一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107937496 A(43)申请公布日 2018.04.20

(21)申请号 201810039485.3(22)申请日 2018.01.16

(71)申请人 良培基因生物科技（武汉）有限公司

地址 430000 湖北省武汉市东湖高新区高

新大道666号光谷生物城C6栋北楼5楼C6501、C6504(72)发明人 王昕昀　

(74)专利代理机构 上海精晟知识产权代理有限

公司 31253

代理人 冯子玲(51)Int.Cl.

C12Q 1/6858(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

()发明名称

一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法(57)摘要

本发明公开了一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法。以数字PCR为检测平台，针对EGFR G719X基因的三种变异形式设计用于检测EGFR G719X基因变异的上下游引物、探针，并将待测样品cfDNA模板、用于检测EGFR G719X基因变异的上下游引物、探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR微反应液滴进行PCR扩增反应，判断待测样品中是否含有EGFR G719X基因变异的模板和发生突变的模板含量。本发明的引物和探针特异性强，应用于PCR检测时灵敏度可达0.01％；且利用此套引物进行PCR扩增，扩增出来的片段仅94bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，能从cfDNA中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有重要作用；本方法能一次检测EGFR G719X基因的三种变异形式，大大降低临床检测成本及工作量。

权利要求书2页 说明书4页

序列表2页 附图2页

CN 107937496 ACN 107937496 A

权　利　要　求　书

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1.ddPCR技术检测EGFR G719X基因变异的引物和探针，其特征在于，EGFR G719X基因变异包括EGFR G719A基因变异、EGFR G719S基因变异和EGFR G719C基因变异，用于检测EGFR G719X基因变异的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测EGFR G719X基因变异的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，EGFR G719A基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，EGFR G719S基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，EGFR G719C基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，EGFR G719X野生型的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的ddPCR技术检测EGFR G719X基因变异的引物和探针，其特征在于，所述EGFR G719A基因变异的检测探针、EGFR G719S基因变异的检测探针、EGFR G719C基因变异的检测探针、EGFR G719X野生型的检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

3.一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)提取受试者骨髓、外周血或组织的cfDNA；2)以cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测EGFR G719X基因变异的上下游引物、EGFR G719X基因变异的检测探针、EGFR G719X野生型的检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；

所述EGFR G719X基因变异包括EGFR G719A基因变异、EGFR G719S基因变异和EGFR G719C基因变异，用于检测EGFR G719X基因变异的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测EGFR G719X基因变异的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，EGFR G719A基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，EGFR G719S基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，EGFR G719C基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，，EGFR G719X野生型的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

3)ddPCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；4)信号收集并进行结果判读：PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有EGFR G719X基因变异的模板和发生突变的模板数量及含量。

4.根据权利要求3所述的一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法，其特征在于，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为0.3～2ng/μL。

5.根据权利要求4所述的一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法，其特征在于，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为1ng/μL。

6.根据权利要求3所述的一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法，其特征在于，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均为400～700nM，EGFR G719X基因变异的检测探针、EGFR G719X野生型的检测探针含量均为200～400nM。

7.根据权利要求6所述的一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法，其特征在于，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均为500nM，EGFR G719X基因变异的检测探针、EGFR G719X野生型的检测探针含量均为250nM。

8.根据权利要求3所述的一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法，其特征在于，步骤4)中ddPCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为：将ddPCR混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴。

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9.根据权利要求3所述的一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法，其特征在于，步骤3)中PCR扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。

10.根据权利要求9所述的一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法，其特征在于，步骤3)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。

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说　明　书

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一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法

技术领域

[0001]本发明涉及生物技术领域中基因的分子生物学检测，尤其涉及一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法。背景技术

[0002]非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，尽管手术和化疗技术不断提高，但患者的预后仍较差，5年存活率小于20％。目前，以人表皮生长因子受体(epithelium growth factor receptor,EGFR)为靶点的分子靶向治疗已成为治疗NSCLC最重要的方式。

[0003]目前临床上使用的针对EGFR的靶向药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，EGFR-TKI通过抑制EGFR自身磷酸化而阻断EGFR信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞增殖分化，实现靶向治疗。EGFR-TKI的疗效与EGFR基因突变状况密切相关，EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21外显子，其中19和21号外显子突变覆盖突变的90％。外显子19的缺失和外显子21的替代突变，与肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的敏感性密切相关。EGFR基因突变除了常见的19外显子缺失和L858R活性突变外，外显子18点突变G719X大约占4％。这种突变EGFR-TKI治疗通常反应良好。因此，EGFR基因外显子18点突变G719X的检测可以很好的预测分子靶向药物的治疗效果，然而目前EGFR基因G719X变异检测仅能检测出其中的一种或两种变异形式。

