山东农业科学２０１２，４４（１）：７１～７４ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 基于变性梯度凝胶电泳的青县苹果再植障碍园 与丰产园土壤细菌多样性研究 张 一ｈ，王凤忠 ，杜秉海 ，靳志刚 ，李 妍 ，韩明渠 ，周 波ｈ ，毛志泉。一 （１．山东农业大学生命科学学院／山东省农业微生物重点实验室，山东泰安２７１０１８； ２．中国农业科学院农产品加工研究所，北京摘１００１９３；３．山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安２７１０１８） 要：为了分析比较青县苹果再植障碍园与丰产园的土壤细菌多样性，利用Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ软件对变性 梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）图谱进行多样性分析，并对ＤＧＧＥ图谱上的条带切胶测序，以分析群落结构。结果表 明，图谱各泳带中的条带数目相差不大，但其亮度有一定差异；ＤＧＧＥ图谱的峰图中，代表丰产园土壤样品的 峰具有较大的峰面积；再植障碍园与丰产园土壤中的主要菌群都属于 变形菌亚门（ 一Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放线 菌门（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、 变形菌亚门（ 一Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；仅存在于再植障碍园样品中的细菌属于厚壁菌门 （Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、 变形菌亚门（＾ｙ—Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放线菌门（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）。可见，环渤海湾苹果产区丰产园 土壤中的细菌群落与再植障碍园相比拥有较高的丰富度，两种果园有着相似的细菌群落多样性，造成两种果 园细菌群落结构差异的细菌具有多样性。 关键词：ＤＧＧＥ技术；土壤细菌多样性；再植障碍 中图分类号：Ｓ１５４．３８ １（２２２） 文献标识号：Ａ 文章编号：１００１—４９４２（２０１２）Ｏ１—００７１—０４ 果树再植障碍（Ｒｅｐｌａｎｔ ｐｒｏｂｌｅｍ）是指果园刨 除老树后重茬栽种新树时新植树根系发育不良、 幼树生长缓慢、植株矮小、抗性降低、甚至整株死 生物的群落结构并分析环境因子对此结构的影 响，对于了解微生物与这个特殊生态系统的相互 关系有很大的帮助，对于研究再植障碍的发生机 理有着重要的指导意义。 亡的现象¨ Ｊ，这种障碍表现在苹果树上尤为严 重 。 以往对微生物的研究多建立在传统的富集、 分离、培养基础上，而在环境样品中，能用现有技 术培养的微生物仅占微生物总种群数的０．０１％ ～前人研究结果表明，导致再植障碍的原因多 源于土壤，主要与果树根系生长的土壤理化性质、 土壤生物环境的变化以及化感作用有关－３］。同 时对再植障碍的发生机理做出了一些合理的解 释，并提出了多种可行的应对措施。近几年，有关 １０％ Ｊ，难以客观揭示环境中的微生物多样 性。分子生物技术的应用克服了传统方法的限 制，可以从基因水平上估计种的丰度和均度、查明 土壤中微生物群落结构变化的研究越来越受到研 究者的关注。 果园土壤是一个微生物种类和数量丰富，受 人为因素影响较大的复杂的特殊环境。微生物作 为物质循环和能量流动的重要参与者，对环境因 子的变化非常敏感＿５ ］，在果园土壤生态系统中 种的变异情况等，从而可以更客观地认识环境中 微生物的群落组成。基于１６Ｓ ｒＤＮＡ的微生物多 样性快速监测已成为现代微生物生态学研究的重 要手段，其中ＤＧＧＥ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃ． ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）技术是根据ＤＮＡ在不同浓度变性剂 中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化的 原理，将片段大小相同而碱基组成不同的ＤＮＡ片 起着特别重要的作用。因此，研究果园土壤中微 收稿日期：２０１１－Ｏ６—１８ 基金项目：“十二五”国家科技支撑计划（２０１１ＢＡＤ１１Ｂ０１）、现代农业产业技术体系建设专项资金（ｎｙｃｙｔｘ一０８—０３—０３）资助。 同等第一作者：张一（１９８７一），男，硕士研究生，主要从事环境微生物方面的研究，Ｅ～ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｉ８７５３＠１２６．ＣＯｒｎ｜ 王凤忠（１９７２一），男，副研究员，主要从事农业微生物方面的研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｆｅｎｇｚｈｏｎｇ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ ￥ 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｂｏ２７９８＠１６３．