囊泡

囊泡运输引起科学家的关注，主要开始于20世纪60年代，乔治•帕拉德 (George Palade)等发现，细胞分泌的蛋白需要先进入内质网，再到高尔基体，然后分泌到胞外。这个细胞分泌途径的重大发现，使他获得了1974年诺贝尔生理学或医学奖。尽管如此，这个分泌途径的细节并不清楚。1975年甘特尔•布洛贝尔 (Gunter Blobel)进一步提出了分泌蛋白进入内质网的信号肽学说，并因此获得了1999年诺贝尔生理学或医学奖。 B、2013年诺贝尔生理学或医学奖被授予三位科学家，来自耶鲁大学、出生于美国的詹姆斯•罗斯曼(James E. Rothman)；加州大学伯克利分校的兰迪•谢克曼(Randy W. Schekman)；来自斯坦福大学、二十世纪80年代移居美国的德国人托马斯•祖德霍夫(Thomas C. Sudhof)。

三人简介： 詹姆斯·罗斯曼，1976年获得哈佛医学院博士学位。由于他与兰迪·谢克曼在囊泡运输研究领域的出色工作，曾分享2002年拉斯克奖基础医学奖。 兰迪·谢克曼，1974年获得斯坦福大学博士学位，导师阿瑟·考恩伯格(Arthur Kornberg)为1959年诺奖得主。曾任《美国国家科学院院刊》(PNAS)主编，现担任《eLife》主

编。1992年当选美国国家科学院院士。 托马斯·聚德霍夫，1982年获得哥廷根大学医学博士学位。曾在迈克尔·布朗(Michael Brown)和约瑟夫·戈登斯坦(Joseph Goldstein，这两人曾因发现“低密度脂蛋白受体内吞机制”获得1985年诺贝尔生理学或医学奖)指导下从事博士后研究。由于在突触前传递的分子机制的研究成果，他和理查德·舍勒分享了2013年拉斯克基础医学奖。

马斯.祖德霍夫则发现了囊泡如何在指令下精确地释放出内部物质。 C

、

Nature Cell Biology：囊泡运输分子机制研究获重大进展 SNX6是dynein/dynactin的货物介导分子，它通过与dynein/dynactin亚基p150Glued和retromer亚基SNX1分别直接作用，将动力蛋白复合体与retromer介导的囊泡货物连接，介导从胞内体(endosome)到反式高尔基体（trans-Golgi network）的逆向运输。中国科学院遗传与发育生物学研究所分子发育生物学国家重点实验室刘佳佳研究组通过与中国科技大学田长麟以及中国科学院生物物理研究所龚为民课题组的合作，揭示了SNX6介导的货物卸载机制，从而解答了细胞生物学领域——细胞生命活动依赖于胞内运输系统，这一长期悬而未决的科学问题。 参考文献： [1]郭晓强.细胞囊泡运输的发现者——鲁斯曼[J]，生物学通报.2010. [2]岳东方.2013年诺贝尔生理学或医学奖[J]. 生命科学. 2013(12) [3]刘洋为. 囊泡运输分子机制

研究获重大进展[J]. 自然—细胞生物学,2005.

突触前膜Ca2+通道作为结构元件参与突触囊泡的停靠与融合 󰆰近提供的证据表明,在神经递质释放中具关键作用的突触前膜Ca2+通道,除为Ca2+进入胞内提供路径外,还通过位于其胞内环(L∀~L#)中的一段称为synprint位点的肽段与突触蛋白syntaxin和SNAP25等相互作用,参与突触囊泡停靠/融合。本文综述了相关资料。

由动作电位传导至神经末梢引起胞内Ca2+浓度([Ca2+ ]i)升高是触发神经递质释放所必需的。瞬时突触前末梢邻近释放位点约0.3m2 的微环境 内[Ca2+ ]i可升高三个数量级达200~300mol/L[1,2],从而导致突触囊泡发生一系列变化,最终以胞吐形式将其内容物∃∃∃神经递质释放到突触间隙;之后,随着Ca2+ 通道关闭,Ca2+ 迅速扩散,胞吐过程终止。广泛分布于突触前神经末梢的N型和P/Q型钙通道是介导[Ca2+]i升高、Ca2+内流的主要路径,在神经兴奋󰈆泌耦联过程中扮演着一个重要的角色。这些已经为我们所熟知。近年发现除了作为Ca2+进入胞内的通路外,突触前末梢的N和P/Q型Ca2+通道还与突触囊泡胞吐过程中有确定功能 的突触蛋白syntaxin,SNAP25和synaptotagmin相互作用,参与囊泡的停靠/融合。 1󰏂与囊泡󰄨膜融合的突触蛋白 在分子水平上阐述依Ca2+神经递质释放机制的

