基因工程导论重点

1、生物技术：传统生物技术、工业生物发酵技术、现代生物技术（基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程）。基因工程：是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，利用分子生物学的手段，在体外操纵、改造、重建细胞的基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，获得人们所需的性状，并能稳定地遗传给后代。特点：基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性。

2、DNA重组：利用供体生物的遗传物质，或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物。

3、基因工程的理论依据：同基因具有相同的物质基础；基因是可以切割的；基因是可以转移的；多肽与基因之间存在对应关系；遗传密码是通用的；基因通过复制可以把信息传递给下一代。

4、基因工程的实施步骤：取得符合人们要求的DNA片段；目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；把重组DNA引入某种细胞；把目的基因能表达的受体细胞挑选出来；形成新的目标产品。

5、基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷段序列，是遗传物质的最小功能单位。外显子：能够编码蛋白质的序列叫做外显子。内显子：不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA。

6、原核生物的基因组结构特点：染色体数量少；DNA大多为双螺旋结构，少数以单链形式存在；结构简单，基因组小，DNA一般只有单一复制起点，基因的编码通常是连续的，中间无非编码成分；转录单元，基因组中功能相关的基因常集中在基因组的一个或几个特定部位，形成一个功能单位或转录单元，其活性受到同步调控，它们可被转录为多个mRNA分子，叫多顺反子；存在重叠基因。真核生物的基因组结构特点：染色体数量多，结构复杂；DNA结构，都是双链双螺旋结构，核苷段为线状。含有原核生物不同的染色体核外遗传因子，如线粒体DNA，植物的叶绿体DNA等；基因组大，结构复杂，DNA有多个复制起点。每个基因组中含有数万个基因；含多种不同程度的重复序列；基因家族：真核生物都是单顺反子，即一个结构基因转录一个mRNA分子、翻译一条多肽链。许多功能相关的基因成套组合，形成基因家族；基因编码不连续，含断裂基因。

7、基因多级调控：基因激活→转录起始→转录后加工→mRNA降解→蛋白质翻译→翻译后加工→蛋白质降解。基因转录激活调节基本要素：原核生物—操纵子：启动序列→操纵序列→编码序列；真核生物—顺式作用元件：启动子→增强子→沉默子。调节蛋白：原核生物—特异因子（识别启动序列）、阻遏蛋白（结合操纵序列）、激活蛋白（与启动子附近DNA结合）；真核生物—转录因子（反式作用蛋白和顺式作用蛋白）。

8、原核基因转录调节：操纵子模型、多顺反子、阻遏蛋白调节。

9、真核基因转录调节：DNA水平的基因调控是通过改变基因组中有关基因的数量和顺序结构而实现的基因调控。转录前的调控:组蛋白（正电荷）与带负电荷的DNA结合抑制了基因的转录；非组蛋白原来连接在DNA的某一特定位置上，当非组蛋白磷酸化以后，磷酸基带负电荷，于是非组蛋白与带正电荷的组蛋白结合成复合物，这个复合物与带负电荷的DNA相排斥，就从DNA上脱离下来。这样，使原来与组蛋白结合的那个区段的DNA暴露出来，裸露的这段DNA可被RNA聚合酶识别而开始转录，可以解除组蛋白对基因的抑制作用。转录后调控:在真核细胞中，基因转录的最初产物是前体mRNA，其长度比成熟的mRNA长得多，经过剪切、拼接、戴帽和加尾等加工，才能形成成熟的mRNA。翻译水平的调控:真核生物基因的翻译调控的一个重要作用是控制mRNA的稳定性。在某些真核细胞中的mRNA进入细胞质以后，并不立即作为模板进行蛋白质合成，而是与一些蛋白质结合形成RNA蛋白质(RNP)颗粒。这种状态的mRNA的半衰期可以延长。mRNA的寿命越长，以它为模板进行翻译的次数越多。翻译后调控:真核生物基因翻译的最初产物是一个大的蛋白质分子。有时，必须经酶切成更小的分子才能有生物活性。这个过程属于翻译后修饰。

