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学 位 论 文
缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏内质网应激
及炎症反应的抑制作用
Inhibitory effect of Valsartan on the endoplasmic reticulum stress and inflammation in the kidney of diabetic rats
指导教师姓名 申请学位级别 硕士 专业名称 内科学（肾病）
提交论文日期 2015-03 论文答辩日期 2015-05
学位授予单位和日期 安徽医科大学 2015-07
答辩委员会主席
评 阅 人
XXX
xxx 副教授
2015 年 月
学位论文独创性声明
本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成
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果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。
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学位论文作者签名： 导师签名：
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目 录
中英文缩略词表 .......................................................................................................... 2 中文摘要 ........................................................................................................................ 3 英文摘要 ........................................................................................................................ 5 前言 ................................................................................................................................. 8 材料和方法 ................................................................................................................. 11 结果 ............................................................................................................................... 20 讨论 ............................................................................................................................... 27 结论 ............................................................................................................................... 35 参考文献 ...................................................................................................................... 36 综述及参考文献 ........................................................................................................ 41
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中英文缩略语表
缩写 英文名称 中文名称 DN diabetic nephropathy 糖尿病肾病 ERS endoplasmic reticulum stress 内质网应激 UPR IRE1 PERK ATF6 ERAD GRP78 JNK MCP-1 NF-κB STZ XBP-1 ROS TRAF2 ESRD ACEI ARB
unfolded protein reaction inositol requiring kinase-1 protein kinase-like ER kinase Aetivating Transeription Faetor6 ER-associated degradation glueose-regulatedProtein78 c-Jun NHZ tenninal kinases Monocyte chemotactic protein-1 Nuclear factor-κB Streptozotoein StrePtozocin X-box binding protein l reactive oxygen species tumor neerosis factor receptor
assoeiated faetor2 End-stage renal disease Angiotensin-converting enzyme inhibitor Angiotensin Ⅱ receptor blocker 2
未折叠蛋白反应 肌醇依赖酶1
双链RNA-依赖的蛋白激酶样
内质网激酶
活化转录因子6 内质网相关性降解途径 葡萄糖调节蛋白78 c-Jun氨基末端激酶 单核细胞趋化蛋白-1 核因子 κB 链脲佐菌素 X盒结合蛋-1 活性氧簇 肿瘤坏死因子受体相关因子2
终末期肾脏病 血管紧张素转换酶抑制剂 血管紧张素Ⅱ受体抑制剂 安徽医科大学硕士学位论文
缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏内质网应激
及炎症反应的抑制作用
中 文 摘 要
目的 糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常见并发症，同时也是糖尿病患者死亡的一个主要原因，其发病率一直呈逐年升高趋势，目前已成为我国导致终末期肾病的第二大因素。近年的研究认为，DN是一种慢性炎症性疾病，但其炎症反应发生的原因尚未明确。内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）已被证实与炎症反应密切相关，可能在DN的炎症反应中起到一定作用。本研究拟通过构建糖尿病大鼠模型，探讨内质网应激及相关炎症反应在糖尿病大鼠肾脏损害中的作用及血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦对DN大鼠肾脏中ERS及相关炎症的影响。
方法 34只SD雄性大鼠，随机分为对照组（Con组，n=10只）、模型组（DM组，n=12只）、缬沙坦治疗组（DM+V组，n=12只）。DM组、DM+V组大鼠腹腔注射STZ40mg/kg，制作糖尿病模型，各组大鼠给予普通饲料喂养，DM+V组每天用缬沙坦灌胃6周（10 mg/kg），Con组及DM组只灌等量蒸馏水，共6周。实验结束后测量大鼠体重、双侧肾脏重量，应用免疫组化法检测ERS标志蛋白GRP78及中性粒细胞趋化因子1（MCP-1）的蛋白表达及定位，Western blot方法检测ERS相关蛋白P-IRE1α、JNK、P-JNK、NF-κB p65、P-NF-κB p65蛋白表达水平，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测肾组织中JNK、NF-κB 及炎症因子MCP-1、TNFα、IL-1βmRNA表达变化，同时观察各组大鼠24小时尿蛋白定量、血浆白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）等指标的变化。
结果 1、与Con组相比，DM组大鼠24小时尿蛋白定量、BUN、Scr水平明显升高（P<0.05），ALB明显降低（P<0.05），与DM组相比，DM+V组24小时尿蛋白定量、BUN明显降低（P<0.05），ALB明显升高（P<0.05），Scr较DM组降低但无统计学意义（P＞0.05）；2、HE染色光镜下Con组肾组织未见明显病理改变，DM组大鼠肾小球系膜细胞增殖肥大，系膜区增宽，系膜基质聚积,肾小球基底膜增厚，肾小管上皮细胞
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广泛空泡变性，并可见炎细胞浸润，DM+V组与DM组相比，系膜细胞增殖肥大、系膜基质聚积、肾小管上皮细胞广泛空泡变性均减轻；3、免疫组化显示Con组GRP78轻度表达、MCP-1几乎无表达，与Con组相比，DM组GRP78、MCP-1表达明显升高（P<0.05），且肾小管上皮细胞呈强阳性表达，与DM组相比，DM+V组GRP78、MCP-1表达明显降低（P<0.05）；4、Western blot方法显示，与Con组相比，DM组P-IRE1α、P-JNK、P-NF-κB p65蛋白表达水平明显升高（P<0.05），与DM组相比，DM+V组P-IRE1α、P-JNK、P-NF-κB p65蛋白表达水平明显降低（P<0.05），且P-JNK、P-NF-κB p65与P-IRE1α蛋白表达程度呈正相关（P<0.05）；5、qRT-PCR方法显示：与Con组相比，DM组MCP-1、IL-1β、NF-κB p65、TNFαmRNA表达明显升高（P<0.05），与DM组相比，DM+V组MCP-1、IL-1β、NF-κB p65、TNFαmRNA表达明显降低（P<0.05），3组间JNKmRNA表达变化无明显差异（P＞0.05）。
结论 1、DN中存在ERS的激活，活化的膜蛋白P-IRE1α通过激活JNK及NF-κB炎症信号通路引起炎症反应；2、与NF-κB通路相比，JNK通路的激活可能更易受ERS的影响，ERS对JNK的激活占主导地位；3、缬沙坦可以通过抑制内质网膜蛋白IRE1介导的JNK及NK-κB信号通路起到减轻炎症反应的作用。 关键词 内质网应激 炎症反应 糖尿病肾病 缬沙坦
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Inhibitory effect of Valsartan on the endoplasmic reticulum stress and inflammation in the kidney of
diabetic rats
Abstract
Objective：Diabetic nephropathy ( DN) as one of the most serious microvascular complications in diabetes has become the second factor leading to end-stage renal disease at present，and its incidence is rising year by year. In recent years, the view that DN is a chronic inflammatory disease has been recognized widely. But the cause of the inflammation reaction is not clear. Endoplasmic reticulum stress (endoplasmic reticulum stress, ERS) has been proved to be associated with inflammation closely, and may play a role in inflammation of the DN. In this experiment，we built the diabetic rats model to study the role of endoplasmic reticulum stress and related inflammation in kidney damaged diabetic nephropathy rats and the effect of Valsartan .
Methods：Among 34 healthy male SD rats，they were randomly divided into control group (Con group, n = 10), model group (DM group, n = 12) and valsartan treatment group (DM + V group, n = 12). The rats of DM group and the DM + V group were intraperitoneally injected STZ（40mg/kg）for diabetes animal model. Valsartan(10mg/kg)was administered daily by gavage from the next day of the induction to diabetes for 6 weeks. The rats of DM + V group were intragastrically administered with valsartan (10 mg/kg) every day, while Con and DM group were only given the equivalent distilled water for 6 weeks.After the experiment, the weight of the rats and kidney were measured.The expression and distribution of ERS related protein GRP78 and Monocyte chemotactic protein-1(MCP-1) was examined by immunohistochemistry,The expression of ERS related protein P-IRE1α,P-JNK,JNK, NF-κB p65,P-NF-κB p65was examined by Western blot. Real－time fluorescence quantitative PCR was used to detect the mRNA expressions of JNK，NF-κB and MCP-1，TNFα，IL-1β. 24 hour urine protein excretion, plasma albumin，Scr,BUN were checked，meanwhile.
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Results: 1, compared with Con group, 24 hours urinary protein quantitative, BUN, Scr of DM group rats increased significantly (P < 0.05), ALB decreased (P < 0.05), compared with DM group, 24 hours urinary protein quantitative, BUN of DM + V group decreased significantly (P < 0.05), ALB increased significantly (P < 0.05), Scr reduced in the DM group without statistical significance (P > 0.05); 2, Glomerular and tubular in Con group had no significant changes,in the DM group,we found that glomerular extracellular matrix hyperplasia,mesangial matrix markedly increased, basement membrane thicken, mesangium gap widened, renal tubular epithelial vacuoles degeneration with partial stove atrophy, mild interstitial edema, glomerular and interstitial inflammatory cell infiltration. compared with DM group, DM + V group appeared the reduction of mesangial cell proliferation, renal tubular epithelial vacuoles degeneration; 3, immunohistochemical appeared that GRP78 expressed mildly, MCP - 1 almost was no expression in the Con group, compared with Con group, the expression of MCP-1 increased significantly (P < 0.05), and strong positive expression in renal tubular epithelial cells. compared with DM group, DM + V group appeared that expression of GRP78, MCP-1 decreased significantly (P < 0.05); 4 ,Western blot method showed that compared with Con group, the expression of P-IRE1α、P-JNK、P-NF-κB p65 increased significantly in DM group (P < 0.05), compared with DM group, expression of P-IRE1α、P-JNK、P-NF-κB p65 significantly decreased in DM + V group (P < 0.05), and expression of P-IRE1α、P-JNK、P-NF-κB p65 were positively correlated (P < 0.05);qRT - PCR shows that: compared with Con group, the mRNA expression of MCP-1、IL-1β、NF-κB p65、TNFα increased significantly in DM group (P < 0.05), compared with DM group, the mRNA expression of MCP-1、IL-1β、NF-κB p65、TNFα decreased significantly in DM group (P < 0.05), While there is no significant difference in the expression of JNK mRNA and protion among three groups (P > 0.05).
Conclusion: 1, ERS and related inflammation was activated in the kidney of DM rats, and the activative membrane protein P-IRE1α caused inflammation by activating JNK and NF-κB inflammatory signaling pathways ; 2, compared with the NF-κB pathway, the activation of JNK pathway may be more sensitive to the effects of ERS, ERS activate JNK pathway dominantly. 3, Inhibition of the JNK and NF-κB signaling pathway and related inflammation might be responsible for the renal protection effects of
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Valsartan.