SNARE学说认为,突触囊泡与其目标膜(质膜)的融合是胞浆中可溶性蛋白原与其在囊泡膜的(syntaxin和SNAP25)和在目标膜的受体(synaptotagmin)结合、相互作用和解离的过程。此学说的提出基于一系列与囊泡融合相关蛋白的发现,以及借助梭状芽孢杆菌毒素进行的研究对这些蛋白在囊泡融合过程中的作用的阐明。syntaxin,SNAP25和VAMP等突触蛋白分别为具蛋白酶活性的不同型或亚型的梭状芽孢杆菌毒素的作用底物,被裂解后,囊泡的停靠、引发和融合被抑制,从而阻遏神经递质释放 [3,4] 。 2N型和P/Q型Ca2+ 通道蛋白存在突触蛋 白的结合位点 现在普遍接受,在哺乳动物神经递质释放中起重要作用的是 芋螺毒素( Conotoxin)GVIA敏感的N型钙通道和 蜘蛛毒( Agatoxin)IVA敏感的P/Q型钙通道。编码N型钙通道亚单位的1B和编码P/Q型钙通道1A的cDNA均已经得到克隆。从 兔中克隆得到的BI[5]和从大鼠中克隆得到的rbA[6]是1A的两种同型异构体。现在我们已经知道,钙通道1亚基都具有类似的结构:四个疏水的同源跨膜 区(%~&),位于胞内的连接这四个跨膜区的亲水性肽段(Loop)和N󰀁C󰋯肽段,这些亲水肽段变异性大,同源性低。近年的研究发现,参与突触囊泡锚定和融合的质膜蛋白syntaxin和SNAP25与钙通道有特异的结合,结合位点就在钙通道连接跨膜区∀和#的胞质环(L∀~L#),这段参与相互作用的氨基酸序列现已被命名为Synprint位点[7]

。 󰎀利用免疫组织化学方法进行的研究显示,syntaxin与N型或

P/Q型钙通道有共分布特点,它们都是在轴突膜有高密度,树突较少,而在胞体膜缺乏的一种分布[8,9] 。在分离纯化N型和P/Q型钙通道蛋白过程时,常发现syntaxin及在胞吐过程中作为Ca2+感受器的囊泡蛋白synaptotagmin等突触蛋白是与N型或P/Q型钙通道结合在一起的[10,11]。利用免疫化学的研究则直接检测到了这些突触蛋白与N型或P/Q型钙通道形成的复合物[12,13] 。 将表达得到的N或P/Q型钙通道的连接疏水区∀和#的胞内环(L∀~L#)标记,与突触蛋白syntaxin,SNAP25或synaptotagmin分别进行的结合实验进一步表明,这些突触蛋白在钙通道的结合位点就在L∀~L#肽段。实验发现,syntaxin、SNAP25或 syntaptotagmin

都可以与表达的N型钙通道同源区段 ∀~#之间的胞质环(L∀~L#)(718~963残基)以及P/Q型钙通道同型体BI的相应胞质环(722~1036残基)特异结合,而与囊泡膜蛋白synaptobrevin无此作用。还发现这种相互作用发生在syntaxin分子C󰌫端的1/3处(181~288残基),推测syntaxin通过这段氨基酸锚定于突触前膜上[7,14] 。 N型钙通道的这段L∀~L#已经被人工合成,研究发现它可特异地阻断N型和P/Q型钙通道与syntaxin的免疫共沉淀,以及竞争性地抑制P/Q通道的相应的L∀~L#肽段与syntaxin或SNAP25的结合,说明这两种通道与syntaxin和SNAP25的结合部位是共同的或有重叠[7,15] 。P/Q型钙通道的两种同型体BI和rbA中,无论同源性或与syntaxin或SNAP25的亲和性,BI都与N型通道1B的相近,而rbA较低。由