10、基因工程中的工具酶：限制性核酸内切酶：切割DNA；DNA连接酶：生成3’→5’磷酸二酯键；DNA聚合酶：探针标记、补平3’末端；反转录酶：cDNA合成；多聚核苷酸激酶：5’磷酸化、探针标记；末端转移酶：3’末端多聚尾；碱性磷酸酶：切除末端磷酸基。

11、限制酶：保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。酶切特点：大部分识别位点的DNA序列具有回文结构；切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；错位切割产生具有5’-或3’突出的黏端；而沿对称轴切割双链DNA产生平端；少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，在一定条件下可选择用这些同尾酶。Ⅱ型限制性内切酶：识别顺序是一个回文对称结构，限制酶的识别序列一般为４－８个核苷酸。分子生物学上所说的酶切位点即限制酶的识别序列的回文结构。两种切割方式：粘性末端和平端。同裂酶：同序同切酶：识别和切割位置都相同；同序异切酶：识别的序列相同，它们的切割为点不同；同功多位：许多识别简并序列的限制酶包括了另一种限制酶的功能。同尾酶：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对成的，即它们可产

生相同的黏性突出末端。星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性。

12、DNA聚合酶：DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成及其相辅的活性。酶切特点：要有底物4种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前提催化合成DNA，产物的性质与模板编码相同；接受模板指导；需要有引物（3’羟基）的存在；不能起始合成新的DNA 链；催化dNTP加到伸长中的DNA链的3’-OH末端；催化DNA合成的方向是5’- 3’。反转录酶：又称为依赖RNA的DNA聚合酶。一种病毒中存在一种特殊的DNA聚合酶，这种酶能以RNA 为模板合成DNA，这个过程与一般的遗传信息转录方向相反，所以称为反砖录。连接酶：连接酶是将两段核苷酸连接起来的酶，相当于基因工程中的糨糊，现在已经发现来源或作用不同底物的连接酶。

13、基因工程的载体：能使外源DNA复制的复制子就是载体。它是基因空间结构上独立的复制单位。载体的特点：能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在其DNA中插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性；易于从宿主细胞中分离，并进行纯化；DNA序列中有适当的限制性酶切位点，最好是单一酶切位点，并位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制；具有能够观察的表型特征，即存在报告基因，在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。载体的种类：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体。载体的报告基因（标记基因）：基因工程中利用载体上特地引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。标记基因代表：氨苄青霉素抗性基因；四环素抗性基因；氯霉素抗性基因；卡那霉素和新霉素抗性基因。载体的基本要求：能自主复制：一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代；对宿主生存不是必需的，但是能带给细菌新的遗传性状；都有一个复制起始区和复制起点（ori）：不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关；有一套完整的复制调节结构：该结构对质粒复制拷贝数进行调控；分子质量尽可能小，多拷贝，便于提取和纯化。在细胞中拷贝数多、扩增后回收率高；质粒不会从一个细菌接触转移到另一个细菌；插入外源基因的重组质粒，较易导入到宿主菌内复制和表达，松弛型质粒的复制起始位点；具有一个和几个报告基因，而且限制性内切酶的单切点恰好在此基因之内；具有多克隆位点。载体的致死效应：利用质粒或噬菌体进行基因克隆时，有时大量的克隆化基因（周围的基因的合成消耗大量宿主细胞的营养和能量）和克隆基因产物可能是有害的，例如大量表达目的蛋白质不利于宿主菌的生长繁殖，甚至可使宿主菌中毒死亡，即载体导致宿主细胞呈现致死效应。对策：使用严密型质粒载体来分离、纯化多拷贝的松弛型质粒上大量表达时可呈现致死效应的功能性基因，也就是用松弛型质粒与严密型质粒杂交改良；使用温度敏感型载体。有的载体有强启动子而大量表达蛋白质造成致死效应，因此构建一些含有ג噬菌体pL启动子的pKC30质粒，在宿主菌的基因组中整合一个温度敏感的ג抑制子基因（如גcITS857）。31℃-42℃

