d5923e93-bce1-44f4-b7b4-506a704f41c5

①

单链抗备及功能研究

祝怀平　王迎春　季顺东　江　淼　白　霞　阮长耿

(苏州大学附属第一医院江苏血液研究所江苏核医学重点实验室,苏州215006)

　　中国图书分类号　Q78　　文献标识码　A　　文章编号　10002484X(2005)0420308205

[摘　要]　目的:为了研制新型特异性抗血栓制剂。方法:利用噬菌体展示文库技术筛选与vWF2A1区有高亲合力单链

②

抗体(ScFv);基因重组的方法构建高效表达载体pET220b(+)2ScFv,在大肠杆菌中诱导表达;夹心ELISA方法鉴定此单抗的抗原结合活性;瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集试验(RIPA)测定ScFv对血小板聚集的抑制作用。结果:噬菌体展示技术筛选的

ScFv在大肠杆菌中成功地诱导表达,表达的ScFv占菌体总蛋白的41%,以包涵体形式存在;经纯化复性的ScFv可以与vWF、rvWF2A1、rvWF2A1ΠA3结合,但不与rvWF2A3、BSA反应;ScFv具有抑制RIPA功能,抑制率为7317%。结论:在大肠杆菌中高效

表达的噬菌体展示技术筛选的抗vWF2A1区ScFv可特异性与vWF2A1区结合,而抑制瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集,显示出很好的应用前景,为研制新型抗栓药物奠定基础。

[关键词]　vWF;血栓;抗体ΠScFv;表达

Productionofphage2displayedsinglechainFvtovonWillebrandFactorA1domainandstudyofitsbiologicalactivities

ZHUHuai2Ping,WANGYing2Chun,JIShun2Dong,JIANGMao,BAIXia,RUANChang2Geng.ThefirstAffiliatedHos2pitalofSoochowUniversity,JiangsuInstituteofHematology,Suzhou215006,China

[Abstract]　Objective:Fordevelopmentofdrugsforthetreatmentorpreentionofarterialthrombosis.Methods:Thesinglechainanti2bodywithhighaffinitytovWF2A1wasscreenedwithphagedisplaytechnology;andhigh2levelexpressionvector(pET20b2ScFv)wasconstruct2ed,thenwastransformedintoE.coli(DE3),andinducedbyIPTG.SandwichELISAwasappliedtoidentificationoftheScFvbindingtoanti2gens.Ristocetin2inducedplateletaggregationassaywasadoptedtodetecttheinhibitoryeffectoftheScFvonRIPA.Results:HighlevelScFvwasexpressedinDE3,thetargetproteinamountedto41%oftotalprotein,theyieldofScFvwas850mgΠL.Theresultingproteinwasrefoldedbydialysis.TheScFvspeciallyreactedwithvWF,rvWF2A1,rvWF2A1ΠA3,notwithrvWF2A3,BSA,meanwhile,itinhibitedwithanIC50of0.83

μmolΠL,itsmaximalinhibitingratewas73.7%.Conclusion:OurdatasuggestthatthesinglechainantinodywithhighaffinitytovWF2A1pos2

sesscharacteristicofinhibitionofRIPA,anditcouldbeanewagentforthetreatmentorpreventionofarterialthrombosis.

[Keywords]　vWF;Thrombosis;AntibodyΠsignlechainFv;Expression

　　血栓性疾病是严重威胁着人类健康的常见疾病之一,血栓形成是其主要成因。血小板的粘附、聚集和活化是血栓形成的早期环节,在此过程中vonWillebrand因子(vWF)发挥着重要作用,它通过A1、A3区分别与血小板膜糖蛋白(GP)IbΠIXΠV、胶原结合介导血小板粘附聚集于受损的血管内皮下组织,导致血栓形成。vWF是血小板与血管壁胶原之间的桥梁分子,因此阻断vWF在此过程中的作用,可以有效地抑制血栓形成。