Keywords: endoplasmic reticulum stress/ inflammatory response /diabetic nephropathy / valsartan
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缬沙坦对糖尿病大鼠肾脏内质网应激
及炎症反应的抑制作用
1 前 言
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常见并发症，同时也是糖尿病患者死亡的一个主要原因，进入大量蛋白尿期以后，治疗相当困难，肾功能损害进展迅速，一般5-10年即可进入终末期肾衰竭[1]。2012年国际糖尿病联盟公布，全世界糖尿病患者已超过3710万[2]。据统计，每个糖尿病患者，10-20年后蛋白尿发生率竟高达47.66%[1]。糖尿病肾病的发病机制十分复杂，目前尚未完全明确，给临床治疗带来了很大困难，因此，探讨DN的发病机制具有重要的临床意义。
目前研究发现，糖尿病肾病的发病机制可概括为：蛋白激酶C（PKC）、氧化应激（ROS）、细胞因子、遗传分子以及炎症学说。其中炎症学说倍受关注，并认为微炎症反应和随后的细胞外基质扩张是上述其它机制在糖尿病肾病进展中的共同途径，炎症在糖尿病肾病的进展中发挥着核心作用[3]。糖尿病患者肾脏中的高糖环境及糖基化终末产物都是强烈的炎症趋化因子刺激物，这些趋化因子包括白介素-8（CXCL8）、INF-γ趋化蛋白（CXCL10）、中性粒细胞趋化因子1（MCP-1）。这些趋化因子会招募巨噬细胞到肾脏，同时巨噬细胞直接分泌TNF-α、IL-1、IL-6、活性氧（ROS）、血纤维蛋白溶解酶原催化因子1（PAI-1）、金属蛋白酶、转化生长因子β（TGF-β）、血管紧张素II和内皮素等细胞因子和炎性介质[4],引起炎症反应的循环，促进肾小球硬化[5]。
但是多年以来，DN中的炎症反应是如何被激活的，一直困扰着人们。直到2006年，Hotamisligill[6]第一次提出了代谢性炎症(metaflammation)的概念，为阐释DN的发病机制及其与免疫和炎症的关系开启了一个全新的思路。同时对代谢性炎症的特点进行了描述。DN中的炎症也属于代谢性炎症(metaflammation)的范畴，与传统经典意义上的炎症反应不同，它不是由病原菌引起的而是由摄入过多的营养物质和代谢过度负担导致的低水平的慢性不典型炎症，无红肿热痛等表现。然而，糖尿病肾病免疫炎症代偿性活化的具体机制尚不明确。内质网应激的发现恰
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当地解释了炎症激活的具体途径。
内质网( endoplasmic reticulum， ER)是对蛋白质进行折叠、修饰、降解分泌及贮存Ca2+的场所，对外环境刺激非常敏感。不同的病理及生理的刺激，如营养物质缺乏、营养物质过剩、感染、酸中毒、高同型半胱氨酸、氧自由基、缺氧、内质网Ca2+释放剂及抑制剂、重金属、蛋白糖基化与折叠抑制剂等，都会干扰内质网内正常蛋白的折叠或导致错误折叠蛋白的聚积，破坏内质网内Ca2+稳态，内质网这种功能异常的状态被称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[7]。未折叠蛋白和错误折叠蛋白的聚积将会诱导细胞毒性反应造成损伤。于是，内质网启动错综复杂的信号网络来应答未折叠蛋白的积累，包括调节内质网膜结构和分泌蛋白产生的能力[8]、上调内质网分子伴侣蛋白表达、促进内质网相关性降解(ER-associated degradation，ERAD)途径的激活等[9]，这种内源性保护机制在1988年被命名为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），适度的ERS可以恢复ER及内环境稳态，保持细胞活性，但当外界刺激因素持续存在时，过强或过长时间的ERS将最终导致细胞的炎症反应及凋亡[10]。ERS能够激活内质网膜上的三种跨膜蛋白来启动URP诱导凋亡，这三种蛋白分别是肌醇依赖酶1（inositol requiring kinase-1，IRE1）、双链RNA-依赖的蛋白激酶-样内质网激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase-like ER kinase，PERK)、活化转录因子 6(activating transcription factor-6，ATF6)。其中IRE1α与炎症信号激活关系最为密切，体外研究中发现，活化的IRE1α可以诱导NF-κB及JNK通路的激活，从而引起相关炎症反应。
既往的研究表明内质网应激是多种代谢性疾病如慢性心脑血管疾病、神经性病变、胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖、脂肪肝等发生发展的中心环节[11-12]，同时ERS还具有分子信号整合器的功能，可以同炎症反应、氧化应激、细胞凋亡，蛋白质合成降解等多种信号通路相偶联[13]。糖尿病肾病属于代谢性疾病的范畴，近年来已有部分研究证实糖尿病肾病中存在ERS的激活，但以往的研究局限于固有细胞凋亡的研究，对于DN中ERS与炎症反应的关系研究较少。
本研究拟通过对大鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ），建立糖尿病大鼠模型，观
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察大鼠血糖、血肌酐、尿蛋白、及肾脏组织病理变化确认DN模型建立成功，同时观察ERS激活的标志性蛋白GRP78、内质网膜蛋白IRE1α的表达变化，验证DN中ERS状态的存在，观察NF-κB及JNK介导的炎症通路相关蛋白的表达变化，探讨DN中ERS与炎症反应的关系。
关于DN的治疗，已有学者针对炎症反应机制对DN进行了尝试性治疗。如糖尿病肾病患者服用免疫抑制剂雷公藤多苷后，其尿蛋白量可明显减少。进一步肯定了针对炎症反应机制在临床实践中治疗糖尿病肾病的临床意义。但是雷公藤性腺抑制等副作用限制了其应用。免疫抑制剂治疗DN的安全性目前仍饱受争议。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物(angiotension lI receptor blocker，ARB)，是临床治疗DN应用广泛、较为安全的药物，对糖尿病肾病特别是微量蛋白尿阶段的治疗有明显的效果。有趣的是，越来越多的研究表明，ARB类药物具有抑制炎症反应的作用。研究表明，缬沙坦[14]具有降低CRP、IL- 6 等炎症因子的作用，然而其作用机制尚未完全明了。本研究从内质网应激的角度，应用缬沙坦对糖尿病大鼠进行干预治疗，观察缬沙坦对早期糖尿病大鼠肾脏内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1α、NF-κB、JNK及其下游炎症因子表达的影响，探讨其抑制炎症反应的相关机制。为靶向性的内质网应激抑制剂应用临床治疗糖尿病肾病提供理论基础。
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2材料和方法
2.1 材料和试剂 2.1.1实验动物
SPF级SD雄性大鼠34只，体重190-210g，购自北京市维通利华实验动物有限公司【SCXK（京）2011-0011】。动物房室温控制在18-28℃，同时保持12小时昼夜循环，实验过程中动物自由饮水进食。 2.1.2主要试剂
（1）10%水合氯醛：北京军区总医院 （2）4％中性甲醛：北京化工厂
（3）链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：美国Sigma公司 （4）缬沙坦：北京诺华制药有限公司 （5）PMSF：美国Sigma公司 （6）脱脂奶粉：华兴博创公司
（7）BCA蛋白定量试剂盒：碧云天生物技术有限公司 （8）ECL显影剂：普利莱公司
（9）DAB显色试剂盒：北京中杉金桥公司
（10）SP超敏试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司
（11）兔抗鼠P-IRE1α抗体，兔抗鼠P-JNK抗体，兔抗鼠P-NF-κB p65抗体：
美国Abcam公司
（12）兔抗鼠GRP78抗体，兔抗鼠JNK抗体，兔抗鼠NF-κB p65抗体：美国Santa
Cruz公司
（13）兔抗鼠MCP-1抗体：北京博奥森公司
（14）羊抗小鼠二抗，羊抗兔二抗，小鼠抗GAPDH单抗：北京中杉金桥公司 （15）Trizol试剂盒：美国Invitrogen公司
（16）RNA逆转录试剂盒：北京天根生化科技有限公司 2.1.3主要仪器及耗材
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（1）精确天平：(上海第二天平仪器厂) （2）低温离心机：长沙英泰仪器有限公司 （3）恒温磁力搅拌棒：上海司乐仪器有限公司 （4）电热恒温水浴锅：上海医用恒温设备厂 （5）恒温摇床：北京白鸽医疗仪器厂 （6）电泳仪：Bio-Rad公司 （7）转膜仪：Bio-Rad公司
（8）简易血糖仪及试纸：美国罗氏公司 （9）图像扫描仪：Canon公司
（10）相差倒置显微镜：德国Leica公司
（11）生物组织包埋机：TB-718湖北泰维医疗科技有限公司 （12） 烤片机：德国Leica公司 （13）石蜡切片机：德国Leica公司 （14）X光胶片：日本富士公司 （15）硝酸纤维素膜：Millipore公司 （16）qRT-PCR仪（美国IBM公司） 2.2 实验方法 2.2.1模型制备及分组
34只SD雄性大鼠，随机分为对照组（Con组，n=10只）、模型组（DM组，n=12只）、缬沙坦治疗组（DM+V组，n=12只）。各组大鼠适应性喂养一周后，DM组、DM+V组大鼠腹腔注射STZ（STZ 溶于10mmol/L 的柠檬酸盐溶液，PH 为4.5，40mg/kg）制作糖尿病模型，Con组只注射相同体积的枸橼酸钠缓冲液，尾静脉取血连续3天，测定空腹血糖≥16.7mmol/L，确定为糖尿病大鼠。对照组血糖4～6mmol/L 左右。所有大鼠试验期间不用外源性胰岛素，避免胰岛素干扰实验过程。DM+V组每天用缬沙坦灌胃6周（10 mg/kg），Con组及DM组只灌等量蒸馏水。实验期间动物自由进食。
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2.2.2实验动物标本留取与检测 2.2.2.1 血清学指标检测
在给药6周后处死全部大鼠，10%水合氯醛麻醉后，将大鼠置于鼠台上，沿腹中线切开腹腔，找到下腔静脉，直视下腔静脉取血5ml。以3000rpm，4℃条件下离心10min，取血清送我院检验科。检测血肌酐、血尿素氮、血浆白蛋白、血糖水平。 2.2.2.2 24小时尿蛋白定量测定
