生堡凼坌鲨垡遨盘查垫！！堡！Ｑ旦箜！！鲞箜！Ｑ塑鱼！垫』垦！！！！互！型丛！堂：Ｑ！！！！竺垫！！：！塑：！！，盟！：！Ｑ・８９５・・基础研究・ＧＬＰ．１受体激动剂对小鼠棕色脂肪细胞基因表达和细胞分化的研究沈山梅石欢毕艳冯文焕王维敏金玺韩小娟胡明胡朱大龙【摘要】目的研究胰升糖素样肽１（ＧＬＰ．１）受体激动剂对小鼠棕色脂肪细胞功能基因表达和分化的作用。方法体外培养小鼠棕色脂肪前体细胞，诱导分化前分４组：ＧＬＰ一１（１０４ｍｏｌｆＬ）组、ＧＬＰ一１（１０４ｍｏｌ／Ｌ）组、Ｌ—ＮＡＭＥ（一氧化氮合酶抑制剂，１０。ｍｏｌ／Ｌ）组和对照组。干预结束后对细胞进行形态学观察研究，应用荧光定量ＰＣＲ检测棕色脂肪细胞基因的表达，采用单因素方差分析进行多组间均数比较。结果形态学研究发现ＧＬＰ一１组细胞内脂滴数目较对照组明显增加，荧光定量ＰＣＲ检测显示ＧＬＰ－１组棕色脂肪特异性基因『解耦连蛋白１（ＵＣＰｌ）、细胞死亡介导的ＤＮＡ碎片因子样受体ａ（Ｃｉｄｅａ）、过氧化物酶增殖物激活受体１共激活因子１Ｑ（ＰＧＣｌ—０【）］、分化基因［ＰＲ包含域１６区（ＰＲＤＭｌ６）、过氧化物酶增殖物激活受体１（ＰＰＡＲ一－ｙ）］、一氧化氮途径基因［内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）、诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）］的表达均高于对照组，Ｆ值分别为１７．３６、２９．５７、６６．７６、１３．７８、４．１４、１０５．４７、３４６．５７（均Ｐ＜０．０５）。结论ＧＬＰ－１受体激动剂可能通过某些途径促进棕色脂肪细胞功能基因表达的增加，增强棕色脂肪组织的功能，促进棕色脂肪前体细胞向成熟的棕色脂肪细胞分化，且高浓度ＧＬＰ一１的作用更明显。【关键词】胰升糖素样肽１；棕色脂肪；艾塞那肽；解耦连蛋白１；白色脂肪；一氧化氮合酶Ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｍｉｃｅｏｎｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒａｇｏｎｉｓｔｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓＳＨＥＮＳｈａｈ—ｍｅｉ．ＳｉｌｌＨｕａｎ．Ｂ１Ｙａｎ．ＦＥＮＧＷｅｎ．ｈｕａｎ，ＷＡＮＧＷｅｉ—ｍｉｎ，ＪＩＮＸｉ，ＨＡＮＸｉａｏ－ｊｕａｎ，ＨＵＭｉｎｇ．ｙｕｅ．ＺＨＵＤａ—ｌｏｎｇ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．ＮａｎｊｉｎｇＤｒｕｍＴｏｗｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ，￡＾ｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００８，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺＨＵＤａ—ｌｏｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｕｄａｔｏｎｇ＠巧ｕ．ｅｄｕ．ｅｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｃａｇｏｎ・ｌｉｋｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎｉｎｐｅｐｔｉｄｅ一１（ＧＬＰ・１）ｒｅｃｅｐｔｏｒａｇｏｎｉｓｔｏｎｔｈｅｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓｖｉｔｒｏ．Ｂｅｆｏｒｅｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．ｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅＰｒｉｍａｒｙｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎｍｉｃｅｗｅｒｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄａｓｓｉｇｎｅｄｔｏｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓ：ＧＬＰ－１１０—８ｍｏＬ／Ｌｇｒｏｕｐ，ＧＬＰ・１１０一’ｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ，Ｌ－ＮＡＭＥ１０ｍｏｌ／Ｌｇｒｏｕｐ，ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｐｕｔｕｎｄｅｒｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｇｅｎｅｓｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ．ＴｈｅＴｈｅｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｓｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎＧＬＰ－ｌｇｒｏｕｐｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｕｎｄｅｒｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｓ［ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１（ＵＣＰｌ），ｃｅｌｌｄｅａｔｈ—ｉｎｄｕｃｉｎｇＤＦＦＡ（ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒａ）一ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒａｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ（Ｃｉｄｅａ），ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ—ａｃｔｉｖａｔｅｄＲＩＺｌｎｉｔｒｉｃｌｅｔ（ＰＧＣＩ一０【）］，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｇｅｎｅｓ［ＰＲＤｌ一ＢＦｌ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１６（ＰＲＤＭｌ６），ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ－＾ｙ（ＰＰＡＲ一＾ｙ）］，ｏｘｉｄｅｐａｔｈｗａｙｇｅｎｅｓ『ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ｅＮＯＳ），ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）］ｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ吖ｃｏａｅｔｉｖｅｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｅｙｔｅｓｉｎＧＬＰ—ｌｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ＦｖａｌｕｅｓｗｅｒｅＧ１２—１ｒｅｃｅｐｔｏｒ１７．３６，２９．５７，６６．７６，１３．７８，４．１４，１０５．４７，３４６．５７ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（ａｌｌＰ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｓａｇｏｎｉｓｔｍａｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎｍｉｃｅ，ｔｈｅｒｅｂｙｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｓｍｏｒｅｅｖｉｄｅｎｔｉｎｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＧＬＰ－１．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｇｌｕｃａｇｏｎ—ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ一１；Ｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｓｅ；Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ；Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１；Ｗｈｉｔｅａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ；Ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ（Ｃ＾ｉｎＪＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ。２０１３，２９：８９５—８９９）体内脂肪组织可分为棕色脂肪组织（ｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｓｅ机体内白色脂肪堆积过多会造成肥胖。不同于白色脂肪，棕色脂肪可在人体摄食或受寒冷刺激时，散发热量，分解产热，维持体温。艾塞那肽（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ），胰升糖素样肽１（ＧＬＰ一１）受体激动剂，多用于治疗肥胖的２型糖尿病患者。既往研究证实，ＧＬＰ一１及其受体激动剂可以抑制肝糖原输出，通过不依赖于胰岛素和胰升ｔｉｓｓｕｅ）和白色脂肪组织（ｗｈｉｔｅａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ）。ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１０００６６９９．２０１３．１０．０１８基金项目：国家自然科学基金项目（８１２７０９０６）作者单位：２１０００８南京医科大学附属南京鼓楼医院内分泌科通信作者：朱大龙，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｕｄａｌｏｎｇ＠ｎｊｕ．ｅｄｕ，Ｃ１１万方数据・８９６・中华内分泌代谢杂志２０１３年１０月第２９卷第１０期ＣｈｉｎＪＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１３，ｙ！！．２９，堕！．！！糖素的分泌促进外周组织对葡萄糖的利用．并作用于中枢食欲控制系统，增加饱感，降低体重［１］。同时ＧＬＰ一１具有内皮依赖性血管舒张作用，即一氧化氮（ＮＯ）介导的血管内皮保护作用【２］。棕色脂肪组织可以通过ＮＯ促进脂肪细胞线粒体的生物合成，分解产热，维持体温［３］。增加体内的棕色脂肪组织，可以发挥改善肥胖，增加能量代谢，从而改善糖脂代谢紊乱的作用［４］。目前，对于ＧＬＰ．１在脂肪组织中作用的研究主要集中在其对成熟脂肪细胞葡萄糖摄取能力的改变及其对成熟脂肪细胞脂质合成和水解作用的影响。在人白色脂肪细胞的中，低浓度ＧＬＰ一１（１０。１２ｍｏｌ／Ｌ）以促进脂质生成作用为主，而较高浓度（１０。ｏｍｏｌ／Ｌ）则表现为脂解作用，但其脂解作用可被胰岛素扭转。而ＧＬＰ一１是否对棕色脂肪组织细胞功能、分化这一过程色脂肪细胞培养液：４４％ＤＭＥＭ高糖培养液＋４４％ＤＭＥＭ—Ｆ１２高糖培养液＋１０％胎牛血清＋５０ＵＩ青霉素＋５０¨ｇ／ｍｌ链霉素＋２０ｎｍｏＬ／Ｌ胰岛素＋１０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ（诱导分化后再加１ｎｍｏｌ／Ｌｒ１１３）；（３）棕色脂肪细胞诱导液：４４％ＤＭＥＭ高糖培养液＋４４％ＤＭＥＭ．Ｆ１２高糖培养液＋１０％胎牛血清＋５０ｕＩ青霉素＋５０斗ｇ／ｍｌ链霉素＋０．２５米松。二、方法ｍｍｏｌ／ＬＩＢＭＸ＋０．２ｂＬｍｏｌ／Ｌ地塞１．棕色脂肪细胞原代培养［５］：４周龄Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ雄鼠断颈处死．取出肩胛间区、腋窝下棕色脂肪组织，剪成约１ｍｍ３的小块。棕色脂肪组织消化液进行消化．３７℃水浴振荡约１ｈ。消化液分别用孔径３０目、３００目的筛网过滤。离心，收集细胞悬液，细胞计数，稀释成３ｘ１０４／ｍｌ～５×１０４／ｍｌ后将棕色脂肪前体细胞悬液接种到细胞培养瓶中，并用反复贴壁法除去其中存在影响尚不清楚。本研究使用ＧＬＰ．１受体激动剂艾塞那肽干预体外培养的小鼠棕色脂肪细胞，旨在研究不同浓度的ＧＬＰ一１受体激动剂对小鼠棕色脂肪细胞分化和功能基因表达的作用．并明确其作用通路。为ＧＬＰ．１受体激动剂的作用机制补充进一步的理论基础。材料和方法一、材料的成纤维细胞。倒置显微镜下观察后置于３７℃５％ｃ０，孵育箱中培养。２ｄ后，将细胞悬浊液平均分人６孑Ｌ板，保持最终数量为１只小鼠／孑Ｌ，培养液换成诱导液，并分别加入ＧＬＰ一１和Ｌ—ＮＡＭＥ。将细胞分为：Ａ组：ＧＬＰ一１１０～ｍｏｌ／Ｌ；Ｂ组：ＧＬＰ一１１０一ｍｏｌ／Ｌ；Ｃ组：Ｌ—ＮＡＭＥ１０～ｍｏｌ／Ｌ：Ｄ组：对照组。２ｄ后冲洗细胞。换成棕色脂肪细胞培养液。