本研究通过噬菌体展示文库筛选获得了与vWF2A1区有高亲合力单链抗体,将筛选到的高亲合

①国家自然科学基金资助项目(30070322)②通讯作者

作者简介:祝怀平(1966年-),男,副研究员,博士,主要从事基因工

程抗体的研究。

力ScFv基因克隆到原核高效表达载体pET220b(+)中,转入大肠杆菌中进行诱导表达,获得高产量的ScFv,并对其生物学功能进行研究,为研制特异性抗血栓药物奠定基础。

1　材料与方法

111　材料

11111　质粒和菌株　pUCm2T载体购自Sangon公司,pET220b(+)表达载体为Novagen公司产品,大肠杆菌TG1、BL21(DE3)plys由本室保存。含有抗vWF2A1区单链抗体基因的质粒pHEN212ScFv由本

室应用噬菌体展示技术筛选获得。11112　主要试剂　HindⅢ、XhoⅠ性内切酶、T4DNA连接酶、TaqPlusⅠDNA聚合酶、dNTP均为Promega和MBI公司产品。Penta.His为抗5×组氨

祝怀平等　抗vWF与GPIb2IX结合部位的噬菌体呈现型单链抗备及功能研究　第4期・309・

酸(5×Histidines)鼠源单克隆抗体和Ni2NTAagarose为QIAGEN公司产品。抗人vWF多抗、辣根过氧化物酶标记驴抗鼠(DAR2HRP)为Amershamlifescience公司产品。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(GAM2HRP)为华美公司产品。PCR引物由Sangon公司合成,上游引物:5′2CCAGAAGCTTATGGCCCAGGTGAAACTG23′,5′端含HindⅢ酶切位点,下游引物:5′2TA2ATCTCGAGTGCGGCCGCCCGTTTGAT23′,5′端含Xho

Ⅰ酶切位点。

112　方法11211　噬菌体展示技术筛选分泌特异的噬菌体单链抗体　从vWF2A1免疫小鼠的脾淋巴细胞中提取总RNA,纯化mRNA并反转录成cDNA后,用抗体可变区混合引物扩增全套轻、重链可变区基因,经重叠延伸反应,在体外装配成单链抗体(ScFv),将其克隆至噬菌体载体pHEN1中,构建单链抗体噬菌体抗体库。对抗体库进行5轮“吸附—洗脱—扩增”的富集过程,用重组表达的人vWF2A1区蛋白的纯品包被,phage2ELISA筛选与vWF2A1有高亲合力的克隆。11212　单链抗体基因的扩增　抽提phage2ELISA筛选获得高亲合力含有抗vWF2A1区单链抗体基因的质粒(pHEN212ScFv),依此为模板,用特异引物进行PCR扩增,扩增体系为:模板1μl,10×Taq酶缓冲液5μl,4×dNTPs2μl,上下游引物各1μl,25mmolΠLMgCl22μl,ddH2O37μl,95℃变性5分钟,再加Taq酶1μl,PCR反应的条件是:94℃30秒,60℃45秒,72℃45秒,循环30次,然后,72℃7分钟。取6μlPCR产物在210%琼脂糖凝胶进行电泳观察结果。11213　表达载体的构建　以含有抗vWF2A1区单链

抗体基因的质粒pHEN212ScFv为模板,用特异引物

进行PCR扩增,回收PCR产物;同时将纯化的PCR产物和表达载体pET220b(+)均用HindⅢ、XhoⅠ进行酶切,回收目的基因和载体,用T4DNA连接酶连接;转化TG1,筛选重组质粒pET220b(+)2ScFv,酶切鉴定,测序,将阳性重组质粒转化表达宿主菌DE3。11214　单链抗体的诱导表达和鉴定　挑选单克隆接种于2ml含氨苄和卡那霉素的LB培养基中,37℃震荡培养过夜,次日按5%接种量转入含同样抗生素的LB中,37℃剧烈震荡培养至菌体密度A600为015～018,加入IPTG至终浓度为1mmolΠL,继续培养5小时,离心收集菌体,SDS2PAGE及Westernblot分析表达结果。用PentaHis作为一抗,HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗,具体方法参见文献1。11215　目的蛋白的纯化和体外复性　表达菌体用

