Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.6
发芽燕麦淀粉的分子结构与体外消化性
田斌强，邓乾春，谢笔钧
（1.河南农业大学烟草学院，河南郑州 450002）（2.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉 430070）
（3.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉 430062）
摘要：对晋燕八号燕麦避光发芽，并分别提取不同时间段的淀粉，用凝胶渗透色谱，特征黏度法和高效离子交换色谱对提取样品分别进行了分子量分布、特征黏度和链长分布的表征。结果发现，发芽过程中燕麦直链淀粉的含量升高，特征粘度增大，二者存在有显著的正相关关系；聚合度在27~33的链段始终是燕麦淀粉结构中的主体，所占比例超过60%，发芽过程中聚合度小于31的链段比例不断减小，而大于33的链段随发芽进行比例不断升高，这预示着，发芽期间生物自身对淀粉的利用以短链为主。对发芽过程中提取的淀粉与未发芽燕麦淀粉进行了体外消化性比较实验，结果表明，发芽过程降低了燕麦中淀粉的水解指数和血糖指数。燕麦淀粉中间级分对于体外消化指数影响明显，显著正相关系数0.82。
关键词：燕麦；发芽；淀粉；分子结构；体外消化 文章篇号：1673-9078(2014)6-87-91
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Molecular Structure and in vitro Digestibility of Germinated Oat Starch
TIAN Bin-qiang1,2, DENG Qian-chun3, XIE Bi-jun2
(1.College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China) (2.College of Food Science & Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China) (3.Oil Crops research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China) Abstract: The Jinyan Ⅷ oat was geminated in the dark, and then starches were extracted from different germination periods. The intrinsic viscosity, molecular weight and chain length distribution of samples were characterized by Ubbelohde viscometer, gel permeation chromatography and ion exchange chromatography, respectively. It was found that the amylose content and intrinsic viscosity of germinated oat starches increased compared to raw oat starches, and a significant positive correlation presented between them. The degree of polymerization (DP) in segments 27~33 dominated raw and malted oat starches, occupying more than 60%. The segments with DP≤31 decreased continually, while the segments with DP≥33 increased, indicating that energy conversion during germination depended on utilizing short-chain starch. The in vitro digestibility of raw and germinated oat starches showed that the germination process reduced the hydrolysis index and the glycemic index of oat starch, and intermediate fractions of oat starch played obviously impact on in vitro digestion index, with a significant positive correlation coefficient of 0.82.
Key words: oat; germination; starch; molecular structure; in vitro digestibility