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠（雄性，４周龄，安徽蚌埠蓝晶生物科技有限公司），２型胶原酶（美国Ｓｉｇｍａ公司），ＤＭＥＭ高糖培养基、ＤＭＥＭ．Ｆ１２高糖培养基、胎牛血清（美国Ｇｉｂｃｏ公司），艾塞那肽（百泌达，美国礼来公司），Ｌ．ＮＡＭＥ、地塞米松（美国Ｓｉｇｍａ公司），Ｔｆｉｚｏｌ、２．棕色脂肪细胞干预４ｄ后，收集细胞，提ＲＮＡ，逆转录为ＤＮＡ，使用荧光定量ＰＣＲ检测棕色脂肪细胞在不同药物的作用下解耦连蛋白１（ＵＣＰｌ）、细胞死亡介导的ＤＮＡ碎片因子样受体ａ（Ｃｉｄｅａ）、过氧化物酶增殖物激活受体吖共激活因子１仪（ＰＧＣｌ一Ｏｔ）、ＰＲ包含域１６区（ＰＲＤＭｌ６）、过氧化物酶增殖物激活受体叫ＲＮＡ提取试剂盒及引物（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司），逆转录试剂盒（日本Ｔａｋａｒａ公司），ＰＣＲ试剂盒（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）。（１）棕色脂肪组织消化液：２型胶原酶１．５ｇ／Ｌ，牛血清白蛋白２０ｇ／Ｌ，ＨＥＰＥＳ酸１．２∥Ｌ，（ＰＰＡＲ一＾ｙ）、内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）、诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）基因的表达量。荧光定量ＰＣＲ中各基因引物序列见表１。三、统计学处理并使用ＰＢＳ定容调制ｐＨ７．４，用时３７℃预热；（２）棕表１引物序列Ｔａｂ１Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ注：ＵＣＰｌ：解耦连蛋白．１Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｌ；Ｃｉｄｅａ：细胞死亡介导的ＤＮＡ碎片因子样受体ａａ）一ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒＣｅｌｌｄｅａｔｈ—ｉｎｄｕｃｉｎｇＤＦＦＡ（ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒａ；ＰＧＣｌ．ｄ：过氧化物酶增殖物激活受体１共激活因子１ｄＰｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ３＇ｃｏａｃｔｉｖｅｌｍ；ＰＰＡＲ－吖：过氧化物酶增殖物激活受体吖Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒｓ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ一３＇；ＰＲＤＭｌ６：ＰＲ包含域１６区ＰＲＤｌ一ＢＦｌ一ＲＩＺｌｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎ９１６；ｅＮＯＳ：内皮型一氧化氮合酶Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ；ｉＮＯＳ：诱导型一氧化氮合酶Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ万方数据干预后ＡｔｉｅｒＡＢＣＤ注：ＧＬＰ一１：胰升糖素样肽ｌＧｌｕｃａｇｏｎ—ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ．１；Ａ：ＧＬＰ—ｌ１０一ｍｏｌ／Ｌ；Ｂ：ＧＬＰ．１１０一ｍｏｌｆＬ；Ｃ：Ｌ－ＮＡＭＥ１０～ｍｏＬ／Ｌ；Ｄ：对照Ｃｏｎｔｒｏｌ图１Ｆｉｇ１原代棕色脂肪细胞干预前后比较Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｉｎｍｉｃｅｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｔｈｅｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ采用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行处理，数据以元±ｓ（Ａ）６皿Ｄ表示。各组间均值比较采用单因素方差分析，样本间比较采用ｔ检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。结一、细胞形态学研究诱导分化前，棕色脂肪前体细胞呈梭形的纺锤样，当细胞融合后，则排列形成长梭形。细胞胞浆内无脂臣４Ｕ目Ｃ固１３圈Ａ啐ｈｄ果滴，表现为纤维母样的前脂肪细胞的形态。