[0004]血浆游离DNA(cfDNA)含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控肿瘤负荷的可靠指标。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，即使采用高效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段(如测序、ARMS-PCR)，仍难以准确而可靠地检测出肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。因此，迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者体内EGFR G719X基因变异的方法。发明内容

[0005]为了克服现有技术的上述不足，本发明的目的是针对患者非肿瘤组织中EGFR G719X基因变异检测灵敏度低的缺陷，提出一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法。该方法以数字PCR为检测平台，针对EGFR G719X基因的三种变异形式(G719A、G719S、G719C)设计合成用于检测EGFR G719X基因变异上下游引物、EGFR G719X基因变异检测探针，通过数字PCR技术判断待测样品中是否含有EGFR G719X基因变异的模板和发生突变的模板含量。该方法对于检测非肿瘤组织中EGFR G719X基因变异灵敏度高，且可同时检测EGFR G719X基因三种变异形式。[0006]为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：[0007]本发明提供了ddPCR技术检测EGFR G719X基因变异的引物和探针，EGFR G719X基

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因变异包括EGFR G719A基因变异、EGFR G719S基因变异和EGFR G719C基因变异，用于检测EGFR G719X基因变异的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测EGFR G719X基因变异的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，EGFR G719A基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，EGFR G719S基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，EGFR G719C基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，EGFR G719X野生型的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。[0008]进一步地，所述EGFR G719A基因变异的检测探针、EGFR G719S基因变异的检测探针、EGFR G719C基因变异的检测探针、EGFR G719X野生型的检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。[0009]本发明还提供了一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法，其特征在于，包含以下步骤：

[0010]1)提取受试者骨髓、外周血或组织的cfDNA；[0011]2)以cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测EGFR G719X基因变异的上下游引物、EGFR G719X基因变异的检测探针、EGFR G719X野生型的检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；[0012]所述EGFR G719X基因变异包括EGFR G719A基因变异、EGFR G719S基因变异和EGFR G719C基因变异，用于检测EGFR G719X基因变异的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测EGFR G719X基因变异的下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，EGFR G719A基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，EGFR G719S基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，EGFR G719C基因变异的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，，EGFR G719X野生型的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；[0013]3)ddPCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；[0014]4)信号收集并进行结果判读：PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有EGFR G719X基因变异的模板和发生突变的模板数量及含量。[0015]进一步地，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为0.3～2ng/μL。[0016]更进一步地，ddPCR混合液中cfDNA模板的含量为1ng/μL。[0017]进一步地，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均为400～700nM，EGFR G719X基因变异的检测探针、EGFR G719X野生型的检测探针含量均为200～400nM。[0018]更进一步地，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均为500nM，EGFR G719X基因变异的检测探针、EGFR G719X野生型的检测探针含量均为250nM。[0019]进一步地，步骤4)中ddPCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为：将ddPCR混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴。[0020]进一步地，步骤3)中PCR扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。[0021]更进一步地，步骤3)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。[0022]与现有技术相比，本发明的有益效果在于：[0023](1)本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于PCR检测时灵敏度可达到0.01％(即可以从1万个正常DNA分子中检测到一个突变分子的存在)，避免产生假阴性结果；

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(2)且利用本发明设计合成的引物进行PCR扩增，扩增出来的片段仅为94bp，特别

适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，因此可以从cfDNA中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用；[0025](3)本方法可以一次检测EGFR G719X基因的三种变异形式(G719A、G719S、G719C)，操作过程更加简便，大大减少了临床检测成本及工作量。附图说明

[0026]图1为实施例2中野生型EGFR基因的DNA样本的荧光检测结果；

[0027]图2为实施例2中突变体与野生型含量比为1/100的样本的荧光检测结果；[0028]图3为实施例2中突变体与野生型含量比为1/1000的样本的荧光检测结果；[0029]图4为实施例2中突变体与野生型含量比为1/10000的样本的荧光检测结果。具体实施方式

