药学研究・ｌｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５ Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．２ 药品检验用培养基配制及灭菌后贮存有效期的研究 刘 茜，姜俊慧，张慧慧，王敏兰 （山东绿叶制药有限公司，山东烟台２６４００３） 摘要：目的本验证通过对药品微生物限度检查用和无菌检查用培养基（选取具有代表性的７种）的配制方法 以及灭菌后贮存条件和贮存效期进行验证，确保每次配制的培养基质量均满足《中国药典｝２０１０年版要求。方法 随机抽取７种脱水培养基各２瓶，按照《中国药典｝２０１０年版培养基适用性检查中规定的方法，分别进行３次独 立试验。确定培养基的配制方法、灭菌后贮存有效期。结果与结论 培养基按规定的配制方法、灭菌后贮存有效 期内适用性检查均符合《中国药典｝２０１０午版要求。 关键词：配制方法；灭菌后贮存有效期；适用性检查 中图分类号：Ｒ９２７．１ 文献标识码：Ａ文章编号：２０９５—５３７５（２０１５）０２—００８０—００４ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｅｒｉｏｄ ｉｎ ｄｒｕｇ ｔｅｓｔ ＬＩＵ Ｑｉａｎ，ＪＩＡＮＧ Ｊｕｎ—ｈｕｉ，ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ—ｈｕｉ，ＷＡＮＧ Ｍｉｎ—ｌａｎ （Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｌｕｙｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｙａｎｔａｉ ２６４００３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｎｓｕｒｅ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｅｖｅｒｙ ｂａｔｃｈ ｏｆ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｍｅｄｉａ ｗｈｉｃｈ ｍｅｅｔ ＣＨ．Ｐ．２０１０ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｔｏ ｖａｌｉ— ｄａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｅｒｉｏｄ ａｆｔｅｒ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｒａｎｄｏｍｌｙ ｃｈｏｓｅ ｅａｃｈ ｔｗｏ ｂｏｔｔｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ７ ｋｉｎｄｓ ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ，ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎｓ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ＣＨ．Ｐ．２０１ ０ ｅｄｉ— ｔｉｏｎ．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｒｅｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｅｓｔｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｅｒｉｏｄ ａｆｔｅｒ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ａｌｌ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓａｔｉｓｆｉｅｄ ＣＨ．Ｐ．ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｅｄｉａ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｓｔｏｒａｇｅ ｐｅｒｉｏｄ ａｆｔｅｒ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ 微生物培养基是专供微生物生长繁殖使用的混 合营养制品，几乎是所有微生物实验室必须用到的， 作为科学研究和应用科学的重要支撑条件，发挥着 程 ’ ，使培养基制备的整个过程受控。