06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

【目 的】

1 ．掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。 2 ．熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。 【原 理】

带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。不同蛋白质分子具有不同的大小、形状，在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量，因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同，二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动，经过一定的时间后得以分离，这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关，为了使其只与蛋白质分子的大小有关，从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量，就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。 SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质），使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。 SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? ，即 1.8 nm ），而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。说明， SDS 和蛋白质的结合所形成的 SDS- 蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质形状不同而对电泳迁移率的影响。

因此，由于 SDS 与蛋白质的结合，消除了蛋白质所带静电荷的多少和分子形状的不同对电泳迁移率的影响，使其迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小一个因素，而且当蛋白质分子量在 15kD ～ 200kD 之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系，符合下列方程式： Lg MW ＝ － b m R ＋ k

式中 MW 为蛋白质分子量。 m R 为相对迁移率， k 为截距， b 为斜率。在一定条件下， b 和 k 均为常数。

采用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量简便、快速、重复性好；所需仪器设备廉价，样品蛋白质微量；在分子量为 15kD ～ 200kD 的范围内所测得的结果与用其他方法测得的分子量相比，误差一般不超过 10% ，所以应用非常广泛。

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳作为一种单向电泳技术，按照凝胶电泳系统中的缓冲液、 pH 和凝胶孔径的差异可分为 SDS- 连续系统电泳和 SDS- 不连续系统电泳两类；按照所制成的凝胶形状和电泳方式又可分为 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶垂直柱型电泳和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳两类。它们分别称为： SDS- 连续系统垂直柱型聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS- 不连续系统垂直柱型聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS- 连续系统垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS- 不连续系统垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳

无论采用哪种，其基本原理都一样，具体操作也大同小异。由于 SDS— 不连续系统具有较强的浓缩效应，因而它的分辨力比 SDS- 连续系统电泳要高一些，所以更为常用。本实验以 SDS- 不连续系统为例进行介绍。 【器 材】

1 ．电泳仪，直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 100mA 2 ．微量加样器 3 ．电泳槽装置

4 ．大号试管和中号试管

5 ． 5ml 注射器和 9 号注射针头 6 ．洗耳球、滤纸条、封口膜等 7 ．大培养皿 【试 剂】 • 标准蛋白质：

根据待测蛋白质分子量的大小，选择 4 ～ 6 种已知分子量（分为低分子量、中分子量和高分子量）的蛋白质纯品作为标准蛋白质。 2 ．电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液：

SDS- 不连续系统 PAGE 的 电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表：

Tris 5.98g 缓冲液 1mol/L HCl 48ml 浓缩胶 加蒸馏水至 100ml Acr 30.0g 凝胶储液 Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml Tris 36.3g 缓冲液 1mol/LHCl 48ml 分离胶 加蒸馏水至 100ml Acr 30.0g 凝胶储液 Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml SDS 1g Tris 6g 10 × 电极缓冲液 Gly 28.8g 加蒸馏水至 1 000ml 储液配制好后放冰箱 4 ℃ 冷藏备用，用时 10 倍稀释，学生用时大约 3 天需更换一次。

3 ． 10% 过硫酸铵 (Ap)

1 g 过硫酸铵加 蒸馏 水至 10 ml ， 0.1ml 分装 4 ℃ 保存，保存时间为 1 周。 4 ． TEMED （四甲基乙二胺）溶液： 4 ℃ 保存。 5 ． 10% SDS 溶液

10 g SDS 加 蒸馏 水至 100 ml 。 50 ℃ 水浴下溶解，室温保存。 6 ． Tris-HCl 缓冲液（ 0.05 mol ∕ L ， pH 8.0 ）

PH 8.3 PH 8.9 PH 6.7 称取 0.61 g Tris ，加入 50 ml 蒸馏水中溶解，再加入 3 ml 1 mol ∕ L 的 HCl ，混匀，调 pH 至 8.0 ，加蒸馏水定容至 100 ml 。 7 ． 2 ×样品缓冲液

20% （ W/V ） SDS 2.0 ml ，巯基乙醇 0.1 ml ， 0.1% （ W/V ）溴酚蓝 0.5 ml ，甘油 1.0 ml ， 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液 （ pH8.0 ） 2.0 ml ，最后定容至 10 ml 。 8 ．固定液

取 50% 甲醇 4 ml ，冰乙酸 46 ml 混匀。 9 ．考马斯亮蓝 R250 染色液

称取考马斯亮蓝 R250 0.125 g ，加上述固定液 250 ml ，过滤后备用。 10 ．脱色液

冰乙酸 75 ml ，甲醇 50 ml ，加蒸馏水定容至 1 000 ml 。 【操 作】 1 ．安装电泳槽

（ 1 ）将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，准备 2 个干净的小烧杯。

（ 2 ）将玻璃板在灌胶支架上固定好。固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。 2 ．制备 分离胶和浓缩胶 分离胶和浓缩胶的配制见下表：