诱导分化２ｄ后，部分细胞变大，变圆，并出现分散的细小脂滴；∞４加药干预４ｄ后，部分细胞分化为成熟的棕色脂肪细胞，表现为细胞体积增大，呈类圆形，胞浆内含有大量小脂滴，且脂滴体积小，数目多，脂滴聚集于细胞核周（图１）。二、荧光定量ＰＣＲ检测棕色脂肪细胞基因表达１．ＧＬＰ．１增加棕色脂肪细胞特异性基因ＵＣＰｌ、ＰＧＣｌ．ＯＬ、Ｃｉｄｅａ的表达（图２Ａ）：ＧＬＰ．１（１０墙ｍｏｌｆＬ）、ＧＬＰ．１（１０。９ｍｏｌ／Ｌ）干预４ｄ，Ａ组、Ｂ组与Ｄ组相比，口ｕ．卜皑３２●ＯＵＣＰｌ、ＰＧＣｌ一ｏ【、Ｃｉｄｅａ表达量明显升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），且高浓度ＧＬＰ—ｌ组的作用更加明显。提示，ＧＬＰ一１可以增加棕色脂肪细胞特异性基因的表达，从而增强棕色脂肪组织的功能，且高浓度ＧＬＰ．１的作用更加明显。２．ＧＬＰ．１促进棕色前体脂肪细胞分化为成熟的棕色脂肪细胞（图２Ｂ）：在药物干预４ｄ后，Ａ组中棕色脂肪分化基因ＰＰＡＲ一＾ｙ、ＰＲＤＭｌ６与Ｄ组相比表达量升高，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），且ＰＲＤＭｌ６对ＧＬＰ．１刺激的反应比ＰＰＡＲ．１明显，提示ＧＬＰ．１可以通过某些途径，增加ＰＰＡＲ一＾ｙ、ＰＲＤＭｌ６的表达，进而促ｃＮ（）ＮｅＮＯＳ注：（Ａ）棕色脂肪细胞特异性基因Ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｓｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ：（Ｂ）棕色脂肪分化基因Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｇｅｎｅｓｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ；（ｃ）一氧化氮途径基因ＳｐｅｃｉｆｉｃＣｏｎｔｒｏｌ；Ｃ：Ｌ－ＮＡＭＥｇｅｎｅｓｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙ：Ｄ：对照组ｌＯ～８１０—３ｍｏｌ／Ｌ；Ｂ：ＧＬＰ．１１０—９ｍｏｌ／Ｌ：Ａ：ＧＬＰ．１进棕色脂肪前体细胞向棕色脂肪细胞分化。而Ｂ组中，ＰＰＡＲ一１的表达量与Ｄ组相比，差异无统计学意ｍｄ／Ｌ；ｖｓＤ，“Ｐ＜０．０５，ｂＰ＜Ｏ．Ｏｌ；ｗＣ，‘Ｐ＜０．０５，“Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ图２干预后各组基因水平Ｆｉｇ２Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｅｌｅｖｅｌｓａｆｔｅｒｔｈｅｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐｓ万方数据・８９８・中华内分泌代谢杂志２０１３年１０月第２９卷第１０期ＣｈｉｎＪＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１３，Ｖ０１．２９，Ｎｏ．１０义，考虑ＧＬＰ一１剂量较低，高浓度的ＧＬＰ一１效果明显。３．ＧＬＰ．１可以通过激活一氧化氮合酶（ＮＯＳ）的活性，促进下游基因表达增加（图２Ｃ）：Ａ、Ｂ组的ＮＯ途径特异性基因ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ的表达与对照组相比明显升高，差异有统计学意义。以上结果提示，ＧＬＰ一１可能通过ＮＯ途径促进下游基因表达增加，且高浓度ＧＬＰ一１的作用更明显。４．抑制一氧化氮合酶（ＮＯＳ）废除了ＧＬＰ一１诱导的棕色脂肪细胞基因表达升高和细胞棕色化的分化途径：使用ＮＯＳ抑制剂Ｌ．ＮＡＭＥ干预细胞。Ｌ－ＮＡＭＥ使得棕色脂肪细胞特异性基因、分化通路基因水平下调，进而不能促进棕色脂肪组织功能增强和脂肪棕色化。而这些改变伴随着ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳ水平的显著降低。Ｌ—ＮＡＭＥ的干预导致ＧＬＰ一１促进棕色脂肪组织功能增强和脂肪棕色变的能力丧失。证明ＧＬＰ一１在诱导棕色脂肪组织功能增强和脂肪棕色变的过程中ＮＯ起了必不可少的重要作用。讨论脂肪组织在机体的胰岛素敏感性和能量代谢平衡等方面起着至关重要的作用。白色脂肪组织主要功能为储存多余的能量，而棕色脂肪组织具有代谢活性，在抵抗肥胖上具有潜在的作用［６］．其特异性基因有ＵＣＰｌ、Ｃｉｄｅａ、ＰＧＣｌ．仅。