比较1A的这两个同型体BI和rbA的L∀~L#氨基酸序列差异并不很大,推测它们可能是由不同的蛋白拼接形成的[16]。 与syntaxin和SNAP25类似,synaptotagmin也与N型和P/Q型的L∀~L#肽段形成复合物,并且它们的这种结合也被Synprint竞争性抑制[17,18]。推测syn

aptotagmin与Synprint位点的结合阻止了它与syntaxin的结合,从而导致胞吐抑制[17]。在递质释放过程中,由于Ca2+通道与这些突触蛋白的结合具不同的[Ca2+]i依赖性,可能与syntaxin的结合在先,而与synaptotagmin的结合在后,从而通过[Ca2+]i改变使释放过程得以有序进行。 钙通道与突触蛋白的相互作用具有不同的Ca2+依赖性,因而一些影响[Ca2+]i的因子也通过改变[Ca2+]i影响这种相互作用进而调控神经递质释放。体外生化实验表明,Synprint肽段被PKC或CaMK∀磷酸化后,与syntaxin或SNAP25或它们复合物的结合显著降低,而PKA和PKG无此作用[19]。 3󰀆Synprint肽段导入突触前抑制递质释 放 基于突触蛋白syntaxin和SNAP25等在突触囊泡停靠和融合过程中的关键作用,以及如上所述,在突触前膜N型和P/Q型钙通道的同源区∀~#的胞内环有特异的Synprint位点,可以预期,将人工合成的Synprint肽段引入突触前,将干扰突触传递。利用培养的鸡颈上神经节神经元进行的研究为此提供了证明[20]。这类神经元被选用于此项研究是由于它有足够大(30~40m)的胞体,因而可将Synprint直接导入胞内,并通过较短的轴突迅速扩散至与邻近细胞形成突触联系的神经末梢;刺激该神经元诱发释放的神经递质(ACh)

释放可以用记录兴奋性突触后电位(EPSPs)检测;并证明该突触前末梢只有控制ACh释放的N型钙通道。 研究发现,将65mol/LN型钙通道1B亚单位的synprint肽段(718~963)注射于突触前神经元,10~15min后,由突触后神经元记录的EPSPs振幅降低24%,作用是剂量依赖和可逆的,增加synprint注射量一倍将使EPSPs加倍下降,30~40min可达降低42%的最大抑制效应,之后在部分实验可观察到抑制逐渐解除,这可能是syprint被降解造成的。研究还表明,来源于L型钙通道1S亚单位的相应的L∀~L#肽段(670~800),以同样方式注射(140mol/L)也不影响EPSPs,显示了N型钙通道的 synprint

肽段的上述作用是特异的。利用膜片钳全 细胞记录进行的研究还观察到,N型钙通道的synprint肽段不影响该神经元的钙通道活动(单位电流幅度、%∋关系、稳态失活等),说明上述synprint肽段引起EPSPs的降低不是钙电流降低造成的。对这些结果的解释是,syprint肽段竞争性地阻止了参与囊泡锚定、融合的突触蛋白与钙通道的结合,提示钙通道与这些突触蛋白的相互作用在神经胞吐中具重要作用[20]。 用爪蟾胚胎神经和肌肉细胞共同培养形成的神经肌肉接头标本上进行的实验也获得了与上述在鸡颈上神经节神经元的一致的结果[21] 。实验先将人工合成的N型钙通道的synprint肽段在胚胎干细胞分化时期注射于早期囊胚,使该肽段进入所有子代细胞,再将其神经、肌肉细胞共同培养形成神经󰂌肉突触。研究发现,在这种标本,代表乙酰胆碱同步量子释放的终板电位较正常的降低约50%,提高

溶液中的[Ca2+],才能使释放达到对照水平。用人工合成的与L型钙通道相应的L∀~L#肽段代替N型钙通道的synprint肽段进行同样实验,则未观察到终板电位的变化。这又一次显示了N型钙通道和突触囊泡停靠/融合装置的相互作用在神经胞吐中的重要作用,推测synprint肽段可能竞争性的阻断这种相互作用,增加了囊泡与钙通道的距离,从而需要提高[Ca2+]方能达到正常的释放水平。 4󰋓语 新近将分子生物学和电生理技术相结合,发现 参与胞吐的突触蛋白与N型或P/Q型钙通道的L∀~L#肽段有直接相互作用,干扰这种相互作用将抑制神经递质释放。可以预期,随着研究的继续深入,必将丰富我们对神经递质释放分子机制的认识。