第6周处死前先用试纸条法行定性检测，再分别将大鼠放入代谢笼中，采集24 h尿液, 检测24 h尿蛋白定量。 2.2.2.3 肾脏组织标本留取
开腹后直视下找到双肾及肾周筋膜，予以剥离双肾，止血钳夹闭肾蒂切除双侧肾脏，放入PBS缓冲液中洗去残留血迹并称重，部分肾组织以10%甲醛固定用于免疫组化和肾脏病理检测，其余组织切成小块，迅速放入液氮中，再置于-80℃冰箱中冻存，用于western blot检测蛋白表达。 2.2.3 HE染色病理观察
A．修片：于10%甲醛溶液中取出组织块，按照0.3cm3的标准切成小块； B．脱水：将组织块依次放入75%酒精→85%酒精→95%酒精→100%酒精Ⅰ→100%酒精Ⅱ梯度脱水，各40min；
C．包埋：将组织块浸入氯仿中40min透明，再侵入石蜡中2小时左右； D．切片：用切片机连续切出厚度为2-3μm薄片；
E．染色：将切好的片子依次置于：二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→100% 酒精Ⅰ→100%
酒精Ⅱ→95% 酒精→90% 酒精→80% 酒精→70% 酒精(各15min) →蒸馏水冲洗；苏木素染细胞核1～2min，流水洗3 min；放入1%盐酸乙醇分化几秒钟，水洗；放入氨水中返蓝几秒钟，水洗；
F. 梯度酒精脱水：75% 酒精→85% 酒精→95% 酒精→100% 酒精Ⅰ→100% 酒
精Ⅱ(各10min)；
G．二甲苯透化，中性树胶封片； H．用光学显微镜观察肾脏病理改变；
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2.2.4 免疫组织化学方法检测肾脏组织GRP78和MCP-1的表达及定位 A．将组织片放置在附着多聚赖氨酸的载玻片上过夜，防止脱片；
B．二甲苯脱蜡：二甲苯Ⅰ(10min)→二甲苯Ⅱ(10min)→100%乙醇Ⅰ(10min)→100%乙醇Ⅱ(10min)→95%乙醇(5min)→90%乙醇(5min)→85%乙醇(5min)→75%乙醇(5min)→自来水冲洗→PBS洗两次；
C．取出片子擦干水渍，滴加1滴3%双氧水,置于室温15min,PBS冲洗2min×
3次；
D．组织抗原热修复：压力锅中加入pH=6.0柠檬酸盐缓冲液至沸腾，将切片
浸入液面以下，加热2.5min后，取出切片，冷却至室温后，PBS冲洗5min×4次；
E．加入1滴小牛血清进行封闭15min，室温下静置；
F．加入1滴一抗：分别滴加兔抗鼠GRP78抗体（1:75）、兔抗鼠NCP-1抗体
(1:100)，4℃保湿盒内过夜， PBS替代一抗做阴性对照，PBS洗5min×3次；
G．加入1滴辣根酶标记的羊抗兔二抗，室温，湿度箱内20min，PBS洗5min×3
次；
H．加入聚合物辅助剂，再置于室温20min，PBS洗5min×3次； I．滴加1滴DAB显色液，显微镜下观察1-3分钟；
J．自来水冲洗终止反应，苏木素复染1min →自来水冲洗 →1%盐酸乙醇浸润
5秒→自来水冲洗→1%氨水浸5秒→自来水冲洗 →85%酒精→90%酒精→ 95%酒精→100%酒精→自来水冲洗→二甲苯浸3min； K．中性树胶封固，通风橱内24小时； L．光学显微镜下观察并照相。
2.2.5 Western blot检测活化的内质网膜蛋白P-IRE1α及相关炎症通路蛋白JNK、P-JNK、NF-κB p65、P-NF-κB p65 的蛋白表达 2.2.5.1 组织蛋白的提取
（1）将0.2g肾组织块用干净剪刀尽量剪碎，置于匀浆器的球部，加入400 l含有
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PMSF的RIPA 裂解液，进行匀浆，置于冰上20min；
（2）在冰上研磨冰浴5min后，放在冰上，反复几次直到碾碎组织；
（3）30 min后裂解完毕，将裂解液移至1.5ml离心管中，离心15min ，12000rpm，
4℃，取上清分装在0.5ml离心管中；
（4）取10µl进行蛋白浓度检测，其余分装入0.5ml离心管中，-70℃冻存。 2.2.5.2 BCA法测定蛋白质浓度
（1）取96孔板，外周一圈孔弃去不用，每个蛋白设置一个复孔，设置五个孔标准
蛋白梯度，分别为750µg/ml，500µg/ml，250µg/ml，125µg/ml，62.5µg/ml； （2）配置BCA工作液：将A液B液按照50:1的比例配置所需量的BCA工作液，标准蛋
白和待测蛋白每孔加入200µl；
（3）将待测蛋白分别按1:50、1:100稀释后，各取25µl加入到96孔板中； （4）将96孔板安放在恒温水浴箱中，37℃，2小时； （5）显色后的96孔板安放在酶标仪中，读数。 2.2.5.3 蛋白质变性
（1）配置2×SDS上样缓冲液：20%SDS 2ml，溴酚蓝0.5ml，1M DTT 1ml，甘油2ml，
0.5M Tris pH 6.8 2ml，ddH2O 2.5ml；
（2）蛋白样品中加入等体积的上样缓冲液，放入95℃的水浴锅中煮沸5min，后放
入-20℃冰箱保存；
2.2.5.4 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：
（1）清洗玻璃板：用洗洁剂轻轻擦洗，玻璃板两侧均用自来水冲洗，再反复用反
渗水冲洗，立位晾干；
（2）灌制胶板:先装好电泳槽及玻璃板，按下面表格（表1）配置10%的分离胶，
灌入分离胶后，立即用正丁醇封胶，约0.5-1h后分离胶凝固后，配置5%的浓缩胶，倒出正丁醇，灌入浓缩胶，立即插入点样梳，置于4℃冰箱中过夜，次日拔出点样梳；
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表1.SDS-聚丙酰胺凝胶配方表
组分 30%丙烯酰胺 1.5mol/LTris（PH8.8） 10%过硫酰胺 10%SDS TEMED H2O 总量
10%分离胶 5.0ml 3.8ml 0.15ml 0.15ml 0.006ml 5.9ml 15ml
组分 30%丙烯酰胺 1mol/LTris（PH6.8） 10%过硫酰胺 10%SDS TEMED H2O 总量
5%浓缩胶 0.83ml 0.63ml 0.05ml 0.05ml 0.005ml 3.4ml 5ml
（3）上样：将做好的胶板放入电泳槽里，导入甘氨酸电泳缓冲液，没过梳子，
轻轻垂直拔出点样梳，将蛋白样品按每孔50µg蛋白量的体积进行上样，保证每样本蛋白上样量相等，体积不等时用1×上样缓冲液补齐，蛋白Maker每孔5ul，同样用1×上样缓冲液补齐；
（4）电泳：首先给予恒定电压60V，直到溴酚蓝跑至分离胶，调整电压为90V，
直到溴酚蓝刚刚跑出即终止电泳，转膜。 2.2.5.5 转膜
（1）带手套，将准备好的硝酸纤维素膜切成与待转凝胶同样大小，同时准备同
样大小的滤纸6张，一起置于转膜液中；
（2）卸下分离胶，按照以下顺序排列夹层：由下到上依次是海绵垫、3张滤纸、
凝胶、硝酸纤维素膜、3张滤纸、海绵垫，注意放置每一层时赶出每层气泡； （3）将转印夹放入转移槽中，注意凝胶靠近阴极，硝酸纤维素膜靠近阳极。在
转移槽外放入冰块降温，调至恒流250 mA，150 min；
（4）用1×丽春红染液染膜5min（在脱色摇床摇动）。然后用水洗去多余的染液，
观察膜上的蛋白，去离子水漂白条带。 2.2.5.6封闭
（1）用TBS配置出6%的脱脂牛奶10ml导入平皿中；
（2）将转好的蛋白膜置于平皿中，摇床摇1-2小时，然后4℃过夜； 2.2.5.7免疫反应及显色
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（1）封闭后的硝酸纤维素膜用TBS漂洗5min×3次；
（2）用TBS稀释一抗，滴度分别为：兔抗大鼠P-IRE1α抗体（1：400）、兔抗大
鼠P-JNK抗体（1：200）、兔抗大鼠JNK抗体（1：250）、兔抗大鼠P-NF-κB p65（1:500）、兔抗大鼠NF-κB p65（1:800）、小鼠抗大鼠GAPDH抗体（1：3000），37℃孵育2h，然后4℃过夜； （3）TBS洗膜，5min×3次；
（4）将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（1:8000）或羊抗鼠抗体（1:5000）
加入洗好的膜上, 37 ℃孵育2h； （5）再用TBS漂洗5min×3次；
（6）将ECL发光液、A液和B液等体积混合，将硝酸纤维素膜浸没于 ECL 化学发
光液中显色 ，进入暗室进行曝光，曝光时间为1到5min；
（7）用ImageJ分析系统软件对Western条带进行定量分析,确定杂交条带的吸光
度值。以目的蛋白条带和内参照GAPDH条带吸光度值的比值表示各蛋白表达量；
2.2.6 利用qRT-PCR检测DM大鼠肾脏组织中JNK、NF-κB p65及下游炎症因子MCP-1、
TNFα、IL-1βmRNA的变化 2.2.6.1提取组织总RNA
（1）所有实验器具均经RNase处理，从-80℃冰箱中取出冻存的大鼠肾组织（约
100mg），置于研钵，加液氮研磨成粉末，加入Trizol试剂 1ml轻轻吹打，在转移至2mlEP管中3-5min；
（2）向EP管中加入0.2ml氯仿，上下颠倒震荡混匀30秒，冰浴10-15min； （3）12000rpm离心，4℃，10min；
（4）吸出上层含有RNA的液体，转移至EP管中，加入相同体积的异丙醇，混匀，
冰浴30min；
（5）12000rpm 离心，4℃，15min，弃上清；
（6）加入1ml 75% DEPC乙醇洗涤，再次12000rpm离心，4℃，15min，弃上清； （7）12000rpm离心，4℃，1min，吸出残余液体；
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（8）开盖，置于通风橱中，使乙醇自然挥发；
（9）加入30µl DEPC水小心吹打溶解沉淀，取出一定溶解物进行逆转录反应，剩
下溶液放回-80℃冰箱冻存。 2.2.6.2逆转录（PT）反应
（1）将样品稀释50倍用紫外线分光光度计测浓度，计算RNA浓度； （2）用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA模板；
反应体系：总体积 20µl，其中 RNA 5µg，2×ES Reaction Mix 10µl，dT18
1µl，RIES Mix 1µl，补水至20µl。
反应条件：42℃ 延伸 35min，后转为80℃ 5min。 2.2.6.3 Real time PCR反应 （1）PCR所用引物序列（表2）
表2 所用引物序列
基因 JNK
引物序列
F：5' - TGATGACGCCTTACGTGGTA -3' R：5' - GGCAAACCATTTCTCCCATA -3' F: 5' - AATTTGGCTTCCTTTCTTGGCT -3'