ｃｏｍ；Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｚｈｉｑｕａｎ＠ｓｄａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ７２ 山东农业科学 第４４卷 段分开，从而对微生物群落进行评价的一种较先 样品基因组总ＤＮＡ的提取、纯化使用Ｅ． Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＯＭＥＧＡ，ＵＳＡ）进行。 １．４ ＤＧＧＥ分析 进的分子生态学方法。由于其具有快速简便、分 辨率高、重复性好等优点，目前已广泛应用于各种 微生物群落多样性研究中。 河北青县位于中纬度季风区，有显著的 性季风气候特征：一是季风显著；二是冬寒夏 热，四季分明，春秋短促，气温年变差大；三是雨 １．４．１ ＰＣＲ产物的扩增及定量ＤＧＧＥ使用的 上游引物为ＧＣ一３５７Ｆ（５ 一ＣＧＣＣＣＧＣ ＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧ ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ一３’），下游引物为５１７Ｒ 季很短，集中在夏季，７、８两月降水量占全年的 （５ 一ＡＴｒＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ一３ ）。反应体系 ６４％～６８％，春季少雨，降水量的年际变化也很 为：ＤＮＡ模板２０ ｎｇ，上下游引物各１０ ｐｍｏｌ，Ｔａｑ 大。青县是我国苹果主要栽植区，但大片果园开 ＤＮＡ聚合酶２．５ Ｕ，ｄＮＴＰ（１０ ｍｍｏＬ／Ｌ）１ ｌ，１０× 始老化，需进行更新，由于土地资源有限，苹果再 ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（不含ＭｇＣ１２）５ Ｉｘｌ，ＭｇＣ１２ ３ ｌ，ｄｄＨ２０ 植普遍存在。 补足至５Ｏ ｌ。ＰＣＲ反应条件为：９５℃预变性５ 本试验以青县苹果再植障碍园与丰产园定位 ａｒｉｎ；９４￣Ｃ变性１ ｍｉｎ，５６￣Ｃ复性１ ｍｉｎ，７２￣Ｃ ３０ Ｓ， 取得的样品为研究对象，研究了青县苹果园土壤 ２５个循环；７２ｏＣ延伸１０ ｍｉｎ，４￣Ｃ保温。ＰＣＲ产物 的细菌群落在不同土层的结构特点及春、夏、秋三 用浓度为０．８％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用 季的多样性变化，并针对两类果园土壤样品中细 ＰＣＲ产物纯化试剂盒纯化。 菌群落的特点，从多样性、群落构成这两方面进行 将纯化后的ＰＣＲ产物利用分光光度计测量 了探讨，力图发现丰产园与再植障碍园土壤中细 ２６０ ｎｍ与２８０ ｎｍ下的吸光值，以测定每微升产 菌群落结构的差异性，为苹果再植障碍发生机理 物中的ＤＮＡ含量，并精确吸取含有２ ０００ ｎｇ ＤＮＡ 的研究和防治提供科学依据。 的ＰＣＲ产物，一２０ｏ【＝储存待用。 １材料与方法 ’ １．４．２电泳严格按照Ｂｉｏ—Ｒａｄ的ＤＧＧＥ说明 手册步骤操作。 １．１主要试剂和仪器 １．４．３连接测序 使用灭菌后的手术刀片将 Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｋｉｔ和ＰＣＲ产物纯化试 ＤＧＧＥ胶片上的条带切下，并按顺序编号。切下 剂盒购自美国ＯＭＥＧＡ公司；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、 的凝胶置于２０ ｌ无菌ｄｄＨ２Ｏ中，４ 静置１２ ｈ ｄＮＴＰ及相关试剂购自大连宝生物工程公司；所用 后１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１ ｍｉｎ，得到的上清液即为目 弓ｌ物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；基因 的条带的ＤＮＡ。 扫描由上海生工生物工程有限公司完成。 以离心后的上清液为模板，使用上游引物 ＤＧＧＥ仪，美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司；Ｔ—Ｇｒａｄｉｅｎｔ ３５７Ｆ（５ 一ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ一３ ）和下游 ＰＣＲ仪，德国Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司；ＧｅｌＤｏｃ—Ｉｔ凝胶成像 弓Ｉ物５１７Ｒ（５ 一ＡＴＦＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ一３ ）进 系统，美国ＵＶＰ公司；５８１０Ｒ型离心机（冷冻型）， 行扩增。扩增体系及程序与１．４．１中相同。 德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司。 将上述扩增产物与ｐＭＤ１８一Ｔ Ｖｅｃ￣ｒ连接， １．２土壤样品的采集及理化指标的测定 送样测序。 分别于２００９年４月２８日～５月１日（春季， 样品标记为ｓｐ）、７月２６日一２８日（夏季，样品标 ２结果与分析 记为ＳＵ）、１Ｏ月９日一１１日（秋季，样品标记为 ２．１ 青县苹果再植障碍园与丰产园土壤样品的 ａｕ）共’３次在河北青县苹果园采集土壤样品。设 细菌群落的ＤＧＧＥ图谱 置再植障碍园（标记为１）与丰产园（标记为２）两 从图１可以看出，１～１２号泳带中条带数目 个取样点，同一取样点选取０～２０ ｅｍ（标记为ａ）、 相差不大，说明两种果园土壤中的细菌群落拥有 ２０～４０ ｃｍ（标记为ｂ）两个深度，每个深度重复采 相似的多样性。