Tris磷酸盐缓冲液重悬,超声破碎,离心收集沉淀,

含2molΠL尿素的Tris磷酸盐缓冲液洗涤1次,继而用含8molΠL尿素的Tris磷酸盐缓冲液溶解,离心收

集包涵体裂解液上清,过Ni2NTAResin亲和层析柱,收集目的峰。在含有2mmolΠL还原型谷胱苷肽,012

mmolΠL氧化型谷胱苷肽Tris缓冲液中透析复性2,3

。Bradford法测定蛋白含量。

11216　复性单链抗体的活性测定　夹心ELISA方

法测定4

:将浓度为5μgΠml复性的ScFv包被96孔

板,4℃过夜,分别加入不同浓度(100nmolΠL倍比稀释)的纯化vWF或重组的vWF2A1、vWF2A1ΠA3、vWF2A3蛋白溶液100μl,每个浓度做3个复孔;37℃温育1小时;然后加入兔抗人vWF多抗37℃反应1小时;

再加HRP标记的驴抗兔IgG,温育,显色,测定A490nm值。11217　单链抗体抑制血小板聚集试验　取健康人全血枸橼酸抗凝,分离富含血小板血浆(PRP),调整

血小板数量为2×108ml-1

,不同浓度的ScFv加入到PRP中,37℃孵育10分钟,加入瑞斯脱霉素(终浓度为1125mgΠml),同时用Tris缓冲液加入到PRP中作为阴性对照。血小板聚集仪检测血小板聚集率。

2　结果

211　噬菌体展示的构建和筛选　成功构建了全套

抗vWF2A1单链抗体噬菌体展示文库,文库的容量

为112×107

。通过5轮“吸附—洗脱—扩增”富集过程,phage2ELISA筛选获得1株与vWF2A1有高亲合力的克隆,序列分析符合抗体可变区结构特点,VH、VL基因的Genebank登录号分别为AY342404、AY232405。

212　ScFv基因的扩增　应用自行设计的一对引物

从pHEN212ScFv载体中特异性地扩增出目的基因,

其片段大小与理论计算值完全一致,见图1。213　表达载体的构建　将特异的扩增产物经内切

酶(HindⅢ、XhoⅠ

)酶切后与经同样酶切处理的表达载体pET20b(+)进行连接,获得重组的表达载体

pET20b(+)2ScFv;酶切结果显示目的基因成功插入表达载体,见图2,证明表达载体构建成功;序列分析结果表明,重组ScFvORF序列与预期结果一致。214　重组单链抗体的表达和鉴定　重组的表达载体pET20b(+)2ScFv转化大肠杆菌BL21(DE3)plys,工程菌经1mmolΠLIPTG诱导后,在约28kD处出现一条明显的蛋白带。菌体经超声破碎后的上清和沉淀分别进行SDS2PAGE分析,结果表明,目的蛋白以包涵体形式存在于胞质中,其表达量可达菌体总蛋

・310・白的41%,见图3。Westernblot鉴定有明显的单一条带出现,其分子量与诱导蛋白的大小一致,表明目的蛋白与载体的6组氨酸标签以融合的形式表达,见图4。215　单链抗体的纯化和复性　包涵体经8molΠL尿素溶解后,用Ni2NTA柱进行金属螯合层析,纯化目的蛋白,其纯度在95%以上(图3)。纯化的单链抗体的产量为850mgΠL。复性后目的蛋白的回收率为62%。216　单链抗体的活性　夹心ELISA结果表明,单链抗体具有结合纯化的vWF及重组的vWF2A1、vWF2A1ΠA3,但不与vWF2A3起反应,见图5。此ScFv可以应用于vWF抗原水平的检测。此外,该抗体结合瑞斯脱霉素处理的vWF能力明显强于未经处理组,表明经瑞斯脱霉素处理的vWF分子空间构型发生改变后,更有利于ScFv结合。217　单链抗体抑制血小板聚集　复性的单链抗体可抑制瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集,其抑制率呈

图1　PCR扩增ScFv基因结果

Fig11　AmplifiedresultofScFvgenebyPCR

Note:M1200bpDNAladder;11Negativecontrol;2,31ScFvgene.