R：5' - CTGCGATACCTTAATGACAGCG -3' F: 5' - ACCTGCTGCTACTCATTCA -3' R: 5' - GCTGCTGGTGATTCTCTTG -3' F: 5' - TACTGAACTTCGGGGTGATCG -3' R：5' - TCCGCTTGGTGGTTTGCTAC -3' F: 5' - GACAAGCAACGACAAAATCCC -3' R：5' - GAAGACAAACCGCTTTTCCATC -3' F: 5' - TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG -3' R：5' - AGGTGGAAGAATGGGAGTTG -3'
扩增片段长度
114bp
NF-κB 194bp
MCP-1 TNF-α
125bp 204bp
IL-1β 116bp
GAPDH
159bp
（2）反应体系：反应总体积 20µl，其中 2×SYBR Premix Ex TaqTM II 10µl，
DyeII 0.4µl,上游引物0.4µl，下游引物0.4µl，模板 cDNA 1µl，ddH2O 7.8ul
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反应条件：94 ℃，预变性10 min，Tag 酶活化，94 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s，
45 个周期结束，反应完成后于16 ℃保存。
（3）使用GAPDH作为内参照，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。 2.3 统计学处理
数据均以x±s 表示，采用SPSS 21.0统计软件包进行数据分析，组间数据比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用最小显著差法(LSD)；方差不齐者采用秩和检验，相关性分析采用Pearson直线相关分析，以P<0.05认为差异有统计学意义。
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3结果
3.1实验大鼠一般情况观察
Con组大鼠反应灵敏，精神状态良好，皮毛白有光泽，进食及活动情况良好。DM组大鼠明显出现多饮、多食，尿量较其他两组明显增加，体重偏轻，3只大鼠出现白内障，1只大鼠因脚部溃烂后死亡，1只因血糖为达到标准，予以剔除。DM+V组大鼠尿量较DM组明显减少，1只因灌胃时跌落致死，1只灌胃时误穿肺部致死。最终共30只大鼠完成实验，其中C组10 只，DM组10 只，DM+V组10只。 3.2 各组大鼠24 h蛋白定量、血浆白蛋白、血糖、血尿素氮和血肌酐的变化
6周末，与Con组相比，DM组大鼠24 h尿蛋白定量、尿素氮明显增高(P ＜0.01)、血肌酐增高(P ＜0.05)，血浆白蛋白降低（P ＜0.05）；与DM组相比，DM+V组大鼠24 h 尿蛋白定量、尿素氮降低（P ＜0.01，P ＜0.05），血浆白蛋白增高（P ＜0.05），血肌酐降低，但差异无统计学意义(P ＞0.05)（见表2）。
表3 各组大鼠24 h蛋白定量、血浆白蛋白、血糖、尿素氮、血肌酐的比较(x±s, n =10) Tab.3 24h urinary protein excretion, Plasma albumin ,Serum glucose，BUN and Scr in
each group 组别 Group Con组 DM组 DM+V组
Pro mg/24h
AlB g/L
Glu mmol/L 9.16±1.66
**
26.35±5.32
**
24.68±4.47
BUN mmol/L 7.01±0.55
**
15.60±2.43
#
10.33±1.73
#
# #
Scr mol/L 20.06±3.11
*
29.50±6.4225.92±4.25
12.64±2.03 29.21±1.70
** *
36.46±7.3423.91±1.46
## #
25.23±3.7528.05±1.79
*
* *
注：与Con组相比，P ＜0.05，P ＜0.01；与DM组相比，P ＜0.05，P ＜0.01 * * * # # #
Note：P ＜0.05，P ＜0.01，VS. Con group;P ＜0.05，P ＜0.01,VS. DM group
3.3 各组大鼠肾脏组织病理学变化
HE染色光镜下Con组肾组织未见明显病理改变，DM组大鼠肾小球系膜细胞增殖肥大，系膜区增宽，系膜基质聚积,肾小球基底膜增厚，肾小管上皮细胞广泛空泡变性，并可见炎细胞浸润，DM+V组与DM组相比，系膜细胞增殖肥大、系膜基质聚积、肾小管上皮细胞广泛空泡变性均减轻（图1）。
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Con组 DM组 DM+V组 图1 各组大鼠肾脏皮质HE染色（×400） Fig.1 HE staining in renal cortex (×400)
3.4 各组大鼠肾脏组织ERS标志性蛋白的表达变化 3.4.1 免疫组化方法检测GRP78的表达及定位
GRP78在Con组大鼠肾皮质均有弱阳性表达,阳性细胞的细胞浆呈棕黄色。主要表达在远端小管和集合管上皮细胞的胞质；DM组的表达明显增加，肾小球和肾小管上皮细胞胞质均明显表达； DM+V组GRP78表达部位与DM组大致相同，程度介于Con组、DM组之间（见图2）。
Con组 DM组 DM+V组
图2 各组大鼠肾皮质免疫组化GRP78蛋白表达变化（×400）
Fig.2 Immunohistochemical staining of GRP78 protein in renal cortex (×400)
3.4.2 western blot方法检测P-IRE1α的蛋白表达变化
与Con组相比，DM组P-IRE1α蛋白表达增高（P ＜0.05）；与DM组相比，DM+V组P-IRE1α蛋白表达降低（P ＜0.05）(图3) 。
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Con DM DM+V P-IRE1α
GAPDH
*
#
注：与Con组相比，P ＜0.05；与DM组相比，P ＜0.05
* #
Note：P ＜0.05，VS.Con group；P ＜0.05，VS.DM group
图 3 6周末各组大鼠肾脏皮质中P-IRE1α的表达
Fig 3 The expression of P-IRE1αprotein in renal cortex by Western blot
3.5 各组大鼠肾脏组织炎症相关通路的变化
3.5.1 大鼠肾脏组织中NF-κB p65、P-NF-κB p65 的蛋白及mRNA的表达变化
western blot检测方法显示：与Con组相比，DM组P-NF-kBp65、NF-kBp65表达均增高（P＜0.01）；与DM组相比，DM+V组P-NF-kBp65、NF-kBp65表达降低（P＜0.05）(图4) 。qRT-PCR检测结果显示：与Con组相比，DM组NF-kBmRNA表达明显增高（P＜0.05）；与DM组相比，DM+V组NF-kBmRNA表达降低（P＜0.05）（图6）
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Con DM DM+V
P-NF-κB p65
NF-κB p65
GAPDH
*
#
注：与Con组相比，P ＜0.05；与DM组相比，P ＜0.05
* #
Note：P ＜0.05，VS.Con group；P ＜0.05，VS.DM group
图 4 6周末各组大鼠肾脏皮质中P-NF-κBp65、NF-κB p65的表达
Fig 4 The expression of P-NF-κBp65、NF-κB p65protein in renal cortex by
Western blot
3.5.2 大鼠肾脏组织中JNK、P-JNK的蛋白及mRNA的表达变化
western blot检测方法显示：与Con组相比，DM组P-JNK表达明显增高（P＜0.05），JNK也增高但无统计学意义（P＞0.05）；与DM组相比，DM+V组P-JNK表达明显降低（P＜0.05），JNK也有所降低，但无统计学意义（P＞0.05）(图5) 。qRT-PCR检测结果显示：与Con组相比，DM组JNKmRNA表达有所升高，与DM组相比，DM+V组JNKmRNA表达有所降低，但均无统计学意义（P＞0.05）（图6）。
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Con DM DM+V
P-JNK
JNK
GAPDH
*
#
注：与Con组相比，P ＜0.05；与DM组相比，P ＜0.05
* #
Note：P ＜0.05，VS.Con group；P ＜0.05，VS.DM group
图 5 6周末各组大鼠肾脏皮质中P-JNK、JNK的表达
Fig 5 The expression of P-JNK、JNK protein in renal cortex by Western blot
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注：与Con组相比，P ＜0.05；与DM组相比，P ＜0.05
* #
Note：P ＜0.05，VS.Con group；P ＜0.05，VS.DM group
*
#
图 6 各组大鼠肾组织NF-κB和JNKmRNA的表达变化
Fig.6 qRT-PCR results of NF-κB and JNK of renal cortex in each group
3.6 各组大鼠肾脏组织炎症细胞因子的表达变化 3.6.1免疫组化方法检测MCP-1的表达及定位
MCP-1在Con组表达极弱; DM组表达明显增强，尤以远曲小管胞质最为明显，部分肾小球内细胞胞质也呈强阳性表达。DM+V组MCP-1表达部位与DM组大致相同，程度介于Con组、DM组之间（图7）。
Con组 DM组 DM+V组
图7 各组大鼠肾皮质免疫组化GRP78蛋白表达变化（×400）
Fig.7 Immunohistochemical staining of GRP78 protein in renal cortex (×400)
3.6.2大鼠肾脏组织MCP-1、TNFα、IL-βmRNA的表达变化
