、苯-氯仿、氯仿、氯仿-甲醇作洗脱剂。但C16位有酰氧基的不能用氧化铝色谱，用氧化铝常引起酰氧基消去反应，形成△16(17)不饱和化合物。弱亲脂性强心苷，常先进行乙酰化，将乙酰化强心苷的混合物进行氧化铝吸附色谱，获得乙酰化苷的单体，再以碳酸氢钾水解去乙酰基而得原苷。

4.液滴逆流色谱法（DCCC）：也是分离弱亲脂性强心苷的一种有效方法，它是利用混合物中各组分在两液相间的分配系数差别，由流动相形成液滴，通过作为固定相的液柱而达到分离纯化的目的。

六、洋地黄毒苷的微生物羟基化作用：新月弯孢霉KA-91的生物转化反应[9]

（一）试验方法

(1)斜面种子的培养:取新月弯抱霉KA-91保藏菌株接种于新鲜斜面培养基上,28℃恒温培养7d,置于4℃冰箱保存备用。

(2)孢子悬浮液的制备:取保藏斜面菌种,倒入10ml无菌水,洗下孢子,制得抱子悬浮液。用血球计数板计数，调整抱子浓度为3.0x106个/ml。

(3)菌体培养:取lmL孢子悬液接种于30mL发酵培养基中(抱子浓度为105/mL)，摇床培养，28℃，180r/min。

(4)洋地黄毒苷的投料方法:菌体发酵24h后,取下摇瓶添加配置好的洋地黄毒苷溶液30μL。

(5)洋地黄毒苷的转化过程:继续摇床培养28℃，180r/min转化48h后终止发酵。

（二）转化产物的提取

抽滤分离菌体和发酵液,分别用30mL氯仿萃取发酵液和菌体,振荡0.5h,菌体提取液(4500r/min,10min),倒出氯仿溶液;发酵液用分液漏斗分离氯仿层,并与菌体的氯仿萃取液合并。将氯仿提取液70℃水浴蒸发结晶,再用氯仿:甲醇=1:1的混合溶媒溶解残渣,转移至EP管内,自然风干结晶,加入氯仿:甲醇=1:1的混合溶媒100μL,用于薄层色谱(TLC)分析。

（三）转化产物的分析方法

采用薄层色谱(TLC)对转化提取液进行分析。展开剂为:CHCL3：CH3OH：C6H6 = 5:2:5。吸附结束后,于紫外灯2nm下观察斑点,然后喷以显色剂(10%的硫酸水溶液),将薄板放于烘箱内90℃烘烤10～15min。观察显色的TLC平板上斑点的位置、面积大小、颜色深浅,采用归一化法对产物进行定量,并计算转化率。对转化结果进行分析。

（四）结论

可以得出新月弯抱霉KA-91转化洋地黄毒苷得到2个转化产物,命名为产物I和产物Ⅱ,其中产物I的Rf值为0.424,转化率为27.3%;产物Ⅱ的Rf值为0.228,转化率为4.6%。产物I的Rf值介于洋地黄毒苷和地高辛之间,产物Ⅱ的Rf值则小于两者,即表明产物I的极性介于洋地黄毒苷和地高辛之间,而产物Ⅱ的极性大于洋地黄毒苷和地高辛。

七、毛地黄苷对钉螺的影响[10]

通过研究了毛地黄提取物强心苷对钉螺糖原和总蛋白的影响以探讨其对钉螺的杀伤机理,得出如下结论：

（1）经低浓度(≤0.60g/L)强心总苷处理后钉螺软体的糖原含量上升, 增加幅度从6.77%到59.23%, 表明低浓度强心总甙处理钉螺, 促进了钉螺的能量代谢;而在高浓度(≥0.80g/L)处理后的钉螺软体的糖原含量下降, 减少幅度10.69%到74.94%, 表明高浓度强心总苷处理影响钉螺的能量代谢而抑制其生长。

（2）强心总苷能够在一定程度上降低钉螺体内的蛋白质含量(5.7% ～14.2%), 与夹竹桃枫杨等灭螺植物提取物的效果差不多, 但较正常螺的减少量不及糖原那样显著, 不能与其死亡率体现相应的变化。

参考文献：

[1]文•沈尔安.洋地黄的故事[J].医药与保健.2002,10（12）：23～24

[2]魏宇宁,周筱青.洋地黄类药物的临床应用评价[J].中国医院用药评价与分析,2003,3(1):14～18.

[3]徐仁生.天然产物化学[M].科学出版社.2005

[4]郑汉臣,蔡力青.药用植物学与生药学[M].人民卫生出版社.2003

[5]姚新生.天然药物化学[M].人民卫生出版社.2004

[6]吴立军.天然药物化学[M].人民卫生出版社.2011

[7]中国医学科学院药物研究所.中草药有效成分的研究(第一分册)[M].人民卫生出版社.1972

[8]汪茂田,谢培山,王忠东.天然有机化合物提取分离与结构鉴定[M].化学工业出版社.2004

[9]王丽娟.洋地黄毒苷的微生物羟基化作用研究[D].天津大学大学硕士论文. 2008

[10]谢秋萍.毛地黄甙对钉螺生理生化的影响[J].安徽农学通报.2007,13(11):50～51