三种囊泡融合的共同点： • 包被蛋白在囊泡发生融合请必须解聚 • 转运囊泡囊膜上的决定转运方向的信号蛋白v-SNAREs需与靶细胞器上的 t-SNAREs互补，确保转运囊泡在此与靶细胞器准确融合 囊泡锚定需要一套特定的信号分子 需要囊泡与质

膜紧密相连 囊泡融合需要囊泡与质膜更紧密的接触 需要融合蛋白的参与 融合蛋白与SNAREs组成融合复合体，节约能量 如：SNAP25

1984、1993 Jim Rothman ’s lab鉴定了哺乳动物intra-Golgi转运和SNARE复合体

兰迪•谢克曼，他所领导的课题组以酵母为研究材料，通过遗传学筛查以及生物化学方法，发现了参与蛋白质分泌运输过程中经内质网到高尔基体运输过程中的50多个关键调控基因及其作用环节。而詹姆斯•罗斯曼，他的实验室主要以哺乳动物细胞为研究材料，着重阐明了一个特殊的蛋白质复合物SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白附着蛋白受体)在囊泡锚定和融合中的作用机制。囊泡运输是所有细胞都具有的物质运输方式，神经细胞在囊泡运输研究中最具代表性，主要是因为神经细胞内存在着一种特殊类型的囊泡(突触囊泡)，它参与了神经递质的释放。至于托马斯•祖德霍夫，他的实验室发现了触发突触囊泡融合的钙感受器(synaptotagmin)，并证实它能快速准确地将钙信号传递到突触囊泡，通过与SNARE复合体等的作用，实现与细胞膜融合并释放神经递质，最终完成神经信息的传递。以这三个实验室具有代表性的工作为基础，囊泡运输出芽、锚定和融合等基本过程及其调节机制，得到了初步的揭示。

尽管作为“获奖大户”，“囊泡运输”这个研究领域已经收获了4次诺贝尔生理或医学奖(1974年、1985年、1999年和2013年，每隔10

来年就获奖一次)，但我们必须承认，目前人们对细胞内复杂而精细的交通运输系统的认识，仍然是初步的和框架性的，关于囊泡运输的更精细的调控机制，尚有待于进一步阐明。生物学家所面临的一个基本命题，仍然是细胞内高负荷的物质运输，如何保证其有条不紊、忙而不乱?其中，对于所运送货物的精确识别、定向运输以及目的地卸载，是囊泡运输的关键环节。现有的研究表明，细胞内可能存在精确调控货物分选与运送的一套指令，由货物分子、运输复合体、动力蛋白、运输轨道及相关调节因子共同组成，称之为“运输密码”。解码这套指令，对于理解细胞功能和生命活力至关重要。这有赖于多学科交叉(如物理、化学、生物等)和新技术发展(如新一代显微成像技术)，以实现对细胞内的囊泡运输过程的实时和长时程监控。 这项发现的意义在哪里?

对细胞内囊泡运输机制的阐明，是理解细胞功能的基础。这项发现将促使人们更加以动态的观点去认识细胞及其功能。“生命在于运动”，没有囊泡运输，就没有细胞的活力，也就没有生命力。一个城市如果缺乏交通运输系统，就是一座死城;一个细胞如果缺乏囊泡运输系统，也只不过是一个“死”细胞了，这就是我们通常在图片上看到的静态细胞。科学家在已经解码DNA密码的基础上，发展出蛋白质组学、表观遗传组学等技术手段，对于基因组所编码的全套蛋白质的功能及其相互作用和调控规律有了更进一步的认识，从而构筑了蛋白质的工作网络。在此基础上，需要在细胞的动态变化这一更高的层面上来解析它们的工作方式，重点是解读囊泡运输的密码，这样才能更

好地理解生命力的本质。此外，对于细胞内如此精密的交通运输控制机制的认识，是否对于我们现实生活中的城市交通运输管理也会产生有益的启示呢?

囊泡运输参与细胞多项重要的生命活动，如神经递质的释放及信息传递、激素分泌、天然免疫等，其运输障碍会导致多种细胞器发生缺陷和细胞功能紊乱，并与许多重大疾病(如神经退行性疾病、精神分裂症、糖尿病等代谢性疾病、感染与免疫缺陷、肿瘤等的发生发展)密切相关。研究细胞的囊泡运输，不仅会对细胞生物学的基础理论研究产生积极的推进作用，也将揭示一些影响人类健康的重大疾病机理，为其治疗提供新的策略或靶点，对人类健康产生重要和积极的影响。