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6周末，Con组大鼠肾组织MCP-1、IL-1β、TNFα mRNA 仅有少量表达。与Con组比较，DM组MCP-1、IL-1β、TNFαmRNA表达均有增高（P＜0.05）；与DM组相比，DM+V组MCP-1、IL-1β、TNFαmRNA表达量降低( P ＜0.05)（见图4）
注：与Con组相比，P ＜0.05；与DM组相比，P ＜0.05
** #
Note：P ＜0.05，VS.Con group；P ＜0.05，VS.DM group
*
#
图 8 各组大鼠肾组织MCP-1、TNFα和IL-1βmRNA的表达变化
Fig.8 qRT-PCR results of MCP-1、TNFα and IL-1β of renal cortex in each group
3.7 P-IRE1α蛋白表达和不同因素间的相关性分析
P-IRE1α 与 P-NF-кBp65、P-JNK、MCP-1mRNA、TNFαmRNA、IL-1βmRNA及24 小时尿蛋白定量的相关关系详见表4。
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表4 P-IRE1α蛋白表达和不同因素间的相关性分析
Tab.4 Protein expression of P-IRE1αand the analysis of
the correlation between different factors
P-JNK P-NF-κB p65 MCP-1mRNA TNFαmRNA IL-1βmRNA 24小时尿蛋白定量
P-IRE1α表达量 相关系数r 0.892 0.760 0.841 0.667 0.733 0.874
P值 0.027 0.043 0.032 0.041 0.048 0.031
4讨 论
糖尿病肾病（DN）作为糖尿病这一代谢性疾病所致的并发症，不仅在临床表现和疾病进程上有别于其它免疫介导的肾脏疾病，而且一旦出现肾功能损害，其进展速度远远快于非糖尿病肾病患者。随着生活水平的提高及生活方式的变化，糖尿病肾病目前已经成为我国终末期肾衰竭第二大原因，但目前尚未完全明确其发病机制，因此建立DN动物模型并且研究DN的发病机理具有重要的临床意义。目前主要有三种建立DN动物模型的方法：药物诱发型、自发型和转基因型。药物诱发模型是指使用对胰岛β细胞具有强烈杀伤作用的药物（如链脲佐菌素STZ）腹腔注射，完全破坏胰岛β细胞功能，使胰岛分泌胰岛素发生障碍，形成糖尿病，并逐渐进展成类似于1型糖尿病的糖尿病肾病模型。若药物注射前，给予1-2月的高糖、高脂饮食，可诱导胰岛素抵抗，再给予小剂量药物破坏胰岛β细胞，可出现接近2型糖尿病的糖尿病肾病动物模型。自发型DN动物模型是在自然情况下，发生基因突变，通过定向选择饲养，而保留下来的DN模型，包括：类似1型糖尿病模型的BB大鼠、Akita小鼠[15]；类似2型糖尿病的ab/ab小鼠，OLETF大鼠等。此类模型对DN的病因学有较高的价值，但其价格较高，饲养及繁殖条件要求较高，造模周
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期长。转基因型是指用将外源基因通过转基因技术导入动物体内，整合于动物染色体上并能稳定遗传给后代，其技术水平较高，操作复杂，费用较高，使用也受到一定限制。本研究主要探讨DN中炎症反应及ERS通路，不涉及胰岛素代谢异常的研究，我们选用SYZ诱导的SD大鼠DN模型，故可基本满足实验要求。考虑到炎症反应在DN早期较为明显，晚期则主要以纤维化为主，临床工作中糖尿病肾病晚期进展迅速，早期预防更为重要，本研究旨在观察糖尿病引起的早期肾损害，故将时间结点定于成模后第6周，以期观察早期的炎症反应。
本研究结果表明，Con组大鼠在整个实验期间，24h尿蛋白、血肌酐水平无明显变化，肾脏病理显示肾组织结构未见明显变化，排列分布及形态均正常。第6周DN大鼠24h尿蛋白、Scr水平较对照组明显升高，肾脏病理显示，系膜细胞增生肥大，系膜区增宽，系膜基质聚积,肾小球基底膜增厚，肾小管上皮细胞广泛空泡变性，并可见炎细胞浸润，提示成功建立了DN模型。
目前，研究发现DN的疾病进展与多种因素有关，如多元醇及PKC（蛋白激酶C）通路的激活、肾小球内压增高引起的肾小球高滤过状态、晚期糖基化终产物AGEs的堆积等。在这些通路下游，微炎症反应和随后的细胞外基质的增生是糖尿病肾病进展的共同通路，众多研究表明炎症通路在糖尿病肾病的进展中发挥着核心作用。研究发现，在糖尿病肾病患者中，肾小球和间质中有大量的巨噬细胞和T细胞积聚，这一改变甚至出现在糖尿病肾病的早期阶段。除巨噬细胞浸润外，免疫炎症激活的另一依据是在啮齿类动物糖尿病肾病动物模型中发现有循环免疫复合物和IgG在肾小球的沉积[20]。在一项567例1型和2型糖尿病患者肾活检病理研究中发现，大约30%患者肾小球病中有免疫复合物沉积[21]。巨噬细胞在浸润肾间质的同时可以分泌大量细胞因子及炎症介质，其中MCP-1可以促进单核细胞和巨噬细胞的迁移和激活，肾脏 MCP-1 的增加是糖尿病肾病患者肾脏损伤的显著特点[16]。在1型和2型糖尿病动物模型中，敲除MCP-1后的肾脏损伤明显减轻[17]。TNFα除了招募单核巨噬细胞的聚积，还可以诱导局部活性氧ROS的产生[18]，通过血流动力学改变减少肾小球滤过率，同时改变内皮细胞的通透性。IL-1β通过影响前列腺素的生成，刺激肾小球系膜细胞及纤维细胞的增殖，诱导TGF-β1的产生[19]，从而改变肾小球
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的血流动力学。本研究结果显示，DM组大鼠肾组织中炎症因子MCP-1、IL-1β、TNFαmRNA表达量较Con组均升高，同时免疫组化结果显示，MCP-1主要分布于远曲小管胞质，提示DN早期炎症反应主要集中于肾小管部位，这也与ERS标志性蛋白GRP78表达部位一致。但是DN的发生和发展往往缺乏病原微生物的直接侵袭，免疫炎症反应通过何种途径被激活尚未完全明确。
近年来的研究发现，内质网应激（ERS）与炎症反应联系密切。内质网是多种蛋白的主要合成场所，也是细胞Ca2+的重要存储场所，当外界各种因素导致内质网稳态被打破，将会造成未折叠和错误折叠蛋白的大量堆积和内质网内Ca2+超载，从而引起ERS。内质网膜有三种跨膜蛋白，分别是PERK, IRE1、ATF6。在静息状态的细胞内,这三种蛋白与内质网内丰富的分子伴侣蛋白-葡萄糖调节蛋白 78(glucose regulated protein 78，GRP78)相结合，维持无活性的状态。当内质网应激出现时, GRP78优先结合未折叠蛋白和错误折叠蛋白，导致与三个跨膜蛋白分离，促进这些内质网膜蛋白释放并活化，启动不同的UPR信号转导途径[22]，因此GRP78被认为是内质网应激的标志性蛋白。在ERS初期，UPR信号介导促生存的信号途径，如IRE1α与GRP78解离后，通过二聚化和自磷酸化被激活，剪切无活性的转录因子-X盒结合蛋白-1（X-box binding protein 1，XBP-1）mRNA，使其具有转录因子活性，诱导UPR相关基因的转录，例如分子伴侣GRP78、GRP94 、钙网蛋白、钙联蛋白及蛋白二硫键异构酶，以促进内质网蛋白的折叠[23]。因此，ERS本质上是一种自我保护的适应性机制，适度的内质网应激反应可以使外界刺激下的细胞恢复稳定，但是导致ERS的外界因素持续存在时，UPR信号将会启动促进细胞死亡的信号途径，包括炎症反应的激活和细胞凋亡等[24]，如p-IRE1α激活CHOP、c-Jun-氨基末端激酶(JNK)和caspase12等相关蛋白的表达促进细胞凋亡。此外，p-IRE1α也可以增强NK-κB的核转录活性，导致炎症激活。肾脏中肾小球的系膜细胞、肾小管上皮细胞、肾小囊的足细胞等都具有丰富而复杂的内质网结构，为ERS的发生提供了结构基础和功能条件，同时糖尿病肾病患者持续存在着高血糖、氧化应激、ANGII等多种破坏内质网稳态的因素[25]，提示ERS可能参与了DN中炎症反应的发生。
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为了验证DN中存在ERS的激活，我们用免疫组化的方法观察ERS标志性蛋白GRP78蛋白的表达量及表达部位，采用western blot方法观察内质网膜蛋白p-IRE1α蛋白的表达。结果显示，6周末时，免疫组化检测方法发现Con组中GRP78蛋白几乎无阳性表达，DM组中GRP78在肾小管上皮细胞呈强阳性表达，在肾小球系膜细胞呈弱阳性表达，与Con比较差异具有统计学意义（P<0.05），同时发现此表达分布于MCP-1的表达分布相一致。Western blot检测发现，DM组中内质网膜蛋白p-IRE1α蛋白表达较对照组明显增加，与Con比较差异具有明显统计学意义（P<0.05），提示糖尿病大鼠肾脏中确实存在ERS激活，且DN早期ERS激活主要发生在肾小管上皮细胞。此结果也与目前国内外的体内、体外实验结果相一致。Liu YJ[26]对48例确诊为DN的肾活检的临床数据进行了分析。通过肾母细胞瘤-1 (WT-1）标记足细胞，估算足细胞密度，同时检测GRP78表达情况。结果表明：尿蛋白> 3.5 g/d 组的足细胞数量远远少于尿蛋白＜3.5g/d 组，其数量与尿蛋白呈负相关，GRP78也同尿蛋白定量呈负相关。Lindenmeyer 等[27]对确诊的DN患者肾活检组织数据进行微阵列分析，发现UPR相关基因的表达明显上调，转录因子XBP-1、内质网分子伴侣蛋白HSPA5、HYOU1、及内质网分子伴侣如 GRP78 和氧调节蛋白
150(oxygen-regulated protein 150，ORP150) 表达明显增加，证实了DN中存在 ERS 激活，并且 ERS激活的强度与肾脏病变程度密切相关。Lim JC[28]利用高糖培养肾小球系膜细胞，发现高糖抑制了GRP78的表达，但可诱导增加内质网应激相关蛋白的表达。足细胞是终末分化的缺乏增殖能力的上皮细胞，足细胞渐进性丢失是糖尿病肾病标志之一。CaoYP[29]等利用高糖刺激足细胞，研究发现 GRP78的表达在12小时开始增加，表明ERS开始被激活，48小时后达到高峰。Cao YP[30]等同样在糖尿病大鼠模型中观察到，在6、8、12周时大鼠肾脏中GRP78表达增加，并在8周达到高峰，随后开始降低。所以，我们推测，伴侣蛋白GRP78可以作为ERS激活的指标，但随着时间的延长，其蛋白表达可能呈现饱和状态，其炎症反应程度可能与此并不平行。因此，我们同时检测了活化的内质网膜蛋白P-IREα蛋白表达，了解内质网应激程度，并与炎症相关因子MCP-1、IL-β、TNFαmRNA表达量、24小时尿蛋白定量进行相关性分析，结果表明，6周末DM组大鼠肾组织中MCP-1、IL-β、
30
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TNFαmRNA表达量、24小时尿蛋白定量均与P-IREα蛋白表达量呈显著正相关，提示DN中内质网膜蛋白IREα激活与炎症反应之间有密切关系。
