高效液相色谱法测定氟康唑血药浓度

高效液相色谱法测定氟康唑血药浓度

摘 要:目的：探讨测定血浆中氟康唑浓度的方法。方法：采用高效液相色谱(HPLC)法,以非那西丁为内标,KromailC18色谱柱(4.6mm×250mm),以0.1mol/L磷酸-磷酸二氢钾缓冲液-甲醇(50∶50,v/v,pH7.0)为流动相;流速1.0mL/min;柱温:30℃;在波长210nm处测定其含量。结果：以氟康唑峰面积和内标峰面积比(Y)对氟康唑浓度(X)回归分析,方程:Y=0.1769X－0.0449,r=0.9995(n=7),线性范围为:0.3204～20mg/L。提取回收率>86.0%(n=5),方法回收率为94.1%～103.2%,日内RSD≤3.34,日间RSD≤5.67%,且稳定性良好。结论：本方法与GC、HPLC及其它生物学方法相比,大为优化,完全能满足人体药动学及生物等效研究的要求，可以作为此方面研究的可靠分析方法。

关键词：氟康唑;高效液相色谱法；血药浓度

氟康唑(Fluconazole，FCZ)是新型三唑类抗真菌药物,能特异、有效地抑制真菌的甾醇合成，口服及静脉注射(静注)对各种动物真菌感染，如念珠菌感染、新生隐球菌感染、小孢子菌属感染及毛癣菌属感染均有效。据文献报道,本品口服吸收良好,生物利用度可达静注给药的90%以上。口服1～2h后,一般血药浓度可达峰值,血浆消除半衰期约为30h,血药浓度与剂量成正比。血浆蛋白结合率较低,一般为11%～12%,给药剂量的80%以原型药随尿液排除。患者一般对本药能很好地耐受,常见的副作用有恶心、腹痛、腹泻、胃肠胀气、皮疹等,亦可产生肝酶升高。目前,国内已有多家药厂生产。本研究运用高效液相色谱法(HPLC)对氟康唑血药浓度进行了测定,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

仪器:日本岛津公司LC-10A泵,KromailC18色谱柱(4.6mm×250mm),SiL-10A全自动进样器,SPD-10A型紫外可见分光光度检测器(190～600nm),NC-2000型色谱工作站，TCL-16G高速台式离心机,超声波发生器,YKH-Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂)。试剂:甲醇色谱纯(山东省禹王实业总公司化工厂),其它试剂均为分析纯,水为重蒸馏水,氟康唑对照品由中国药品生物制品检定所提供。内标溶液(0.25mg/mL):精密称取非那西丁适量,加水溶解并稀释成0.25mg/mL,摇匀,置冰箱中冷藏备用,临用时稀释成0.25μg/mL。标准溶液(0.25mg/mL):精密称取氟康唑适量,加水溶解并稀释为0.2mg/mL,摇匀,置冰箱中冷藏备用,临用时稀释成1.0、5.0、25.0、50.0和100.0μg/mL的应用液。 

1.2 血浆中氟康唑HPLC测定法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:KromailC18色谱柱(4.6mm×250mm),流动相:0.1mol/L磷酸-磷酸二氢钾缓冲液-甲醇(50∶50,v/v,pH7.0);流速:1.0mL/min;检测波长:210nm;柱温:30℃。检测器灵敏度0.01AUFS,20μL定量环进样。

1.2.2 血浆样品处理方法 精密吸取血浆样品1.0mL置于具塞离心管中,加100μL非那西丁内标溶液(0.25μg/mL),200μL氢氧化铵溶液(1.5mol/L),乙酸乙酯7.0mL,置于YKH-Ⅱ型液体快速混合器中混匀30s,离心5min(4000r/min),分离有机相置于55℃水浴上以氮气吹干,残余物以甲醇100μL溶解,取20μL进样分析。

1.2.3 方法的专属性 将受试者服药前空白血浆、空白血浆加内标和氟康唑标准品及受试者服药后血浆样品同法处理后进样,见谱图1。

1.3 分析方法

1.3.1 血浆标准曲线的绘制 取空白血浆1.0mL5份分置于具塞离心管中,依次加入上述FCZ标准系列溶液100.0μL,按血浆样品处理方法处理后经HPLC测定,以氟康唑峰面积和内标峰面积比(Y)对氟康唑浓度(X)回归分析,方程:Y=0.1769X－0.0449,r=0.9995(n=7),线性范围为:0.3204～20mg/L。

1.3.2 回收率试验 用空白血浆和标准液制成浓度分别为10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L的样品各5份,同法操作,进样,氟康唑峰面积为A1,另取相应氟康唑标准液进样,氟康唑的峰面积为A2。按公式：提取回收率(F)=(A1/A2)×100%计算;用空白血浆与标准液制成浓度分别为10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L的样品各5份,同法操作,以测得值除以实际浓度值计算方法回收率。测得提取回收率结果分别为(89.2±2.63)%、(91.1±5.03)%、(88.9±2.88)%,方法回收率分别为(97.2±3.13)%、(99.1±2.03)%、(100.9±2.31)%。低、中、高浓度时,提取与方法回收率均符合生物样品分析的要求。

1.3.3 精密度试验 在同一日内,用空白血浆与标准液制成浓度分别为10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L的样品各5份,同法操作,计算;同法配制浓度为10.0mg/L、2.5mg/L、0.625mg/L样品,同法测定,连测5ｄ,计算。结果见表1。低、中、高浓度时,该方法的精密度符合生物样品分析的要求。

1.3.4 稳定性试验 用空白血浆与标准液制成浓度分别为5.0mg/L-1、2.5mg/L-1、0.625mg/L-1的样品,于室温(25℃)放置8ｈ后,同法操作,计算;于-40℃冰箱中冷冻24ｈ后,取出完全融化,反复冻融3次(3ｄ)后,同法操作,计算;于-40℃

冰箱中放置7、14、21、28、35ｄ后,同法测定，计算。本试验样品稳定性符合生物样本分析过程要求。结果见表2。

2 讨论

本试验采用高效液相色谱法,用醋酸乙酯提取血浆中氟康唑,快速混合1min,一次提取,能有效提取氟康唑并减少了其它物质的干扰,提取回收率高,基线平稳,杂质峰少,分析时间缩短。试验中发现,适当增加非那西丁的用量,可以使内标色谱峰面积加大,结果更准确,更有利于分析。检测波长为260nm时,对浓度为0.3125mg/L的样品测定,灵敏度达不到分析要求。将同一样品在不同波长(260nm,210nm)处进行测定,可知,血浆样品在260nm时,样品峰很小,积分困难;而在210nm处样品峰很大,容易积分。光谱图扫描亦可知,样品在260nm处吸收很不明显,而在210nm处有明显吸收。经过多次试验,选择甲醇-磷酸盐缓冲液(50∶50,ｖ/ｖ)作为流动相,检测波长选择在210nm处,一改以往文献中采用乙腈-磷酸为流动相、检测波长在260nm附近的色谱条件。在本试验色谱条件下,能很好地分离内标、氟康唑及内源性杂质,峰形良好,且缩短了分析时间。

综上所述，本实验所用的测定氟康唑血药浓度的方法与GC、HPLC及其它生物学方法相比,大为优化,完全能满足人体药动学及生物等效研究的要求，可以作为此方面研究的可靠分析方法。

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