14、质粒载体的多克隆位点：现在几乎所有的基因工程载体都有一个人工合成的密集排列的多克隆位点，称为载体多克隆位点，或称多接头或称限制性酶切位点库，由常用的限制性内切酶多能识别的序列组成。这些酶切位点一般都是单一的，在载体的其它部位不存在这些位点。质粒载体：质粒太大；对一个限制性酶来讲有多个酶切位点；选择标记基因的加入改造：质粒中的大部分可以切除，也可以在该部分中插入一段外源DNA，而不影响质粒复制与表达。这一特性是对质粒进行人工改造并作为基因工程载体的分子基础。

15、基因工程育种特点：不受亲缘关系限制，可以实现动物、植物、微生物之间的基因交流；有效打破有利基因与不利基因的连锁；加快育种进程，缩短育种年限。

16、植物遗传转化技术：一类是直接基因转移技术：包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法: 主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 17、根癌农杆菌介导的植物转基因：T-DNA以单链蛋白质复合体的形式转移到植物细胞中，线性单链DNA很快会转变成双链；T-DNA在植物细胞中没有固定的整合位置；一般来讲，与直接转化方法相比，农杆菌介导的T-DNA的整合主要以单拷贝为主，也有多拷贝转化产生。基因枪介导法：基因枪（particle gun）又称微弹轰击法（microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)，是以来高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。组成部分：点火装置、发射装置、挡板、样品室、真空系统组成。步骤：无菌材料的获得和培养；质粒及其制备；基因枪转化；转化体的筛选和再生。优点：无宿主限制；靶受体类型十分广泛；生物安全性优于农杆菌法；可控度高；

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缺点：转化频率低，10-10；嵌合体多；结果的重复性差；拷贝数多。电击法：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电击穿孔”，细胞膜上会出现短暂可逆性开放小孔，为外源物质提供通道，借此可以导入外源DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒等多种生物大分子以及核苷酸和染料等多种小分子。PEG转化法：PEG法最早用于植物原生质体融合研究，1982年受次用于转化研究，其作用是在二价阳离子存在下促进原生质体对外源DNA的吸收，同时还保护外源DNA免受核酸酶的降解。占5.3%。

18、转基因植株的分子鉴定：抗性植株的基因组DNA的小量提取；选择标记基因Bar和启动子序列的扩增初筛；阳性扩增植株再进行目标基因的扩增；扩增均为阳性的植株初步鉴定为转基因植株。

19、基因文库：指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。基因组 DNA 文库：指将某生物体的全部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。

20、转基因对环境的影响：对生物群落的影响；转基因的逃逸；转基因食品的安全性。转基因食品安全性：转基因食品中的外源DNA是否会转移；外源基因编码蛋白是否有直接毒性；外源基因中抗生素标识基因是否会引起抗性；转基因植物性食品是否存在过敏原；转基因食品中外源基因的次生效应是否对人体有危害；转基因食品的营养变化所带来的非期望效应。转基因安全性评价的指标、内容：任何提供目的基因的供体和接受基因改造的受体必须明确其在生物学上的分类和基因型及表现型；进行基因改造用的基因材料的片段大小与序列必须清楚，不能编码任何有害物质；为避免基因改造携带的抗抗生素基因在人体胃肠向病原微生物转化使之产生耐药性，要求对载体进行改造以尽可能减少载体对其他微生物转化的可能性；引入外源基因的重组DNA应稳定，不能导致宿主某些功能基因的失活和某些基因的激活；对含有致过敏的基因改造食品，必须标明其可能引起过敏，方可进入市场；对基因改造的微生物、植物和动物性食品应建立数据库，以便从中获取资料对其与传统食品进行比较。

21、PCR反应：变性（90～97℃）；退火（45～55℃）；延伸（72℃左右）。PCR反应体系：缓冲液；脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的底物，dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性；引物：习惯上引物浓度为各 1mM；

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DNA 聚合酶；模板：模板的数量会直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR 扩增，10至10个模板分子可达到满意的效果。平台效应（plateau effect）：PCR 过程经过一定次数的循环后，待阔增的DNA片段不再以指数关系继续累积，而是进入以线性关系累积或停止累积的平台期。PCR 反应特点：特异性强；灵敏度高；简便、快捷；对标本的纯度要求低。

22、原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。DNA凝胶电泳技术： 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率；电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比；电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比；摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关；如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状；形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。 电泳的目的：测量核酸分子大小；检测核酸分子的量；检测核酸分子质量。