在三个内质网跨膜蛋白中，IRE1α与炎症信号激活关系密切，特别是与炎症反应的中心因子——NK-κB的激活有着非常直接而密切的联系[27]。NF-κB是一种重要的转录因子，参与了多种炎症反应的信号转导过程及多种细胞因子的表达与调控。内质网应激后,内质网腔内大量未折叠和/或错误折叠的蛋白质生成增加,可竞争结合GRP78,使其与IRE-1α解离,促进IRE-1α活化，活化的IRE1α在肿瘤坏死因子受体相关因子-2 (TRAF2) 介导下，与IκB激酶（IKK）形成复合体，激活IKK，使其磷酸化为P-IKK,进而使IκB隣酸化后与NF-κB解离, 游离NF-kB的亚基p65迅速移位到细胞核,在核内磷酸化为P-p65，与特异性κB序列结合,诱导炎症相关基因的转录[31]，促进炎症介质的表达。这一途径与传统的TNF-α激活 NF-κB 的途径是相互独立的。有研究发现，将小鼠胚胎成纤维细胞中IRE1α 基因予以敲除，细胞内的NF-κB 激活和炎症因子TNF-α 的产生明显减少[32]，直接证明了IRE1 能激活NF-κB。
研究表明，除了NK-κB通路，JNK通路也受P-IRE1α的激活。JNK (c-Jun 氨基端激酶)是负责激活转录因子 c-Jun 氨基端磷酸化的激酶。经许多生理及病理信号刺激后（如生长因子、环境因素、细胞因子等应激），JNK被激活并转运到细胞核，使核内转录因子 c-Jun 的氨基末端磷酸化，启动相关基因的转录。引起下游炎症因子（包括MCP-1）的激活[33]。在DN病人的肾活检标本中，JNK的激活与细胞间质的巨噬细胞聚积、肾损伤因-1、间质纤维化等密切相关[34]。应用JNK抑制剂CC-930抑制STZ大鼠模型JNK通路，发现巨噬细胞浸润减轻，同时MCP-1mRNA表达减少[35]。因此，JNK 通路是介导巨噬细胞相关的肾损伤的重要途径。ERS情况下，活化的IRE1α（P-IRE1α）结合TRAF2，募集凋亡信号调节激酶(ASK1) 及其下游蛋白，促进JNK磷酸化，促进转录因子 C-Jun的激活，从而编码多种炎症介质的基因表达[36]。同样，敲除小鼠胚胎成纤维细胞中的IRE1α 基因，JNK的激活明显减少[37]，从而证明了IRE1α亦可直接导致JNK炎症通路的激活。
本实验结果表明，6周末DM组中NK-κB p65、P-NK-κB p65蛋白表达均显著
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上调，同样其核酸mRNA表达量也显著上调，提示DM大鼠肾组织中存在NF-κB信号通路的激活；6周末DM组大鼠肾脏JNK蛋白及核酸表达均无明显变化，但是DM组P-JNK蛋白量上调；同时对DM组中P-NK-κBp65、P-JNK蛋白表达量与P-IRE1α蛋白表达量进行相关性分析，结果显示P-NK-κBp65 、P-JNK与P-IRE1α之间均呈正相关（均P<0.05）,提示在DN中持续存在的ERS诱发了炎症反应，活化的膜蛋白P-IRE1α通过激活其下游的JNK及NF-κB相关的炎症信号通路引起炎症反应。值得注意的是，NF-κB的蛋白及核酸表达量均增高，而JNK的蛋白及核酸表达量均无明显变化。分析可能原因为，JNK的激活条件多与细胞应激条件相关,因此 JNK 又被称作应激激活蛋白激酶(SAPK)，其激活可能更易受ERS的影响，JNK的活化形式为P-JNK，其应激因素导致的激活占主导地位。ERS与NF-κB的关系较为复杂，除IRE1α介导的炎症通路外，PERK通路被激活后也能导致NF-κB的激活，由于eIF2α磷酸化导致目的蛋白mRNA 翻译减少，其中包括导致IκB蛋白合成减少，使其不能与NF-κB结合，因此导致NF-κB转录活性的增强[38]。此外，NF-κB是多种炎症通路的共同作用靶点（如TLR4受体通路、PKC通路）[39]，这些通路都会导致NF-κB相关基因表达量的增多，引起NF-κB蛋白表达总量的增多，从而导致P-NF-κB表达量的相对增多。总之，本研究证明了DN中ERS与炎症反应相关通路之间的密切关系。
目前DN尚缺乏有效的防治方法，因此研究ERS及相关炎症通路在DN中的发病机制具有重要意义，已有学者针对炎症反应机制对DN进行了尝试性治疗。国内学者赵润英[40]应用免疫抑制剂雷公藤多苷治疗46例DN患者，疗程3个月，发现24小时尿蛋白定量明显降低。动物实验研究发现，雷公藤多苷能够明显抑制DN大鼠肾脏组织中NF-κB、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，抑制炎症反应，减少巨噬细胞及单核细胞浸润，减少DN大鼠蛋白尿水平[41]。这些研究肯定了针对炎症反应机制在临床实践中治疗DN的临床意义，但是雷公藤性腺抑制等副作用限制了其应用。免疫抑制剂治疗DN的安全性目前仍饱受争议。由于内质网应激与炎症反应关系密切，若从内质网应激的角度，寻求可应用于临床的ERS抑制剂，理论上可以降低炎症反应，同时大大提高其安全性。另外DN的临床表现为多种因素综合作用的结果，如脂代谢紊乱、氧化应激、血管活性物质、高血压、血流动力学改变等，ERS均与上
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述因素有关，同时ERS具有分子信号整合器的功能，可以与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡，蛋白质合成降解等多种信号通路相偶联[13]，若能从源头对ERS进行调控，则可以抑制下游的信号网络，可最终有效延缓DN的进展速度，改善DN患者的生活质量及延长患者进入终末期肾病的时间。
缬沙坦(Valsartan)，为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）类经典代表药物。已在临床广泛应用于DN特别是早期DN的治疗，降低蛋白尿疗效肯定。既往认为，其降低蛋白尿延缓肾功能损害进展的原因主要是改善了血流动力学异常，减轻了肾小球球内压。目前发现血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体阻滞剂(ARB)还具有抗炎、抗纤维化、抗凋亡的作用,然而具体机制尚不明确。DM患者肾脏存在局部RAS系统的激活，ANGII生成增多，降解减慢，从而导致肾脏局部ANGII的浓度增加[42]。体外实验已发现，ANGII可诱导肾小管细胞的NF-κB的激活，进而引起炎症反应[43]。在体内实验中发现[44]糖尿病肾病大鼠的肾小管上皮细胞和系膜细胞中NK-κB由细胞质到细胞核的转位增多，应用ARB药物治疗后NF-kBp65核转位明显减少，表达强度明显降低。Ru ilope 等[14]发现缬沙坦具有降低血CRP、IL- 6 的作用，同时, 缬沙坦能通过抑制转录因子NF-κB 进而减少IL-1、IL- 6、TNFα等细胞因子的分泌[45]。在临床治疗中，Titan SM[46]联合应用ACEI与ARB治疗DN患者，发现DN患者尿液中MCP-1呈明显下降趋势。既然DM患者肾脏存在局部高ANGII现象，ANGII与高血糖等同为ERS的诱发条件，我们大胆设想ARB类药物是否是通过抑制ERS进而减弱了炎症反应呢?为了验证这一设想，我们在造模同时给予缬沙坦干预治疗，通过检测空腹血糖、24h尿蛋白定量及血肌酐等生化指标来评价缬沙坦对DN的治疗作用，同时检测肾脏组织中内质网膜蛋白P-IRE1α，及JNK、NF-κB相关炎症通路蛋白的表达变化，探讨ARB类药物抑制炎症反应的具体机制。
我们的研究结果发现，经缬沙坦治疗后，DM+V组大鼠肾小球和肾小管病理改变及炎症细胞浸润程度较DM组明显减轻，24小时尿蛋白定量较DM组明显减少，血浆白蛋白水平较DM组明显升高，肾组织中炎症因子MCP-1、IL-1β、TNFαmRNA表达量较DM组均降低，提示缬沙坦可能通过抑制炎症反应降低糖尿病肾病大鼠的尿蛋白，从而延缓肾功能的进展。此外DM+V组P-IRE1α、P-JNK、P-NK-κBp65的蛋
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白表达水平较DM组明显降低，JNKmRNA水平较DM组差异无明显统计学意义，NK-κBmRNA水平较DM组降低，也提示JNK的激活可能更易受ERS的影响，其应激因素导致的磷酸化激活可能占主导地位。对P-JNK、P-NK-κBp65 与P-IRE1α之间进行相关性分析，结果显示它们之间呈显著正相关。因此，我们推断缬沙坦可能是通过减低ERS程度，抑制内质网膜蛋白IRE1介导的JNK及NK-κB信号通路，减轻下游的炎症发应，从而改善肾功能达到治疗DN的作用。
关于ANGII受体拮抗剂缬沙坦如何抑制ERS，其作用机制尚不明确，考虑与以下因素有关：①ANGII不仅是一种血管活性物质，更是一种生长促进因子[47]，具有强大的促进细胞增殖和肥大功能，而细胞增殖和肥大的最重要的过程便是蛋白质的大量合成过程[48]，这个过程可以增加内质网的蛋白负荷，进而引起ERS；②ANGII可通过NADPH氧化酶诱导系膜细胞活性氧自由基(Ros)的产生[49]，诱发氧化应激，进而破坏内质网稳态，诱发ERS；③ANGll刺激可造成血管内皮细胞细胞内Ca2+异常升高[50]，影响内质网的稳态，引起ERS。 AT1受体拮抗剂ARB类药物与其受体结合，减弱了ERS的激活条件。此外，当糖尿病肾病导致大量蛋白尿时，由于肾小管上皮细胞具有重吸收能力，漏出的大量的白蛋白及其它蛋白累积在肾小管上皮细胞内，干扰蛋白的正常代谢，也可以诱发ERS，ARB类药物如缬沙坦也可以通过降低尿蛋白减轻肾小管上皮细胞的ERS的激活。
综上所述，研究发现，糖尿病大鼠肾脏中存在内质网应激和炎症反应的激活；活化的膜蛋白P-IRE1α可能通过激活其下游的JNK及NF-κB相关的炎症信号通路引起炎症反应；缬沙坦可能通过降低ERS程度减少炎症反应，从而减少尿蛋白排泄量，延缓肾功能进展。
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5结论
5.1 糖尿病大鼠肾脏中存在ERS的激活，活化的膜蛋白P-IRE1α可以通过激活 JNK及NF-κB相关的炎症信号通路引起炎症反应。
5.2与NF-κB通路相比，JNK通路的激活可能更易受ERS的影响，ERS对JNK通
路的激活占主导地位。
5.2 ANGII受体拮抗剂缬沙坦可能通过抑制内质网膜蛋白IRE1介导的JNK及NK-κB信号通路减轻炎症反应，而达到降低蛋白尿，延缓肾功能进展的作用。
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9综述部分
内质网应激及偶联炎症反应在糖尿病肾病中
的研究进展