10% 分离胶配制（ ml ） 双蒸水 凝胶储液 PH 8.9 缓冲液 10%SDS 1%TEMED 10% 过硫酸胺 总体积 10 10 7.5 0.3 2 0.2 30 3% 浓缩胶配制（ ml ） 双蒸水 凝胶储液 PH 6.7 缓冲液 10%SDS 1%TEMED 10% 过硫酸胺 总体积 5.5 1 1.3 0.1 2 0.1 10 一旦加入 Ap ，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

根据上表先配制分离胶至锥形瓶中，用移液器沿着玻璃板壁缓缓加入，加入过程中防止气泡的产生，加至距离低位置玻璃板顶端 3 cm 处，之后立即覆盖一层蒸馏水，静置 40 min ，待分离胶与水层之间形成清晰的界面时表明胶已经凝聚好。待聚合完成，倒掉覆盖层，用去离子水清晰凝胶顶部数次以去处残留的未聚合的丙烯酰胺，倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。

然后，按上表 再 制备好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘 5 mm 处，迅速插入样梳，静置 40 min 。待浓缩胶聚合后，加入电极缓冲液，拔去梳子。 3 ．样品的制备：

（ 1 ）标准蛋白样品的制备：取标准蛋白（ 575μg/ 瓶），开封后，溶于 100 μl 双蒸水，分装于 20 个小瓶内（每管 10 μl ），再于每个小管内加入等体积的 2 ×样品缓冲液（ 10 μl ），置 － 20 ℃ 保存，使用前置室温融化后， 于沸水浴中加热 3 ～ 5 min 后上样。

（ 2 ）待测蛋白样品的制备：若样品是水溶液且浓度大于 10 mg/ml ，可将待测液与样品缓冲液等体积混匀，然后同上加热。固体样品制备与标准蛋白相同。 4 ．加样：

电泳槽中加入电极缓冲液，每孔加入 20 μl 样品。 5 ．电泳：

接通电源，进行电泳，开始电流恒定在 10 mA ，当进入分离胶后改为 20 mA ，溴酚蓝距凝胶边缘约 5 mm 时，停止电泳。 6 ．固定与染色：

电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入固定液，轻轻振摇 20 h ，倒掉固定液。倒入染色液染色至少 4 h 。 7 ．脱色：

染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。期间更换脱色液 2 ～ 3 次。 8 ．计算分子量：

（ 1 ）相对迁移率的计算：通常使用相对迁移率（ m R ），计算方法如下： 相对迁移率（ m R ）＝样品迁移距离（ cm ） / 染料迁移距离（ cm ） （ 2 ）标准曲线制作

以标准蛋白的相对迁移率（ m R ）为横坐标，标准蛋白分子量的对数为纵坐标，在坐标纸上做出标准曲线。 （ 3 ）求未知蛋白样品的分子量。

根据待测样品的相对迁移率直接从标准曲线上查出该蛋白质的分子量。 【注意事项】

1 ．缓冲液的 pH 值，浓度要准确配置，所用的水最好为双蒸水。 2 ．有些试剂要避光保存，有的要新鲜配置。

3 ． SDS ， Acr ， Bis 的试剂要求纯度较高，要求分析纯或进口分装的，如果纯度不够，需要重结晶一次或二次，方可使用。

4 ．待测样品要用低离子强度的样品，如果离子强度过高，需要通过透析或离子交换除盐。

5 ．凝胶配制过程要迅速， 催化剂 TEMED 要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。

6 ．样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平 . 7 ．剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。

8. 梳子拔出后，加入缓冲液，要使锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果。 【思考题】

1 ． 该实验中是如何去除不同蛋白质间电荷效应的？ 2 ．综合分析影响 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量结果的因素。

3 ．为什么加样前需在沸水中加热样品液？为什么当分离胶加完后，需在其上加一层水？ 附：

1 ．一些已知标准蛋白质的分子量，见表 3-4 。

表 3- 4 标准蛋白质的分子量

标准蛋白质 来源 分子量 （ 道尔顿） 细胞色素 c 溶菌酶 肌红蛋白 胰凝乳蛋白酶原 A 胃蛋白酶 乳酸脱氢酶 卵清蛋白 谷氨酸脱氢酶 牛血清白蛋白 磷酸化酶 A 马心或酵母 蛋清 牛胰 猪胃 卵清 牛血清 12500 （ 11000 ） 14300 17200 25000 35000 36000 43000 56000 67000 94000 2 ． 不同浓度 SDS- 不连续系统聚丙烯酰胺凝胶 的配制，见表 3 -5 。

表 3-5 SDS- 不连续系统 不同浓度 聚丙烯酰胺凝胶 的配制

分离胶浓度 配制 30ml 不同浓度分离胶液所需试剂量（ ml ） 配制 10ml 3% 7% 10% 12% 15% 20% 试剂名称 浓缩胶 储备液 7 10 12 15 20 分离 胶 缓冲液 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 储备液 --- --- --- --- --- 1.0 浓缩胶 缓冲液 --- --- --- --- --- 1.25 10%SDS 1%TEMED 0.3 2 0.3 2 0.3 2 0.3 2 0.3 2 0.1 2 蒸馏水 13 10 8 5 0 5.55 以上各液加入后，为了去除抑制凝胶聚合的氧，在加入 Ap 之前应进行抽气处理。 10% 过硫酸胺 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1