图2　重组表达载体的酶切鉴定

Fig12　Identificationofrecombinantvectorbyrestrictionenz2

yme

Note:M1200bpDNAladder;1261pET220b2ScFvdigestedbyXhoⅠ、Hind

Ⅲ;71UndigestedpET220b2ScFv.

中国免疫学杂志2005年第21卷图3　SDS2PAGE鉴定大肠杆菌中表达的ScFv结果

Fig13　AnalysisofrecombinantScFvbySDS2PAGE

Note:11SupernatantofstrainDE3ΠpET220(b)ΠScFvinducedbyIPTG;21Inc2

lusionbodyofstrainDE3ΠpET220(b)ΠScFvinducedbyIPTG;31Pu2rifiedrecombinantproteinofstrainDE3ΠpET22(b)ΠScFvinducedbyIPTG;M1Proteinmolecularmarker(97,66,43,31,21,14kD);4,6,81TotalcellularlysatesofDE3ΠpET220(b)ΠScFvinducedbyIPTG;5,7,91TotalcellularlysatesofuninducedstrainDE3ΠpET220(b)ΠScFv.

图4　Westernblot鉴定重组表达的ScFv

Fig14　WesternblotanalysisofexpressedScFvinengineered

bacteria

Note:11EngineeredbacteriaDE3pET20b2ScFvuninduced;21Engineered

bacteriaDE3pET20b2ScFvinduced;31PurifiedScFv;M1Proteinmo2lecularmarker(97,66,43,31,21,14kD).

图5　ScFv与不同抗原反应的结果

Fig15　ThecharacteristicofScFvreactiontodifferentkindsof

antigen

祝怀平等　抗vWF与GPIb2IX结合部位的噬菌体呈现型单链抗备及功能研究　第4期・311・

图6　抗vWF2A1区ScFv对瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集

的抑制作用

Fig16　Ristocetin2inducedplateletaggregationinhibitedbythe

ScFvtorvWF2A1

Note:11Ristocetin2inducedplateletaggregation;21Inhibitionofristocetin2in2

ducedplateletaggregationbytheScFv(finalconcentration0175μmolΠL);31Inhibitionofristocetin2inducedplateletaggregationbytheScFv(finalconcentration1125μmolΠL).

剂量依赖性,IC50值为0183μmolΠL,在1125μmolΠL时抑制率最高达7317%,见图6。

3　讨论

单链抗体分子量小,只有两对二硫键,易于以包涵体的形式获得高效表达,国外有文献报道将分泌表达的质粒改造为包涵体形式表达,可使其产量提高5～6倍

5

。我们应用pET220b表达系统,通过优

化表达条件,可以将抗体的表达量显著提高可达菌体总蛋白的41%。

我们采用逐步稀释变性剂,使其浓度缓慢降低,并在复性的特定阶段加入一定浓度的氧化型和还原型谷胱苷肽来促进抗体分子中二硫键的形成,取得了较为满意的复性效果。实验结果表明,复性的ScFv具有与血浆vWF和重组vWF2A1特异性结合的

功能,具有抑制瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集功能。同样抗vWF2A1单链抗体与vWF结合也可抑制血小

板膜表面GPIb与vWF间的相互结合,使得vWF介导的血小板粘附聚集和活化过程受到干预,由于vWF介导的血小板粘附聚集和活化过程是在血栓形成早期或初期止血阶段发挥作用。此单抗与抗IIbΠIIIa单抗相比较具有一定的优越性,抗IIbΠIIIa单抗是通过与活化血小板表面的膜糖蛋白IIbΠIIIa复合物结合从而抑制血小板聚集,因此它对生理性和病理性的血小板聚集均产生抑制作用。我们研制的抗vWF2A1单链抗体主要针对病理性血栓形成,对生理

性止血过程的影响很小。所以,引起出血的可能性

比较小。

应用ScFv作为抗血栓制剂与经典的鼠源性单抗相比,有其优点,它只保留了抗体的可变区,分子量明显减少,免疫原性降低,引起变态反应的可能性减少,缺乏Fc端避免了全抗体引起的网状内皮系统对引起血小板的破坏作用,使血小板减少的可能性大为减低。