[0030]展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)。[0031]实施例1：ddPCR技术检测EGFR G719X基因变异的引物和探针的设计与合成[0032]针对EGFR基因外显子18的EGFR G719X的三种变异形式，以EGFR基因外显子18全长cDNA为模板，使用Oligo软件分析TaqMan引物和探针的位点，从中选择最佳组合如下：[0033]G719X变异上、下游引物：[0034]上游引物SEQ NO1：5’-GCTCCCAACCAAGCTCTCT-3’[0035]下游引物SEQ NO2：5’-CCTTATACACCGTGCCGAAC-3‘[0036]利用上述的引物进行PCR扩增时，扩增片段为94bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增。

[0037]设计的G719X变异检测探针均为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团，其序列如下：[0038]G719A检测探针为SEQ NO3：5’-FAM-TGCTGGCCTCCGG-MGB-3’[0039]G719S检测探针为SEQ NO4：5’-FAM-AAAGTGCTGAGCTCCG-MGB-3’[0040]G719C检测探针为SEQ NO5：5’-FAM-AAGTGCTGTGCTCCGGT-MGB-3’[0041]野生型检测探针为SEQ NO6：5’-HEX-AGTGCTGGGCTCCG-MGB-3’[0042]本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于PCR检测时灵敏度可达0.01％；且利用此套引物进行PCR扩增，扩增出来的片段仅94bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，能从cfDNA中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有重要作用；本实施例中提供的引物和探针应用于PCR检测时能一次检测EGFR G719X基因的三种变异形式，大大降低临床检测成本及工作量。[0043]实施例2：全血样本中EGFR G719X基因变异的检测[0044]1.准备待测样品：含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外显子18的三种变异形式

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(G719A、G719S、G719C)突变阳性DNA以及野生型突变DNA混合样本(其中突变体与野生型的含量比分别为1/100、1/1000、1/10000)。DNA来源于血浆中。其中，突变DNA模板来源于携带EGFR外显子18的G719A、G719S、G719C基因变异细胞系(经PCR测序鉴定)。[0045]2.cfDNA的提取：采用试剂盒提取cfDNA，具体的操作参见QIAGEN公司的QIA amp DNAMini Kit试剂盒说明书。

[0046]3.在PCR板中按照以下配比制备PCR反应液：2×数字PCR预混液(Biorad，#1863010)、用于检测EGFR G719X基因变异的上、下游引物、EGFR G719X基因变异的检测探针与待检测cfDNA模板混合，用蒸馏水补足至终体积为20mL，配制成数字PCR混合液。其中上、下游引物含量分别为500nM，检测探针含量分别为250nM。[0047]4.将装有配制好的20mL数字PCR混合液的PCR板、新的96孔PCR板、头、微滴发生卡和微滴生成油装入AutoDG自动化微滴发生器，用于制备PCR微反应微滴。[0048]5.将装有PCR微反应液滴的96孔PCR板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。

[0049]6.将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。

[0050]7.PCR扩增反应后将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪(QX200微滴荧光信号收集系统)中进行信号收集，检测FAM和VIC的荧光信号。用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析结果如图1、图2和图3所示。同时进行定量分析，得出样本中突变DNA的绝对含量以及相对总DNA的比例。例如，待测样本中含有X个突变型基因目标分子，Y个野生型基因目标分子。经过反应及检测后，结果采用这样的方式进行分析。

[0051]

则突变型基因检测数目为X＝B，野生型基因检测数目为Y＝C，其突变频率为X/(X+Y)＝B/(B+C)。

[0053]根据上述的方法对不同突变型与野生型的含量进行样品检测，突变阳性信号(FAM)与总信号数(FAM和VIC)如下：[00]1/100样品：计算值突变/野生＝1/100，误差为零；[0055]1/1000样品：计算值突变/野生＝1/1000，误差为零；[0056]1/10000样品：计算值突变/野生＝0.998/10000，误差0.2％。[0057]由此可知，突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/100-1/1000时，定量检测误差为零，突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/100-1/10000时，定量检测误差为0.2％，因此可以从cfDNA中检测到极低丰度的变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。

[0052]

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序　列　表

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序列表<110> 良培基因生物科技（武汉）有限公司<120> 一种利用数字PCR技术检测EGFR G719X基因变异的方法<160> 6<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1gctcccaacc aagctctct 19<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2ccttatacac cgtgccgaac 20<210> 3<211> 13<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3tgctggcctc cgg 13<210> 4<211> 16<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4aaagtgctga gctccg 16<210> 5<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5aagtgctgtg ctccggt 17<210> 6<211> 14<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6agtgctgggc tccg 14

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

图4

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