因此，为了改善能量代谢紊乱，需要进一步了解棕色脂肪细胞分化与代谢的调节机制，寻求促进棕色脂肪细胞高表达特异性基因和诱导棕色脂肪前体细胞向成熟的棕色脂肪细胞分化的方法。棕色脂肪细胞的分化机制较为复杂。ＰＲＤＭｌ６（ＰＲＤｌ一ＢＦｌ一ＲＩＺｌｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｄｏｍａｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１６）是公认的调节棕色脂肪细胞形成的关键转录因子，是棕色和白色脂肪细胞特异性基因表达程序的分子开关，其机制是Ｃ末端结合蛋白和过氧化物酶体增殖剂活性受体叫（ＰＰＡＲ一１）辅助激活子１（ＰＰＡＲ＇ｙ—ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ一１ＯＬａｎｄｐ，ＰＧＣ．１仅／１３）竞争性结合ＰＲＤＭｌ６，分别形成ＰＲＤＭｌ６／ＣｔＢＰｓ和ＰＲＤＭｌ６／ＰＧＣ一１Ｓ转录复合物。前者可激活棕色脂肪特异基因的表达，后者可抑制白色脂肪特异基因的表达（７］。棕色脂肪组织分化途径中还有许多重要的转录因子，如ＰＧＣ一１仅和ＰＰＡＲ７。ＰＰＡＲ＇，／是体外脂肪细胞形成的关键因子，在白色脂肪组织和棕色脂肪组织的形成过程中至关重要。ＰＧＣ一１仪作为ＰＰＡＲｌ、ＰＰＡＲｃｃ和ＥＲＲｄ共协调因子，可以驱动产热过程基因的产生［８］，与ＵＣＰｌ、Ｃｉｄｅａ共同参与棕色脂肪组织产热过程。ＧＬＰ一１受体激动剂（艾塞那肽）因其对肥胖和高脂血症的靶向作用，对肥胖的２型糖尿病患者有较好的万方数据治疗效果旧］。ＧＬＰ一１已被证实在小鼠和人体内应用后均可改善胰岛Ｂ细胞，增加肝糖原的摄取，葡萄糖浓度依赖性降糖，改善血脂代谢，延迟胃排空，减轻体重［１…。ＧＬＰ一１在人及多种动物的多种组织器官中均存在受体，包括胰腺、脑、肺、心脏、肾脏等组织器官。然而，在葡萄糖利用的主要外周组织脂肪、肝脏、肌肉中，目前，只能证实其结合位点的存在而未能检测出已知的受体序列［１１Ｊ。随着对ＧＬＰ．１日益深入的认识，多种证据均提示在这些组织中可能存在与已知受体不同的特殊受体或结合位点。业已证明，ＧＬＰ．１及其受体激动剂不仅可以改善血糖等代谢指标，还对血管内皮功能障碍具有直接的有益效应，且该效应是通过ｅＮＯＳ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＮＯＳ）由ＮＯ所介导的［１２Ｉ。Ｇｕ等［１３］通过向高脂饮食诱导的肥胖小鼠注射ＧＬＰ一１类似物，发现小鼠肝脏中ＰＧＣｌ一仅．ＰＰＡＲ．叫等棕色脂肪组织特异性分泌的蛋白表达增加，且在棕色脂肪组织中葡萄糖摄取率增加，推测ＧＬＰ一１可以通过某些途径促进棕色脂肪组织的功能增强，但其具体机制尚不明确。Ｌｏｃｋｉｅ等［１４］通过向小鼠脑室注射ＧＬＰ．１，发现ＧＬＰ一１受体的活化可以介导小鼠肩胛区棕色脂肪组织的产热活动的增加，进而减轻小鼠体重，说明中枢神经系统的ＧＬＰ．１受体信号通路可直接棕色脂肪组织的产热作用。本研究发现ＧＬＰ一１可以通过某种途径促进棕色脂肪组织功能增加。本研究通过培养原代棕色脂肪前体细胞．证明了ＧＬＰ一１可以通过某些途径促进棕色脂肪特异性基因和分化途径基因水平的上调。且该作用部分是通过ｅＮＯＳ介导的ＮＯ途径。在使用ＧＬＰ一１受体激动剂艾塞那肽干预４ｄ后，Ａ组和Ｂ组细胞棕色脂肪组织特异性基因（ＵＣＰｌ、Ｃｉｄｅａ、ＰＧＣｌ一ｏ【）表达量与对照组相比，明显升高，且Ａ组高于Ｂ组，提示高浓度的ＧＬＰ．１对棕色脂肪细胞表现出更强的作用，在棕色脂肪组织细胞表面可能存在ＧＬＰ一１结合位点，ＧＬＰ．１与其结合可发挥增强棕色脂肪细胞功能的作用，增加其下游基因的表达，在高浓度组中尤为明届，这与前人研究结果一致。Ａ组和Ｂ组细胞分化基因（ＰＲＤＭｌ６、ＰＰＡＲ．吖）与Ｄ组相比，也呈上升趋势，提示ＧＬＰ．１可以通过某种途径促进上游分化基因的表达，从而促进棕色脂肪前体细胞向成熟的棕色脂肪细胞分化。同时，Ａ组和Ｂ组的ｅＮＯＳ、ｉＮＯＳｍＲＮＡ表达明显升高，考虑ＧＬＰ一１可以促进内皮细胞表达ＮＯ，细胞外的ＧＬＰ．１可以促使细胞内ＮＯＳ的产生，且呈浓度依赖性。ＮＯ可以刺激ＰＧＣｌ一仪的表达［３］，并抑制白色脂肪组织细胞的产生［１５］。ＰＧＣ一１０ｔ是肾上腺素信号途径的下游靶点．也史些囱坌鲨垡塑苤查垫！！生！Ｑ旦笪！！鲞箜！Ｑ塑￡垡！』垦！！！！堕！型塑！！生：堕！！！竺垫！！！！型：！！！堂：！旦・８９９・是决定体外培养细胞在寒冷刺激下棕色脂肪细胞定向分化的关键调节因子。ＰＧＣｌ．仪等转录因子与ＰＲＤＭｌ６结合成转录复合物，诱导棕色脂肪细胞ＵＣＰｌ等特异性基因高表达。