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常见并发症，同时也是糖尿病患者死亡的一个主要原因，进入大量蛋白尿期以后，治疗相当困难，肾功能损害进展迅速，一般5-10年即可发展至终末期肾衰竭[2]。2012年国际糖尿病联盟公布，全球糖尿病患者已超过3710万[1]。据统计，每个糖尿病患者，10-20年后蛋白尿发生率竟高达47.66%[2]。糖尿病肾病的发病机制十分复杂，目前尚未完全明确，给临床治疗带来很大困难。近年来研究发现，内质网膜上存在一套完整的信号调节机制，即内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）反应，内质网应激是多种代谢性疾病如慢性心脑血管疾病、神经性病变、胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖、脂肪肝等发生发展的中心环节[3-4]，同时ERS具有分子信号整合器的功能，可以与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡，蛋白质合成降解等多种信号通路相偶联[5]，提示ERS可能与同为代谢性疾病的DN的发病关系密切，研究DN中ERS反应对于DN的发病机制及治疗具有重要意义。 1． ERS和UPR概述
内质网( endoplasmic reticulum， ER)是对蛋白质进行折叠、修饰、降解分泌及贮存Ca2+的场所，对外环境刺激非常敏感。不同的病理及生理的刺激，包括营养物质缺乏、营养物质过剩、感染、酸中毒、高同型半胱氨酸、氧自由基、缺氧、内质网Ca2+释放剂及抑制剂、重金属、蛋白糖基化与折叠抑制剂等都会干扰内质网内正常蛋白的折叠或导致错误折叠蛋白的聚积，破坏内质网内Ca2+稳态，内质网的这种状态称为ERS[6]，未折叠蛋白和错误折叠蛋白的聚积将会诱导细胞毒性损害。于是内质网启动错综复杂的信号网络来应答未折叠蛋白的积累，包括调节内质网膜结构和分泌蛋白产生的能力[7]、上调内质网分子伴侣表达、诱导内质网相关性降解(ER-associated degradation，ERAD)途径的激活等[8]，这种内源性保护机制在1988年被命名为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。
在哺乳类动物细胞中，ERS可以激活内质网膜上的三种跨膜蛋白来启动URP，
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分别是肌醇依赖酶1（inositol requiring kinase-1，IRE1）、双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(double stranded RNA activated protein kinase like ER kinase，PERK)、活化转录因子 6(activating transcription factor-6，ATF6)。在静息状态的细胞内,这三种蛋白与内质网内丰富的分子伴侣蛋白-葡萄糖调节蛋白 78(glucose regulated protein 78，GRP78)相结合，维持无活性的状态。当内质网应激出现时,GRP78 优先结合未折叠蛋白和错误折叠蛋白，导致GRP78与三个跨膜蛋白分离，促进这些内质网膜蛋白释放并活化，介导不同的UPR信号途径
[9]
。其信号通路主要有三条：
IRE1α/XBP-1途径 IRE1α是一种高度保守跨膜蛋白，具有丝氨酸/苏氨酸
蛋白激酶活性。ERS状态下，IRE1α与 BiP/GRP78 解离，IRE1α通过二聚化和自磷酸化被激活，剪切无活性的转录因子X盒结合蛋白-1（X box binding protein 1，XBP-1）mRNA，使其具有转录因子活性，诱导UPR相关基因的转录，例如分子伴侣GRP78、GRP94 、钙网蛋白等，以促进内质网内蛋白的折叠[10]。
PERK/eIF2α途径 PERK也是一个跨膜蛋白，其内质网腔内结构域类似IRE1α，具有蛋白激酶活性。在内质网应激状态下，PERK通过自身磷酸化激活，导致下游的真核细胞的翻译起始因子eIF2α磷酸化而失活，失活后的eIF2α因无法启动的mRNA 翻译过程，从而使蛋白质合成迅速减少，迅速降低内质网的内蛋白负荷
[11]
。
ATF6/ERSE途径 AT6类似于活化了的XBP-1。内质网应激时，ATF6与分子伴
侣GRP78分离后转运到高尔基体内，蛋白酶S1P和S2P对其跨膜片段进行酶切，产生具有转录活性的片段(ATF6-p50)，释放出胞浆侧的bZIP类的转录因子区域，移位到细胞核中，激活ER 应激基因（ER stress response element，ERSE）的转录[12]，这些基因编码的有CHOP/GADD153、BiP/GRP78和ERAD相关蛋白 [13]。
总之,ERS通过激活以上三条途径缓解了ER 的压力，纠正蛋白质折叠的错误、恢复和维持内质网动态平衡及细胞生存。但是，过强的或长时间的应激反应就会启动促进凋亡的UPR，引起细胞的一系列病理生理变化，包括局部炎症反应激活、细胞增殖和细胞凋亡等[14]，例如上述三条途径均可导致CHOP/GADD153的和转录活
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性，增强促凋亡因子的表达[15]。 2.ERS与炎症反应的信号转导通路
目前研究发现炎症反应与ERS有着千丝万缕的联系。在细胞水平的研究发现，实验性诱导UPR反应能导致促炎症因子的激活，例如IL-8，IL-6，MCP-1，TNFα
[16]
。UPR 信号转导通路可以通过几种不同机制与炎症反应偶联参与细胞调节和疾
病的发生。主要包括核因子κB ( nuclear transcription factor-κB，NF-κB) 、转录因子活化蛋白1( activator protein 1，AP1) 、活性氧( reactive oxygen species，ROS) 及ER 内钙离子释放等。
UPR 与NF-κB 通路 NF-κB是一种重要的转录因子，参与了多种炎症反应的信号转导过程及多种细胞因子的表达与调控。目前研究发现UPR 的3 条信号通路均能激活NF-κB，但其机制不同。ER 应激情况下，活化的IRE1α 在肿瘤坏死因子受体相关因子-2 (TRAF2)介导下，与IκB激酶（IKK）形成复合体，激活IKK，使IκB 磷酸化，磷酸化的IκB经泛素化修饰后降解，导致NF-κB 激活并转位于细胞核，进而启动相关基因的转录[17]。这一途径与肿瘤坏死因子α(TNF-α)激活 NF-κB 的途径是相互独立的。敲除小鼠胚胎成纤维细胞中的IRE1α基因，发现ERS诱导NF-κB 激活和炎症因子TNF-α 的产生明显减少[18]，直接证明了IRE1 能激活NF-κB； 用ER 应激诱导剂处理细胞后，PERK通路被激活，eIF2α磷酸化导致目的蛋白mRNA 翻译减少，其中包括导致IκB蛋白合成减少，使其不能与NF-κB结合，因此导致NF-κB转录活性的增强[19]。同样ATF6 也参与了NF-κB-IKK 信号通路的活化，志贺菌素SubAB刺激NRK-52E 细胞(大鼠肾成纤维细胞)，发现内质网应激跨膜蛋白和 NF-κB 的活性均增强，磷酸化Akt水平升高，抑制IRE1a 或 PERK 并没能减弱NF-κB 活性水平，应用药物抑制ATF6时，磷酸化Akt及NF-κB水平均降低，提示ATF6可能通过 PI3K/Akt 信号途径介导了 NF-κB 的活化[20]。
UPR与JNK通路 JNK (c-Jun 氨基末端激酶)是负责激活 c-Jun N 端磷酸化的激酶,由于JNK 的激活条件多与细胞应激条件相关,因此 JNK 又被称作应激激活蛋白激酶(SAPK)，JNK对ERS刺激信号极其敏感,是ERS 的重要下游通路。JNK 被激活后转运到细胞核，使核内转录因子c-Jun 的氨基末端磷酸化，激活c-Jun 而转
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录相关炎症因子。目前已知UPR 中的IRE1 对JNK的激活有重要作用。ER 应激情况下，活化的IRE1α 结合TRAF2，募集凋亡信号调节激酶1(ASK1) 及其下游蛋白，促进JNK磷酸化，编码多种炎症介质的基因表达[21]。研究发现，将小鼠胚胎成纤维细胞中IRE1α 基因予以敲除，发现JNK的激活明显减少[22]，从而证明了IRE1α可以直接激活JNK 炎症反应通路。另有研究表明，PERK信号通路中一个下游因子转录激活因子4（ATF4）能够通过激活JNK信号通路，上调炎症细胞因子[23]。
ERS与cAMP 应答元件结合蛋白 cAMP应答元件结合蛋白H ( cAMP response element binding protein H，CREBH) 是一种具有bZIP二聚体结构的转录因子。与ATF6 一样，CREBH 也是ER 跨膜蛋白。CREBH在肝脏活体研究中被发现，内质网应激时，CREBH 可转入高尔基体被蛋白酶 S1P 和 S2P 剪切，释放出具有转录活性的氨基末端片，与激活的AT6形成二聚体运输到核内，启动急性期反应蛋白基因的表达，包括编码血清淀粉样P成分(serum amyloid-P，SAP)的和 C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)的转录基因，表明了 ERS 与急性炎症反应的联系[24]。
长期的内质网应激及UPR的激活会导致氧化应激反应，导致有毒的ROS在细胞中的积累[25]。其原因是由于UPR激活分子伴侣的上调，在蛋白合成时形成大量二硫键，同时释放出的电子传递至O2，形成O-，再经过多种途径生成ROS。另外，ER应激时会导致大量钙离子释放[26]，漏出的Ca2+可以使线粒体内膜的去极化,使其呼吸链失去转移电子的能力,导致大量 ROS 的产生。ROS 是炎症反应的重要介质,导致了炎症反应甚至细胞死亡。 3、ERS与DN的发病机制
迄今为止，DN的发病机制还不十分清楚。除蛋白激酶C（PKC）、氧化应激（ROS）、细胞因子及遗传分子学说外，目前炎症学说倍受关注。近年来研究表明，微炎症反应和随后的细胞外基质扩张是上述机制在糖尿病肾病中进展的共同途径，众多研究表明炎症通路在糖尿病肾病的进展中发挥核心作用[27]。
研究发现，在糖尿病患者中，肾小球和间质中有大量的巨噬细胞和T细胞积聚，这一改变甚至出现在糖尿病肾病早期阶段。糖尿病患者肾脏中的高糖环境及糖基化终末产物都是强烈的炎症趋化因子刺激物，这些趋化因子包括白介素-8
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（CXCL8）、INF-γ趋化蛋白（CXCL10）、中性粒细胞趋化因子1（MCP-1）。这些趋化因子会招募巨噬细胞到肾脏，同时巨噬细胞直接分泌TNF-α、IL-1、IL-6、活性氧（ROS）、血纤维蛋白溶解酶原催化因子1（PAI-1）、金属蛋白酶、转化生长因子β（TGF-β）、血管紧张素II和内皮素等[28],引起炎症反应的循环，促进肾小球硬化[29]。