人们很早就利用发芽过程生产豆芽、麦芽等食物。植物生理学上，植物种子发芽完成的可视信号通常是胚根刺穿胚芽周围组织[1]，通俗地说，只要看见胚芽露白即是发芽完成。食品研究领域往往会适当延长发芽的时间，使得其中的营养物质发生较为充分的变化，外观上表现为种子的芽和根具有一定的长度，即食品研究领域发芽的概念对应于植物生理学中种子发芽和 幼苗生长初期。这个过程实际涉及到生命体内复杂的变化过程，包含水分吸收、信号传递、酶的启动等等，
收稿日期：2014-01-03
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目（2006BAD27B09）
作者简介：田斌强（1976-），男，博士，讲师，研究方向为天然产物化学 通讯作者：谢笔钧（1943-），女，教授，研究方向为天然产物化学
最终导致贮藏物质的消耗利用和新物质及组织生成。近年来，围绕谷物和豆类发芽的研究也越来越多。在
CNKI数据库中搜索发现，2000年以前，食品领域文章中含有“发芽”一词的文献仅有10篇左右，而现在可以达到70余篇。
人们已经认识到燕麦中含有丰富蛋白质（尽管有争议，但有相当一部分研究认为燕麦蛋白属低过敏性）和优质油脂，单不饱和脂肪酸含量高，还发现燕麦中含有1.8%~7.9%的β-葡聚糖[2]，蒽酰胺几乎是燕麦中特有的有益于治疗动脉硬化的多酚[3]。可以说，燕麦是营养丰富、保健功能多样的小杂粮，已经吸引了越来越多研究人员的注意。目前已有一些含有燕麦成分的深加工产品出现在市场。对燕麦进行发芽处理是可进一
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步提升燕麦价值，近年来，国内已有一些研究出现。
淀粉是大部分谷物和豆类种子的主要贮藏物质，发芽对谷物中淀粉会产生什么影响是人们普遍关心的问题之一，这方面已有研究包括发芽对淀粉颗粒外观、溶解度、冻融稳定性、直链淀粉和支链淀粉比例、糊化性质和流变性质等方面的影响。
徐建国等对燕麦发芽过程中淀粉理化特性和相关酶活性的动态变化进行了研究[4~5]，其部分结果与我们先前的研究近似[6]。要对发芽过程中淀粉的理化特性变化做出合理解释，一定程度上还有赖于对淀粉分子结构进行研究。本文采用凝胶渗透色谱，特征黏度法和高效离子交换色谱研究了发芽前后燕麦淀粉分子结构的变化，并评价了淀粉的体外消化性。
中，并搅拌20 min，然后5000 g离心30 min，弃沉淀，上清液注入Sepharose CL-2B色谱柱（XK26，Pharmacia，2.6 cm i.d.×90 cm）。洗脱液为50 mmol/L的NaCl（含0.02%叠氮钠），洗脱速率0.3 mL/min，每管收集3 mL，共收集80管。用硫酸苯酚法在490 nm处测定各管反应物吸光度，并据此绘制洗脱曲线，Origin 8.0软件进行积分计算。
1.3.3 燕麦淀粉的特征黏度测定[8]
以DMSO为溶剂配制浓度为0.1%~0.4%（m/V）的淀粉溶液，用乌氏黏度计在25 ℃下测定不同浓度样品的流出时间t以及DMSO的流出时间t0，然后计算增比黏度（ηsp）、相对粘度（ηr），以c为横坐标，ηsp/c和lnηr/c为纵坐标作图，得两条曲线，再用二次多项式回归后，计算两曲线上截距的平均值作为特征黏度[η]。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂
实验所用裸燕麦品种为晋燕八号，由山西省农科
院高寒植物研究所李刚老师提供。糖苷酶（A3042），α-淀粉酶（A3176），异淀粉酶（I5284）均购自Sigma公司；Sephrose CL-2B色谱柱材料购自Pharmacia公司，其他试剂为分析纯。
1.3.4 淀粉的链长分布[9] 10 mg淀粉分散于2 mL 90%的DMSO溶液置沸水浴20 min，冷却后加入6 mL甲醇混匀，冰浴30 min。然后1000 g离心10 min，再将沉淀用50 mM pH 3.5醋酸钠缓冲液2 mL溶解，沸水浴处理20 min，37 ℃平衡后加入5 μL异淀粉酶脱枝，样品37 ℃反应24 h，然后沸水浴10 min将酶灭活。取冷却后的脱支样品200 μL用2 mL 150 mM的NaOH溶液稀释，再用0.45 μm滤膜过滤，随后注入HPAEC-PAD系统（50 μL样品环）进行分析。流动相由He离子喷溅的蒸馏去离子水配制，流动相A：100 mM NaOH，流动相B：100 mM NaOH于500 mM NaAc。线性因子由Dionex CarboPacTM PA100柱采用梯度洗脱（0~5 min，40% A；5~15 min，70% A；15~50 min，70% A+30% B）柱温35 ℃，流速0.8 mL/min。分析柱前加CarboPacTMPA100保护柱。
1.2 主要仪器设备
0.6 mm乌氏黏度计，浙江椒江市玻璃仪器厂；XK26色谱柱，Pharmacia公司；LC-6A恒流泵，日本Shimadzu；BSZ-160自动部份收集器，上海沪西分析仪器厂；Dioex-DX2500高效离子交换色谱，美国戴安公司。
1.3 实验方法
1.3.1 燕麦发芽与淀粉提取 燕麦发芽方法参见[6]。未发芽燕麦淀粉提取流程为：燕麦粉碎过筛，石油醚脱脂，反复用0.01 M NaOH脱蛋白，滤渣后离心，弃上清和沉淀上层的深色物质，得到的湿淀粉用HCL溶液调节pH至中性，用清水洗涤3次并离心，沉淀物在40 ℃鼓风干燥箱中干燥过夜。干燥后的淀粉研磨成细粉，过160目筛待用。发芽燕麦淀粉的提取办法与未发芽燕麦淀粉提取办法所不同的是，将发芽过程中的燕麦鲜样直接加NaOH溶液在粉碎机中粉碎，再进行其他后续提取过程。