另外，ＧＬＰ一１与受体结合后，鸟苷酸环化酶可上调，抑制磷酸二酯酶３，从而激活腺苷酸环化酶（ｃＡＭＰ）¨川，而ｃＡＭＰ的上调可激活ｃＡＭＰ依赖的蛋白激酶，进而磷酸化反应元件结合蛋白，参与相关基因的转录，所以推测ＮＯ．ｃＧＭＰ通过ｃＡＭＰ上调ＰＧＣｌ一ｏｌ，促进棕色脂肪前体细胞的分化［１６｜。而用Ｌ．ＮＡＭＥ干预后，下游特异性基因及上游分化基因的表达均明显下降，说明Ｌ—ＮＡＭＥ抑制ＮＯＳ系统，从而废除了ＧＬＰ—ｌ诱导的棕色脂肪细胞基因表达升高和细胞棕色化的分化途径。综上所述，ＧＬＰ．１及其受体激动剂可以作用于棕色脂肪组织前体细胞，通过某些途径，增加信号转导下游棕色脂肪细胞特异性基因的表达．进一步促进棕色脂肪前体细胞向棕色脂肪细胞的分化．增强棕色脂肪组织的功能，最后通过快速消耗葡萄糖和脂肪来产热，改善糖脂代谢及胰岛素抵抗，减轻体重。本研究的结果进一步补充了ＧＬＰ一１减轻体重的作用机制。相信随着研究的深入，加深对各种因子作用机制的进一步探讨，从而为开发和研制更为安全有效的２型糖尿病及肥胖症药物提供新的理论依据。参考文献［１］ｖａｎＧｅｎｕｇｔｅｎＲＥ，ｖａｎＲａａｈｅＤＨ，ＤｉａｍａｎｔＭ．Ｄｏｅｓｇｌｕｃａｇｏｎ—ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ－１ｒｅｃｅｐｔｏｒａｇｏｎｉｓｔｔｈｅｒａｐｙａｄｄｖａｌｕｅｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ？Ｆｏｃｕｓｏｎｅｘｅｎａｔｉｄｅ．ＤｉａｂｅｔｅｓＲｅｓＣｌｉｎＰｒａｃｔ，２００９，８６（Ｓｕｐｐｌ１）：￥２６一￥３４．［２］ＵｓｓｈｅｒＪＲ，ＤｒｕｅｋｅｒＤＪ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｉｎｅｒｅｔｉｎｓｙｓｔｅｍ．ＥｎｄｏｃｒＲｅｖ，２０１２，３３：１８７－２１５．［３］ＮｉｓｏｌｉＥ，ＣｌｅｍｅｎｔｉＥ，ＰａｏｌｕｃｃｉＣ，ｅｔａ１．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｍａｍｍａｌｓ：ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３，２９９：万方数据８９６－８９９．［４］ＦｍｈｂｅｃｋＧ，ＢｅｃｅｒｒｉｌＳ，ＳａｉｎｚＮ，ｅｔａｌＢＡＴ：ａｎｅｗｔａｒｇｅｔｆｏｒｈｕｍａｎｏｂｅｓｉｔｙ？ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌＳｃｉ，２００９，３０：３８７—３９６．［５］ＣａｎｎｏｎＢ，ＮｅｄｅｒｇａａｒｄＪ．Ｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆａｄｉｐｏｓｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌｓｆｒｏｍｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅａｎｄｏｆｃｌｏｎａｌｂｒｏｗｎ—ａｄｉｐｏｃｙｔｅ—ｌｉｋｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ，２００１，１５５：２１３—２２４．［６］ＣａｎｎｏｎＢ．ＮｅｄｅｒｇａａｒｄＪ．Ｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ，２００４，８４：２７７－３５９．［７］ＳｃａｌｅＰ，ＳｊｏｒｋＢ，ＹａｎｇＷ，ｅｔａ１．ＰＲＤＭｌ６ｃｏｎｔｒｏｌｓａｂｒｏｗｎｆａｔ／ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓｗｉｔｃｈ．Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５４：９６１－９６７．［８］ＰｕｉｇｓｅｒｖｅｒＰ．Ｔｉｓｓｕｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒＰＧＣｌ一ａｌｐｈａ．ＩｎｔＯｂｅｓ（Ｌｏｎｄ），２００５，２９（Ｓｕｐｐｌｌ）：Ｓ５一Ｓ９．［９］ＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎＤＪ，ＩｒｗｉｎＡ，ＧａｒｄｎｅｒＣ３，ｅｔａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｄｇｌｙｃａｅｍｉａｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｌｉｖｅｒｆａｔｒｅｄｕｃｔｉｏｎｉｎｏｂｅｓｅ，ｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｐａｔｉｅｎｔｓｇｉｖｅｎｇｌｕｃａｇｏｎ—ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ一１（ＧＬＰ一１）ｒｅｃｅｐｔｏｒａｇｏｎｉｓｔｓ．