通过验证 试验，一方面，可以使培养基的整个配制、灭菌和贮 存过程受控，确保每次配制的培养基满足微生物限 度检查或无菌检查的要求；另一方面由原来配制一 批培养基进行一次适用性检查，变为每一个批号的 脱水培养基只需进行一次适用性检查，节约了工时， 其他手段不可替代的作用。培养基是否合格，对微 生物的生长、分离、鉴定以及检验结果的正确与否起 着至关重要的作用，因此对培养基的质量控制十分 必要，适宜的培养基制备方法，合理存放，以及质量 监控实验，是提供优质培养基的保证 。 提高了工作效率。 １仪器设备、试药与菌种 《中国药典》２０１０年版中不但规定了培养基需 进行适用性检查 』，而且在《中国药典》２０１０年版 （二部）附录ⅪＸＱ（药品微生物实验室规范指导原 则）中规定：“除药典附录另有规定外，在实验室中， １．１ 仪器设备 ＡＣ２—４Ｓ１型生物安全柜（ＥＳ— ＣＯ）；电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公 司）９・ＫＢ２４０型低温培养箱（Ｂｉｎｄｅｒ）；ＬＭＱ．Ｃ型压力 蒸汽灭菌器（山东新华医疗器械有限公司）；Ｉ型红 若采用已验证的制备和灭菌程序制备培养基且过程 受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查实验可 只进行一次，如果培养基的制备过程未经验证，那么 外灭菌器（广州市尤德生物科技有限公司）；ＴＥ２１２ 一Ｌ电子天平（赛多利斯）。 培养基（青岛高科园海博生物技术有 １．２试药每一批培养基均要进行适用性检查试验”。 本研究就是为了规范培养基的配制和灭菌过 作者简介：刘茜，女，研究方向：药品检验，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｑｉａｎ＠ｌｕｙｅ．ｃｎ 限公司）；ｐＨ ７．０氯化钠一蛋白胨缓冲溶液（青岛高 科园海博生物技术有限公司）；对照培养基（中国食 药学研究・Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅ４ｒｃｈ ２０１５ Ｖｏ１．３４．Ｎｏ．２ 品药品检验研究院）。 １．３菌种ＡＴＣＣ菌种（广东省微生物研究所微生 ２．２培养基的配制方法和灭菌参数 ２．２．１ 培养基的选择分别随机抽取７种脱水培 物菌种保藏中心）；ＣＭＣＣ菌种（山东省食品药品检 验研究院）。备注：胰蛋白胨大豆琼脂培养基 （ＴＳＡ）、Ｒ２Ａ培养基（公司产品需过欧盟认证）、胰 蛋白胨大豆肉汤培养基（ＴＳＢ）使用ＡＴＣＣ菌种；营 养基各２瓶，按照《中国药典￣２０１０年版培养基适用 性检查中规定的方法，分别进行３次独立试验。 ２．２．２固体、液体培养基：根据培养基包装上的配 制说明进行配制。装入立式压力蒸汽灭菌器中，以 养琼脂培养基、玫瑰红钠培养基、硫乙醇酸盐流体培 养基、胆盐乳糖培养基使用ＣＭＣＣ菌种。 ２方法与结果 液体程序（１２１℃，２０ ｒａｉｎ）进行灭菌，根据需要，灭 菌后测定ｐＨ值。 ２．３灭菌后培养基的贮存 ２．１菌液制备 ２．３．１ 贮存条件灭菌后的培养基旋紧密封旋盖， ２．１．１ 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆 菌、铜绿假单胞菌接种至营养琼脂培养基（胰蛋白 大豆琼脂培养基），３０～３５℃培养１８～２４ ｈ。培养 物用ｐＨ ７．０氯化钠一蛋白胨缓冲液制成每１ ｍＬ含 菌数５０～１００ ｃｆｕ的菌悬液。 ２．１．２ 白色念珠菌接种至改良马丁琼脂培养基 按照《中国药典｝２ｏｌｏ年版要求置于２～２５ 中贮 存，贮存效期根据实际情况制定为胰蛋白胨大豆琼脂 培养基（ＴＳＡ）、Ｒ２Ａ培养基９ ｄ；营养琼脂培养基、玫 瑰红钠培养基６ ｄ；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（ＴＳＢ）、 硫乙醇酸盐流体培养基、胆盐乳糖培养基２０ ｄ。 ２．３．２贮存后的使用方法：灭菌后凝固的固体培养 基，使用前，置于４５℃左右的恒温水浴锅中，待培养 基完全融化且温度达到４５℃左右后使用；灭菌后的 （沙氏葡萄糖琼脂培养基），２０～２５℃培养２～３ ｄ。 培养物用ｐＨ ７．０氯化钠一蛋白胨缓冲液制成每１ ｍＬ含菌数５０～１００ ｃｆｕ的菌悬液。 液体培养基可直接使用。 ２．４贮存时间、适用性检查项目 分别选取灭菌后 第１天（即刚灭菌未凝固的培养基）以及存放有效 期的最后１天，按照《中国药典￣２０１０年版规定对培 养基进行适用性检查。 ２．５实验结果 ２．１．３黑曲霉接种至改良马丁琼脂培养基（沙氏 葡萄糖琼脂培养基）斜面培养基上，２０～２５℃培养 ５—７ ｄ，加入３～５ ｍＬ含０．０５％（ｍＬ／ｍＬ）聚山梨酯 ８０的无菌ｐＨ ７．