1.3.5 燕麦淀粉的体外消化动力学[10]
100 mg样品加入30 mL Tris-Maleate (pH 6.9)缓冲液和10 mL用该缓冲液配成的含有2.6 U的α-淀粉酶，在37 ℃水浴摇床中孵育0~3 h，每隔一定时间取出1 mL反应混合物置沸水浴灭酶活5 min，随后冷却至室温，加入经0.4 M醋酸钠缓冲液（pH 4.75）100倍稀释的葡萄糖苷酶3 mL，在60 ℃水浴摇床中反应45 min，用DNS法测定葡萄糖含量，葡萄糖含量乘以0.9记为淀粉含量。用方程C=C∞(1-e-kt)拟合淀粉体外水解曲线，得到动力学参数反应平衡时浓度C∞和反应动力学常数k。按下述公式计算水解曲线下面积（Area under curve，AUC）：
AUC=C(tf-t0)-(C/k)[1-exp[-k(tf-t0)]
注：tf为最终的时间（180 min）、t0为反映初始时间（0 min），k为反应动力学常数。
1.3.2 淀粉的相对分子质量分布[7]
150 mg淀粉溶于10 mL 90%（V/V）的二甲亚砜
（DMSO）溶液，从中取出1 mL加入无水甲醇以沉淀淀粉，然后5000 g离心20 min，沉淀复溶于5 mL沸水
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再根据Goni的方法[10]计算体外水解指数HI，然
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后以方程EGI=39.71+0.549×HI计算血糖指数EGI。 达到196.1 g/g，浸泡后的样品次之，为191.0 g/g，原燕麦的特征黏度最小为130.8 g/g，发芽24 h开始淀粉的特征黏度基本是处于整体增大趋势。特性粘度[η]的大小
受相对分子质量、分子形状、溶剂特性和温度等因素的影响。本研究中溶剂和温度保持不变，所以特征粘度的差异只是由于相对分子质量和分子形状的差异。相对分子质量越大，则特征粘度越大，在我们研究的发芽时间段内，淀粉的分子量可能比原燕麦淀粉的相对分子质量大。 1.3.6 数据分析
描述性统计用Origin 8.0软件完成，相关性分析用SPSS16.0软件完成。
2 结果与讨论
2.1 发芽对燕麦淀粉组成的影响
表1 凝胶渗透色谱测定燕麦淀粉中支链淀粉和直链淀粉含量 Table 1 The content of amylopectin and amylose in oat starches measured by SEC 样品 支链淀粉 比例/% 中间级分 比例/% 直链淀粉 比例/% 未发芽燕麦淀粉 55.87±1.48 30.69±0.81 13.44±0.36 浸泡燕麦淀粉 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h 36.71±0.60 25.47±0.42 37.82±0.62 56.26±1.72 24.48±0.75 19.26±0.59 59.92±2.06 19.63±0.68 20.45±0.70 64.01±2.68 17.64±0.74 18.35±0.77 63.04±1.87 18.01±0.54 18.95±0.57 57.11±2.04 20.80±0.74 22.09±0.79 54.84±1.33 19.22±0.47 25.94±0.63 图1 不同发芽时间的燕麦淀粉特征黏度 Fig.1 Intrinsic viscosity of starches from oat germinated for different time.
用Origin 8.0软件对各样品凝胶渗透色谱洗脱曲线进行积分，并计算得到燕麦发芽前后支链淀粉和直链淀粉的变化情况如表1。从中可以看出经过发芽以后，燕麦中直链淀粉的含量明显增加，比未发芽燕麦增加36.53%以上，浸泡样品增加量超过180%，中间级分有所减少，除浸泡样品的支链淀粉含量明显变小外，别的发芽以后样品的支链淀粉含量与原样品相比变化不大。原燕麦淀粉中直链淀粉含量仅为13.44%，浸泡后直链淀粉为37.82%，它是所有样品中直链淀粉含量最高的一个，发芽后直链淀粉最高的是144 h的样品，直链淀粉含量为25.94%。除原燕麦淀粉中直链淀粉低于已有报道和浸泡样品显著高于已有报道外，别的样品中直链淀粉含量均处于已有报道的18%到29%之间[11~12]，中间级分淀粉比支链淀粉包含的链更长，但是高支化度的分子要少[13]。所以，在自然水解过程中，中间级分的水解使支化度进一步降低并以直链淀粉的形式出现可能是导致发芽过程中直链淀粉含量增加的原因。至于浸泡阶段相对于原淀粉来讲，支链淀粉的突然减少和直链淀粉的显著增加的原因尚不清楚，有待进一步研究。
2.3 发芽对淀粉链长分布的影响