其中ｅ、ｆ、ｈ、ｉ、ａ、ｊ、ｋ、Ｉｎ出现在所 样３次，土壤样品混匀后于０℃保存。 有样品中，代表土壤中的土著细菌群落；Ｌ、ｂ、ｃ、ｄ １．３土壤样品总ＤＮＡ的提取 仅出现在再植障碍园的样品中。 张 一等：基于变性梯度凝胶电泳的青县苹果再植障碍园 第１期 与丰产园土壤细菌多样性研究 ７３ 数目和亮度进行对比分析，其结果如图２所示。 可以看出，所有样品的峰主要集中于Ｒｆ ０．３～０．６ 和Ｒｆ０．９—１．０的区域中，这两个区域的峰拥有 较大的峰面积，说明这些峰代表的细菌是环渤海 湾苹果产区果园土壤中的主要细菌类群。丰产园 土壤样品的峰图拥有较大的峰面积，这说明丰产 园土壤中的细菌群落拥有较高的丰富度。 ２．３ ＤＧＧＥ图谱中主要条带的定性分析 对ＤＧＧＥ图谱中的主要条带进行定性分析， 结果显示存在于所有样品中的条带ｅ、ｆ、ｉ、ｋ、ｍ代 表的细菌类群属于放线菌门（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ），ｈ 代表的细菌类群属于Ｏｔ变形菌门（０ｃ—Ｐｒｏｔｅｏｂａｃ． 注：１～１２分别为Ｑｓｐｌａ、Ｑｓｕｌａ、Ｑａｕｌａ、Ｑｓｐ２ａ、Ｑｓｕ２ａ、Ｑａｕ２ａ、 ｔｅｒｉａ），ａ、ｊ代表的细菌类群属于 一变形菌亚门 Ｑｓｐｌｂ、Ｑｓｕｌｂ、Ｑａｕｌｂ、Ｑｓｐ２ｂ、Ｑｓｕ２ｂ、Ｑａｕ２ｂ。 图１ 青县苹果园土壤中细菌群落ＤＧＧＥ结果 （－ｙ—Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；仅存在于再植障碍园样品中 的条带Ｌ、ｃ代表的细菌类群属于放线菌门（Ａｃｔｉ． ２．２ ＤＧＧＥ峰图分析 ｎｏｂａｃｔｅｒｉａ），ｂ代表的细菌类群属于厚壁菌门（Ｆｉｒ． ＤＧＧＥ直观图谱中直接反应的信息量较少， ｍｉｃｕｔｅｓ），ｄ代表的细菌类群属于＾ｙ一变形菌亚门 所以采用Ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｎｅ对图１中所示各泳道条带 （ 一Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）。 一 图２ ＤＧＧＥ图谱的峰图分析 ３讨论与结论 果园土壤中细菌组成的多态性。 本试验通过直观分析和峰图对比发现，环渤 ＤＧＧＥ是一种快速、可靠的检测土壤微生物 海湾苹果产区丰产园土壤中的细菌群落与再植障 群落结构的指纹图谱技术。本研究利用该技术对 碍园相比拥有较高的丰富度；两类果园土壤中的 环渤海湾苹果产区再植障碍园与丰产园土壤样品 细菌群落拥有相似的多样性；再植障碍园与丰产 的细菌群落组成进行对比研究，揭示了此地区苹 园土壤中的主要菌群都属于厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉ． ７４ 山东农业科学 第４４卷 ｃｕｔｅｓ）、＾ｙ变形菌门（＾ｙ—Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、放线菌门 ［５］赵其年．苹果重茬再植障碍影响程度调查［Ｊ］．山西果树， ２００５，６：４０． （Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、 变形菌门（ＯＬ—Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅ． ｒｉａ）；仅存在于再植障碍园样品中的细菌属于厚 壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、＾ｙ变形菌门（ 一Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅ— ｒｉａ）、放线菌门（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）。此结果指出了环 渤海湾苹果产区果园土壤中的主要菌群，同时也 说明了造成两种果园细菌群落结构差异的细菌所 具有的多样性。 参考文献： ［６］Ｄｏｒａｎ Ｊ Ｗ，Ｚｅｉｓｓ Ｍ Ｒ Ｓｏｉｌ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ：Ｍａｎａｇ－ ｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｔｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｓｏｉｌ ｑｕａｌｉｙ［Ｊ］．Ａｐｐ１．Ｓｔｏｉｌ Ｅｃｏ１．， ２０００。１５：３一ｌ１． ［７］ Ｓｔｅｎｂｅｒｇ Ｂ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｓｏｉｌ ｑｕａｌｉｙ ｔｏｆ ａｒａｂｌｅ ｌａｎｄ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ－ ｉｃａｌ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｓｏｉｌ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，１９９９，４９（１）：１—２４． ［８］Ａｍａｎｎ Ｒ Ｉ，Ｌｕｄｗｉｇ Ｗ，Ｓｅｈｌｅｉｆｅｒ Ｋ Ｈ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｉｄｅｎｔｉｉｆ． ｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉ，ｌ ｓ／ｔｕ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｌａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．