０氯化钠一蛋白胨缓冲溶液，将孢 子洗脱，然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌 纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内， 用含０．０５％（ｍＬ／ｍＬ）聚山梨酯８０的无菌ｐＨ ７．０ 氯化钠一蛋白胨缓冲溶液制成每ｌ ｍＬ含孢子数５０ ～２．５．１胰蛋白胨大豆琼脂培养基（ＴＳＡ）验证结果 ｐＨ值检查结果见表１，适用性检查结果见表２。 表１ ＴＳＡ ｐＨ值检查结果 １００ ｃｆｕ的孢子悬液。 ２．１．４生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养基，３０ ～３５℃培养２４～４８ ｈ。培养物用ｐＨ ７．０氯化钠一 蛋白胨缓冲液制成每１ ｍＬ含菌数５０～１００ ｃｆｕ的菌 悬液。 表２ ＴＳＡ适用性检查结果 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌 白色念珠菌 黑曲霉 第一次第二次第三次第一次第二次第三次第一次第二次第三次第一次第二次第三次第一次第二次 第三次 ２．５．２营养琼脂培养基验证结果 ｐＨ值检查结果 见表３，适用性检查结果见表４。 ２．５．３玫瑰红钠培养基验证结果 ｐＨ值检查结果 见表５，适用性检查结果见表６。 表３营养琼脂培养基ｐＨ值检查结果 ２．５．４ Ｒ２Ａ培养基验证结果 ｐＨ值检查结果见 表７，适用性检查结果见表８。 ・８２・ 药学研究・『０ｕｍａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５ Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．２ 表４ 营养琼脂培养基适用性检查结果 表５玫瑰红钠培养基ｐＨ值检查结果 表８ Ｒ２Ａ培养基适用性检查结果 表６玫瑰红钠培养基适用性检查结果 ２．５．５胰蛋白胨大豆肉汤培养基（ＴＳＢ）验证结果 ｐＨ值检查结果见表９，适用性检查结果见表ｌ０。 ２．５．６硫乙醇酸盐流体培养基验证结果查结果见表１１，适用性检查结果见表１２。 ２．５．７胆盐乳糖培养基验证结果见表１３，适用性检查结果见表１４。 表９ ＴＳＢ ｐＨ值检查结果 灭菌前ｐＨ 灭菌后ｐＨ ｐＨ值检 ｐＨ值检查结果 表１０ ＴＳＢ适用性检查结果 表１ １ 硫乙醇酸盐流体培养基ｐＨ值检查结果 ３讨论 随机抽取７种脱水培养基各２瓶，按照《中国药 典｝２０１０年版培养基适用性检查中规定的方法，分 别进行３次独立试验。根据实际情况确定不同的贮 存有效期，实验结果表明在确定的贮存有效期内培 养基适用性检查均符合规定。 表１ ２ 硫乙醇酸盐流体培养基适用性、无菌检查结果 天 ：≮：、＝：：：：≮：：：：：：：：：：：：：≮：≮：≮：≮： ： 药学研究・￣ｕｍａｌ ｏｆ 口 口 “ ｆ Ｒ￣ｅａｒｃｈ ２０１５ Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．２ 表１３胆盐乳糖培养基ｐＨ值检查结果 ・８３・ 根据以上结果，我们可以确定根据培养基包装 上的配制说明进行配制，以液体程序（１２１℃，２０ ａｒｉｎ）进行灭菌，然后按照《中国药典｝２０１０年版要求 置于２～２５ ｃ《＝中贮存，在贮存有效期内培养基的适 用性检查均符合规定。 表１ ４胆盐乳糖培养基适用性检查结果 本次验证就是为了规范培养基的配制和灭菌过 程，使培养基的整个过程受控。通过该验证试验，一 １Ｊ 保证措施［Ｊ］．检验检疫科学，２００６，１６（４）：３ｌ一３３． 姜海燕．浅谈微生物检测中培养基的质量控制［Ｊ］．中 １●Ｊ］Ｊ］Ｊ］Ｊ 方面，可以使培养基的整个配制、灭菌和贮存过程受 控，确保每次配制的培养基满足微生物限度检查和 国现代药物应用，２０１１，５（１）：２４７—２４８． 国家药典委员会．中华人民共和国药典２０１０年版（二 部）［Ｓ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０：附录１０３ 无菌检查的要求；另一方面由原来配制一批培养基 进行一次适用性检查，变为每一个批号的脱水培养 基只需进行一次适用性检查，节约了工时，提高了工 作效率。 参考文献： ［１］ 唐细良，史娟，唐紫琳，等．影响卫生微生物检验质量 的两个因素研究［Ｊ］．实用预防医学，２０００，７（４）：３１４ —１０７． 苏德模，胡长勤，马越．美英药典微生物限度标准的浅 析［Ｊ］．中国药品标准，２００５，６（３）：２０—２９． 顾涛，肖苓秋，刘贵明，等．疾控机构实验室压力蒸汽 灭菌效果生物监测分析［Ｊ］．中国卫生检验杂志， ２００９，１９（１１）：２６４９—２６５０． 王鹏远，刘保华，段莲花．压力蒸汽灭菌器灭菌效果监 ３１５． 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