图2 发芽对于燕麦中淀粉链长分布的影响 Fig.2 Effects of germination on chain length distribution of oat starches 燕麦淀粉经异淀粉酶酶解后，其链段分布如图2所示，从图2可以看出，在离子交换色谱图上的最小链段的聚合度（DP）为23，随发芽进行DP≤31的链段比例不断减小，DP=32的链段比例基本不变化，而DP≥33的链段随发芽进行比例不断升高。发芽前后长度在27 2.2 发芽对于燕麦淀粉特征黏度的影响 不同发芽时间燕麦中淀粉的特征黏度变化如图1所示。从中可以看出，发芽144 h样品的特征黏度最高 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2014, Vol.30, No.6 以有这样的假设：一是在发芽期间生物自身的水解先选择较短链，而长链不发生变化，这样随着发芽进行，短链的消耗，长链比例升高，短链比例下降；二是两者都发生降解，但是短链的降解速度更快造成短链比例下降，长链比例上升。这里长短链的划分界限是DP=32，大于该值即为长链，小于该值则为短链。无论出现哪一种假设，我们都至少可以肯定，144 h发芽期间生物自身利用以短链为主。 表2 淀粉链长分布与淀粉组成的相关性分析 Table 2 Correlation analysis between distribution of chain length and composition of starch DP3 DP5 Ap Mw Am DP1 -0.85 -0.29 0.07 0.68 DP2 -0.90* -0.60 0.01 0.84 DP3 DP4 DP5 Ap Mw DP2 0.93* 指数为85.08，对应血糖指数为86.42。比较而言，发芽过程降低了燕麦中淀粉的水解指数和血糖指数。 表3 燕麦淀粉体外消化时的平衡浓度（C∞），动力学常数（K）， 水解指数（HI）以及预测血糖指数（GI） Table 3 Equilibrium concentration (C∞), kinetic constant (K), hydrolysis index (HI) of oat starches digested in vitro, and estimated glycemic index (EGI) 样品 C∞ K HI EGI Raw 81.17±6.73 0.04±0.00 102.21±8.47 95.83±7.95 Soaked 67.74±4.39 0.05±0.00 89.45±5.80 88.82±5.76 24 h 48 h 72 h 96 h 63.22±5.17 0.06±0.00 85.08±6.96 86.42±7.07 64.81±3.48 0.06±0.00 87.19±4.68 87.57±4.71 65.51±4.12 0.04±0.00 85.07±5.35 86.41±5.43 69.67±4.45 0.03±0.00 85.96±5.49 86.90±5.55 DP4 -0.99** -0.96** 0.91* 120 h 70.55±5.16 0.04±0.00 88.66±6.48 88.38±6.46 144 h 70.17±4.47 0.03±0.00 87.41±5.57 87.70±5.59 0.35 0.38 -0.30 -0.15 0.24 -0.63 -0.69 -0.74 -0.52 2.5 体外消化与特征黏度以及淀粉组成之间的相关性 表4 燕麦淀粉体外消化动力学参数、特征黏度及分子量分布之间相关性分析 Table 4 Correlation analysis between amylopectin (Ap) and amylose (Am) content, intrinsic viscosity ([η]), and kinetic parameter of digestion in vitro for oat starches Ap Mw Am [η] C∞ K HI Mw -0.52 [η] C∞ K HI GI -0.60 -0.06 -0.22 1 Am -0.84** -0.02 0.60 0.26 -0.82 -0.96** 0.93* 0.90* 0.65 -0.84** -0.02 注：DP1表示DP≤27；DP2表示27 90 -0.24 0.86** 0.09 -0.31 -0.18 -0.27 -0.50 -0.21 0.82** -0.27 -0.31 0.91** -0.13 -0.21 0.82** -0.27 -0.31 0.91** -0.13 注：2-tailed test，**P<0.01，*P<0.1，Mw （medium molecular weight，中间级分）。 直链淀粉分子通常不像支链淀粉分子那样卷得较紧成一个线团，而是更接近链状，在稀溶液状态下，既可以表现出于溶剂分子的摩擦力，还可以更多表现淀粉分子间的相互作用。黏度是分子运动时内摩擦力的量度，直链淀粉含量越高，则淀粉分子间的相互作用越大，黏度就越高。从表4中可以看出，直链淀粉含量和特征黏度有显著的正相关关系，相关系数0.86（P<0.01）。这与燕麦发芽时淀粉非常有限的降解、直链淀粉分子量有限减小，支链淀粉侧链有显著降解的研究报道相一致[16]。而且从链长分布的变化来看，长 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 学报,2012,27(5):27-31 2014, Vol.30, No.6 链比例升高对于黏度的增大也有一定贡献。 燕麦淀粉中间级分对于体外消化指数影响明显，二者呈显著正相关，相关系数0.82（P<0.01）。通常认为，直链淀粉与淀粉消化性之间有密切关系，但汪兰[14]对11个品种大米淀粉体外消化的研究表明，直链淀粉并不是影响淀粉消化性的唯一因素。 XU Jian-guo. 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