Ｒｅｖ．，１９９５，５９：１４３—１６９． ［９］Ｗｉｌｓｏｎ Ｊ Ｂ．Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｆｉｔｉｔｎｇｄｏｍｉｎａｎｃｅ／ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＣＵｌＷｅＳ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｇｅｔａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２：３５—４６． Ｈｏｎｓｔｒａ Ｈ．Ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｍａｒｋｓ ｏｎ ｒｅｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｈｏｔ－ ｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，１９８８，２３３：１１—１６． ［１０］Ｗｉｔｔｅｂｏｌｌｅ Ｌ，Ｍａｒｚｏｒａｔｉ Ｍ，Ｃｌｅｍｅｎｔ Ｌ，ｅｔ １ａ．Ｉｎｉｔｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｅｖｅｎｎｅｓｓ ｆａｖｏｕｒｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｕｎｄｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｔｅｒｓｓ［Ｊ］．Ｎａ－ ｔｕｒｅ，２００９，４５８：６２３—６２６． ｆｅｅ Ｂ Ａ，Ａｂａｗｉ Ｇ Ｓ，Ｍａｉ Ｗ Ｅ Ｆｕｎｇｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｏｏｔｓ ［２］ Ｊａｆｏｆ ａｐｐｌｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｓｏｉｌ ｆｒｏｍ ａｎ ａｐｐｌｅ ｒｅｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ［１ １］Ｗｕ ｘ Ｌ，Ｃｏｎｒａｄ Ｒ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｄ ｓｔａｒｕｃｔｕｒｌ ａｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ａ ｃｅｌ— ｌｕｌｏｓｅ——ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉｌ ｃｏｍｍｕｎｉａｙ ｔｏ ｍｕｌｔｔｉ－・ ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，１９８２，６６（１０）：９４２—９４４． ［３］ 杨兴洪，罗新书．果树再植问题的研究进展［Ｊ］．果树科 学，１９９１，８（４）：２３９—２４４． ｐｉｅ ａｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ａｔ ｔＷＯ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ－ １ｊ］ｊ、Ｊ ］ ｍｅｎｔｌ Ｍｉａｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，３：３５５—３６２． ［４］ 马彦，魏学信，于良祖．苹果树再植障碍试验［Ｊ］．北方 果树，１９９６，１：７—８． 、■ （上接第７Ｏ页）Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ、森茂生物有机 肥。通过分析不同种类肥料的养分含量、对土壤 肥力和茶叶品质的影响效果并结合肥料成本综合 考虑，与其他三种有机肥相比，八福仙和豆粕蛋白 两种有机肥更适合用于崂山区茶业生产。 ３．３ 由于甜叶菊有机肥、Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ、森茂 出版社，１９９２． 郭桂义，胡孔峰，袁王丁．信阳毛尖茶的化学成分［Ｊ］．食 品科技，２００６，９：２９８—３０１． 霞，赖穗生．几种茶叶中茶多酚含量的比较［Ｊ］．科技 资讯，２００９，２４：２１２． 陆松侯，施兆鹏．茶叶评审与检验（第３版）［Ｍ］．北京：中 国农业出版社，２００１． 生物有机肥中的铬含量均超过有机茶生产对铬含 量的最高含量标准（７０ ｍｇ／ｋｇ），该试验茶园是经 过认证的有机茶生产基地，所以这三种有机肥不 胡承孝，黄芳鹤．湖北省部分茶园土壤肥力级茶树营养状 况的分析［Ｊ］．华中农业大学学报，１９９７，１６（３）：２８７—２９０． 中华人民共和国农业部．茶叶产地环境技术条件［ｓ］．标 准编号ＮＹ／Ｔ ８５３—２００４，中国标准分类号Ｚ５Ｉ，国际标准 分类号１３．０２０．５０． 可在此处使用。 参考文献： 高瑞风，王政，孙宁波，等．青岛市茶园土壤肥力及环境 质量现状分析［Ｊ］．青岛农业大学学报（自然科学版）， ２００８，２５（１）：４３—４７． ［１］ 庄晚芳主编．茶树栽培学（第２版）［Ｍ］．北京：中国农业