炎症激活的另一依据是在啮齿类动物糖尿病肾病动物模型中发现有循环免疫复合物和IgG在肾小球的沉积[30]。在一项入选了567例1型和2型糖尿病患者的肾活检病理研究中发现，大约30%的患者肾小球中有免疫复合物沉积[31]。另外也有实验证明，炎症相关的NF-κB、JNK、P38MAPK通路在糖尿病大鼠肾脏组织中均有激活[32]。研究发现，雷公藤多苷能够明显抑制糖尿病大鼠肾脏组织中NF-κB、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，抑制炎症反应，减少巨噬细胞及单核细胞浸润，减少DN大鼠蛋白尿水平[33]。目前国内学者赵润英[34]应用免疫抑制剂雷公藤多苷联治疗DN患者46例，疗程为3个月，结果表明24小时尿蛋白定量明显降低，且优于单用缬沙坦治疗组，进一步肯定了针对炎症反应机制在临床实践中治疗DN的临床意义。
但是DN中的炎症反应究竟是如何被激活的？2006年，Hotamisligill[35]第一次提出了代谢性炎症(metaflammation)的概念，为阐释DN的发病机制及其与免疫和炎症的关系开启了一个全新的思路。同时对代谢性炎症的特点进行了描述。DN中的炎症反应属于代谢性炎症(metaflammation)的范畴，与传统经典意义上的炎症反应不同，它不是由于病原菌引起的，而是由摄入过多的营养物质和代谢过度负担导致的低水平的慢性不典型的炎症，无红肿热痛等表现。在进化的早期，由于营养物质的长期匮乏，机体内参与合成代谢信号的相关因子，如胰岛素／胰岛素生长因子等自发被阻滞，减少用于合成代谢的能量，从而保障有更多的能量供给免疫和炎症的活化，这样可以稳定机体基础免疫应激反应和炎症反应[36]。然而，随着社会的进步和生活水平的提高，营养物质不再匮乏甚至相对过剩，人类还未来得及进化出适应营养过剩的状态，胰岛素相对缺乏，此时机体用于代谢合成的能量增加，供给免疫炎症系统的能量大大减少，免疫炎症系统代偿性的被活化，然而免疫炎症代偿性被活化的具体机制长期以来不甚明确。内质网应激的发现恰
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当地解释了炎症激活的具体途径。
肾脏具有发生内质网应激的条件和基础，肾小球的系膜细胞、肾小囊的足细胞和肾小管的上皮细胞内含有丰富的内质网结构，肾脏细胞的许多功能都需要内质网参与完成。系膜细胞可以合成基膜和系膜基质成分,吞噬和降解沉积在系膜上的免疫复合物,参与肾素等生物活性物质的分泌；足细胞分布于肾小球基底膜外侧，参与肾小球滤过屏障的组成，细胞膜外联结有Nephrin，podocin等糖蛋白，维持滤过膜的选择滤过功能；肾小管上皮细胞具有激肽释放酶、Tamm-Horsfall蛋白等小分子蛋白的分泌功能，同时能重吸收管腔内的小分子蛋白。所以像胰岛β细胞一样，肾脏是一个对内质网应激敏感的器官，高效率地合成、分泌蛋白质。在人类，估计每天肾脏的蛋白合成率占整个人体蛋白合成的42%[37]，是人体内蛋白合成率最高的器官，进一步说明肾脏细胞在很大程度上极易受内质网应激的影响。
目前，已有越来越多的研究证明了DN中内质网应激的激活。体外实验研究中发现，体外高糖、白蛋白环境均能导致肾小管上皮细胞、系膜细胞、足细胞内ERS的激活。Lim JC [38]利用高糖环境培养系膜细胞，发现高糖抑制GRP78的表达，但可诱导增加内质网应激相关蛋白的表达，包括内质网膜蛋白PERK，真核起始因子（eIF-2α），激活转录因子-4（ATF-4）和C/EBP同源蛋白。足细胞是终末分化的缺乏增殖能力的上皮细胞，糖尿病肾病其中一个标志就是足细胞渐进性丢失。CaoY[39]等利用高糖环境刺激足细胞，发现 GRP78的表达在12小时开始增加，表明ERS开始被激活，48小时达到高峰。Brezniceanu ML[40]通过体内、体外两种实验方式证明了糖尿病肾病及高糖、白蛋白环境下肾小管上皮细胞内ERS的激活。他们用定量聚合酶链反应和免疫组化证实糖尿病 (db/db) 小鼠肾组织caspase-12mRNA表达增强；同时在体外高蛋白、高血糖环境下培养人近端小管上皮细胞(HK-2)，发现白蛋白能激活caspase-12及caspase-3的活化及CCAT结合蛋白的表达，使用小干扰RNA技术沉默HK-2细胞的caspase-12基因，可以减少其细胞的凋亡。
在体内实验中，2008年Liu 等[41]首次在链脲菌素 (STZ)诱发的糖尿病大鼠中发现ERS激活的标志性蛋白GRP78在糖尿病大鼠肾脏中的表达上调，进一步对ERS相关的凋亡通路进行检测，证实CHOP、caspase12和JNK三条途径在DN中均有激
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活，提示DN的发病与ERS 触发的肾组织细胞凋亡密切相关。Cao YP[42]等同样在链脲菌素 (STZ)糖尿病大鼠模型中观察到6、8、12周大鼠肾脏中GRP78表达增加，并在8周达到高峰。Sun HL[43]用免疫组化的方法，观察24周时糖尿病大鼠肾脏病理切片，证实肾小管上皮细胞葡萄糖调节蛋白 78（GRP78/BiP)、 磷酸化载体启动因子2α(eIF2 α)、双链RNA-依赖的蛋白激酶-样内质网激酶(PERK) 和caspase-12表达均有明显增加。使用血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）类药物培哚普利治疗 24 周，ERS相关蛋白表达量及肾小管上皮细胞凋亡数目均有减少，尿蛋白量明显减少。SunHL因此提出针对内质网应激机制治疗DN的可行性及必要性。
在临床及病理实验研究中亦发现DN中存在ERS的激活。Lindenmeyer 等[44]对确诊的DN患者肾活检组织进行微阵列分析，发现UPR相关基因的表达明显上调，转录因子XBP-1、内质网分子伴侣蛋白HSPA5、HYOU1、及内质网分子伴侣如 GRP78 和氧调节蛋白150(oxygen-regulated protein 150，ORP150) 表达明显增加，证实了DN中 ERS 的激活，并且 ERS 的强度与肾脏病变程度密切相关。Liu YJ [45]对48例确诊为DN的肾活检的临床数据进行了分析。通过肾母细胞瘤-1 (WT-1）标记足细胞，估算足细胞密度，同时检测GRP78表达情况结果。结果表明：尿蛋白定量> 3.5 g/d 组的足细胞数量远远少于尿蛋白定量＜3.5g/d 组，其数量与尿蛋白定量呈负相关，GRP78也同尿蛋白定量呈负相关，可见内质网应激程度直接影响糖尿病肾病患者尿蛋白水平。
4、调控ERS对DN中炎症反应的抑制作用
由于ERS在众多慢性炎症及代谢性疾病的发病机制中占有重要地位，针对内质网应激治疗代谢性疾病已成为研究热点。目前，针对内质网应激治疗DN的研究方向主要包括：内质网稳定剂如分子伴侣4-苯基丁酸 (4-PBA)、牛磺胆汁酸 (TUDCA)，内质网应激处理，内质网应激相关基因敲除及沉默。
Luo ZF[46] 等用分子伴侣 4-苯基丁酸 (4-PBA)干预STZ糖尿病大鼠模型，发现肾脏组织中磷酸化的肌醇依赖酶α(p-IRE1α)、p47phox、酪氨酸(NT)和 核因子相关因子 2 (Nrf2) 表达均降低，羟脯氨酸含量、NADPH 氧化酶活性、NF-κB活
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性和表达量均降低，血清和尿液中丙二醛 (MDA) 含量和SOD活性也降低。Qi W[47]等同样用分子伴侣 4-苯基丁酸 (4-PBA)处理STZ糖尿病大鼠模型，发现4-PBA治疗可以抑制葡萄糖调节蛋白78（GRP78 ）的表达和磷酸化的PKR样ER激酶，肾组织中内质网应激标志蛋白GRP78，磷酸化的JNK和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）均明显减少，尿蛋白排泄率与尿MCP-1的浓度明显降低。以上两个实验在一定程度上说明了分子伴侣4-苯基丁酸针对性抑制内质网应激后，其氧化应激及相关级联炎症反应均有不同程度的减轻。Fang L[48]在体外实验中发现，小牛血清白蛋白 （BSA）可以诱导活化肾上皮细胞 (NRK 52E)的NLRP3炎性复合物（一个重要的ER标记钙网蛋白），化学分子伴侣牛磺胆汁酸 (TUDCA)被证明是ER稳态的强化剂，能减轻炎性复合物的激活。亦有学者尝试用于DN中大量蛋白尿的治疗，发现TUDCA可以降低蛋白尿，这些研究表明ERS似乎在蛋白尿致炎性复合物激活中发挥着重要的作用。同样，Hu RR[49]研究发现随着尿蛋白的增加，早期糖尿病肾病ab/ab小鼠的钙调磷酸酶（CaN）的表达增加，足细胞突触蛋白的表达减少，给予牛磺胆汁酸 (TUDCA)干预后，CaN表达减少。
一定程度的内质网应激可以纠正蛋白质折叠的错误，恢复和维持内质网动态平衡及细胞生存。有学者提出，可以使用小剂量的内质网应激诱导剂使内质网紊乱处于自我修复状态，达到治疗的目的。在体外应用高糖培养基刺激大鼠近端肾小管上皮细胞( NRK52E)的试验中，预先使用NADPH 氧化酶抑制剂 DPI(10μΜ)预处理激活ERS后，再给予高糖刺激24 h，发现与单用高糖刺激组相比，DPI 处理组NRK52 细胞内质网应激蛋白 GPP78、凋亡相关蛋白 caspase12 的表达均有显著下调[50]。
基因沉默技术在ERS的研究中亦得到应用。在ab/ab小鼠肾脏中组蛋白3赖氨酸4（H3K4）甲基转移酶SET7/9可诱导MCP-1的表达，小干扰RNA技术沉默SET7/9，可减弱H3K4及MCP-1的表达。小干扰RNA技术沉默XBP-1基因，可同时减轻SET7/9、H3K4及MCP-1的表达。提示ERS可以引起MCP-1的表达增加，部分是通过XBP-1诱导SET7/9的激活，同时也说明沉默ERS相关基因XBP-1可抑制MCP-1诱导的炎症反应的发生[51]。
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5、结语
ERS与糖尿病肾病的发病机制密切相关，近年来，已有大量临床及动物实验数据证明，糖尿病肾病患者及DN大鼠模型的肾脏中存在ERS的激活。迄今为止，虽然运用血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物在DN的治疗中取得了一定的成果，但仍然不能逆转DN的病情进展，特别是在大量蛋白尿时期，在临床工作中仍然缺少针对大量蛋白尿行之有效的治疗方法。针对ERS机制治疗DN为我们开辟了新的治疗靶点，但是，目前为止，内质网稳定剂分子伴侣、内质网应激处理、基因沉默技术还处于动物实验阶段，可应用于临床的安全有效的靶向ERS的药物还处于研究之中。
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