根据血栓形成的机制,血小板粘附到受损血管(狭窄的动脉和微血管)的内皮下是通过胶原2vWF2血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)轴,vWF成为血小板与胶原之间的桥梁,从而诱发血小板聚集(尤其是在高流变切力)。业已研究表明阻断GPIb或vWF均可抑制血小板粘附暴露的内皮下组织,所以,GPIb2vWF

轴被视为抑制血栓形成的有效靶点628

。针对GPIb的抗体抑制血小板聚集和粘附过程显示了很好的结果,但这些抗体都是识别血小板膜分子,对血小板功能和数量会有不同程度的影响,相反针对vWF的抗体不会有此不良的副作用。国外有文献报道抗vWF2A1Fab可抑制血小板的粘附、聚集和活化作

用,显示出良好的应用前景9

。本研究应用噬菌体展示技术筛选的抗vWF2A1单链抗体,在原核细胞中进行高效表达,通过复性获得了有生物学活性的单链抗体,初步试验结果表明,具有抑制瑞斯脱霉素诱导的血小板聚集作用,有进一步研究开发的价值。体内抑制血小板粘附、聚集的作用需要在动物体内实验加以验证。

4　参考文献

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(下转第314页)

・314・图2　TNF2α干预组小鼠心肌病变(HE×400)

Fig12　MyocardialchangeinmiceofTNF2

αinterventiongroup(HE×400)

3　讨论

研究发现TNF2

α是一种具有多种生物活性的细胞因子,参与了多种病理过程,与许多疾病有关2

。

TNFα2

与炎症反应有关,参与了宿主防御病原体并能调节免疫反应。它可以介导凋亡或坏死性的细胞

溶解。TNF2

α对成熟的心肌细胞及乳头肌细胞还有浓度依赖性的负性肌力作用3,4

。

VMC的发病机制尚未完全阐明,目前多认为是病毒直接侵犯心肌和免疫变态反应所致,但其具体的免疫发病机制却不清楚。近年来研究表明在

VMC中TNF2

α表达明显升高,它在VMC的心脏损伤和发病机制中可能起作用528

。Kubota等5

报道

TNF2

α在心脏中过度表达可导致严重的心肌炎变和心脏肥大,表明心肌TNF2α的异常表达与心脏功能障碍的发病有关。Sato等

6指出在CVB3诱发的

VMC中,TNF2

α等细胞因子的释放可导致心肌细胞的损害。Yamada等7

的实验也表明TNF2

α在VMC的免疫反应和发病机制中起重要作用。在本研究

中,①VMC小鼠血清中TNF2

α水平明显升高,对VMC小鼠心肌炎细胞浸润和坏死半定量的评分与

(上接第311页)

7　IkedaY,HandaM,MurataMetal.Anewapproachtoantiplateletthera2py:inhibitorofGPIbΠIXΠV2vWFinteractionJ.Haemostasis,2000;30(3):44252.

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Willebrandfactor2collageninteractionbyanantihumanvWFmonoclonalantibodyresultinabolitionofinvivoarterialplateletthrombusformationinbaboonsJ.Blood,2002;99:362323628.

中国免疫学杂志2005年第21卷TNFα2

血清水平进行直线相关分析的结果表明,VMC心肌的病变(炎细胞浸润和坏死)与TNF2α的水平有关。②外源性的TNF2

α干预组(E2组)心肌炎细胞浸润和坏死较单纯VMC组(E1组)明显加重,小鼠死亡率也较E1组高,说明外源性的TNF2α亦可加重VMC。③TNF2

αmAb干预组(E3组)小鼠心肌炎细胞浸润和坏死较E1组明显减轻,小鼠死亡率也较E1组明显减低,说明给予TNF2

αmAb中和体内TNF2

α后能减轻VMC病变。综上所述说明TNF2α在VMC的免疫反应和发病机制中起了一定作用,能促进VMC的发病(参与了VMC的心肌损伤)。至于

TNF2

α是通过什么机制对VMC的发病产生作用将有待于进一步探讨。

4　参考文献

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[收稿2004205212　修回2004208210

(编辑　曲　莉)

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[收稿2004203228　修回2004209215

(编辑　许四平)