ＰＩｏＳｏｎｅ，２０１２，７：ｅ５０１１７．ＶａｉｄｙａＨＢ，ＧｏｙａｌＲＫ．Ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅｓ—ｌｍｏｄｕｌａｔｏｒｓａｓｎｅｗｅｒｔａｒｇｅｔｆｏｒｄｉａｂｅｔｅｓ．ＣｕｒｅＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓ，２００８，９：９１Ｉ－９２０．ＳｉｖｅｒｔｓｅｎＪ，ＲｏｓｅｎｍｅｉｅｒＪ，ＨｏｉｓｔＪＪ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｇｌｕｅａｇｏｎ—ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅｌｏｎｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｒｉｓｋ．ＮａｔＲｅｖＣａｒｄｉｏｌ，２０１２，９：２０９－２２２．ＦｏｒｓｔＴ，ＷｅｂｅｒＭＭ，ＰｆｎｔｚｎｅｒＡ，ｅｔａ１．ＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｂｅｎｅｆｉｔｓｏｆＧＬＰ一１一ｂａｓｅｄｈｅｒａｐｉｅｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓｔｙｐｅ２：ｅｆｆｅｃｔｓｏｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎｂｅｙｏｎｄｇｂ’ｃｅｍｉｃｃｏｎｔｒ０１．ＥｘｐＤｉａｂｅｔｅｓＲｅｓ，２０１２：６３５４７２．ＧｕＷ，ＬｌｏｙｄＤＪ，ＣｈｉｎｏｏｋｓｗｏｎｇＮ，ｅｔａ１．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆｇｌｕｃａｇｏｎａｎｄｇｌｕｃａｇｏｎ—ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓｈａｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎｅｎｅｒｇｙｓｔａｔｅａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｉｎｄｉｅｔ—ｉｎｄｕｃｅｄｏｂｅｓｅｍｉｃｅ．ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ，２０１Ｉ，３３８：７０—８１．ＬｏｃｋｉｅＳＨ，ＨｅｐｐｎｅｒＫＭ，ＣｈａｕｄｈａｒｙＮ，ｅｔａ１．Ｄｉｒｅｃｔｃｏｎｔｒｏｌｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍｇｌｕｃａｇｏｎ—ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ一１ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１２，６１：２７５３－２７６２，ＫａｊｉｍｕｒａＳ，ＳｃａｌｅＰ，ＳｐｉｅｇｅｌｍａｎＢＭ，ｅｔａ１．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｂｒｏｗｎｆａｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌｍｅｔａｂ，２０１０，１１：２５７－２６２．ＷｕＺ，ＳａｔｔｅｒｔｉｅｌｄＭＣ，ＢａｚｅｒＦＷ，ｅｔａｌＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｗｎａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｗｈｉｔｅｆａｔｒｅｄｕｃｔｉｏｎｂｙＬ—ａｒｇｉｎｉｎｅ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｌｉｎＮｕｔｒＭｅｔａｂＣａｒｅ，２０１２，１５：５２９—５３８．（收稿１３期：２０１３－０４－０９）（本文编辑：朱梅华）［１０］［１２］［１５］［１３］［１４］［１６］
