Ti^4+固载的纳米复合硅球的制备及其在磷酸化蛋白分离富集中的应用

在磷酸化蛋白分离富集中的应用

谢 青1胡巧云1郑 琼2林子俺八(1，福建生物工程职业技术学院药学系，福建福州350002； 2.福州大学化学学院食品安全与生物

分析教育部重点实验室，福建福州350116)摘 要：采用Shber法，以四乙氧基硅烷(TEOS)和yC丙基三甲氧基硅烷(yMPTS)为前驱体合成了硅球纳

米粒子，并结合“疏-烯”点击反应和“一锅法”，制备得到固载tC的纳米复合硅球。通过红外光谱、透

射电镜等方法对材料进行表征，利用蛋白吸附实验以及凝胶电泳等方法探究了该亲和材料对磷酸化蛋白的分 离富集效果。结果表明，该纳米复合材料分散性好，粒径均一，对磷酸化蛋白(a-酪蛋白)的最大吸附容量

(12.27 pmoeg)远大于非磷酸化蛋白(辣根过氧化物酶，9 12 pmoeg)，且能从牛奶实际样品中分离富集磷

酸化蛋白。关键词：“疏-烯”点击反应；一锅法；磷酸化蛋白；纳米二氧化硅;分离富集

中图分类号：O657.33； O629. 4

文献标识码：A 文章编号：1004 -4957(2219) 1 - 1228 -06Preparation of Ti4** ImmoOilizeP Silica Nanocomposites and Theis App/cation in

Separation ang Enrichment of PhosphoproteinsXIP Qing1，HU Qiao-yyn-，ZHENG Qiong2，^乙匚酪!2*(1.

Department of Pharmaca，Fujian Vocational Collepe oO Bioenaineerina， Fuzhoo 357022，China； 2. Ministry oOEducation Kep Laboratory for Analytical Science of FooO Safety and Biolooy， Collepe of Chemistry， Fuzhoo University，

Fuzhoo 350116，China)Abstract: Tha Ti4* immonilizeP silica Ildnoymposim)( SiCO - Ti4* ) were fenricate/ Uy systhesizing

silica nanonarticlas with tetraethoxysilaga ( TEOS ) ang y-mercantonronyl tymethoxysilana ( y-MPTS )

bs pricuriOri，followeP Uy u thioO - 6/3^ cCcC reaction ang \"onipot” prigyss. Tha morpholouy angstructuri hropertias of tha resultaat SiCO - TC * were cearacterize/ Uy transmission electropie microsca( py(TEM)， Fonriar transform infrareP spptriscopy ( FT -IR) ang Xcay ppotoelectron spitriscopy

(XPS) . Tha ansorption Ue/avior of tha SiCO - Ti4* towards phosphoprityns was Ungartha optimize/ connitions， tha SiCO - Ti4* sPoweP a rather hig/ar dnsorption cabbcito towards pPos(ppoproteins ( a-casein， 12.22 pmol/g) than non-cPospPoproteins ( horseranishperoxinasa， 1. H pmol/g). In andition， tha hrbcticalito of tha SiCO - Ti4* was further demonstrate/ Uy thelr selective e/richme/t of phosphoprityns Oom mile samples.Keywords； \"thiol-ex” clicO reaction ； \"on/pot” process ； phospPoproteins ； nano-size/ SiOz ；separation and e/richme/t蛋白质磷酸化是生物体内最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一。研究表明，蛋白质磷酸化的异常 表达与癌症、白血病等疾病密切相关4] o因此，研究蛋白质磷酸化对于一些重大疾病的早期诊断极为

重要。由于磷酸化蛋白在生物样品中丰度较低且易受到高丰度非磷酸化蛋白的干扰，以现有的技术手 段难以对磷酸化蛋白进行直接检测，因此亟待发展一种高效的磷酸化蛋白富集方法。目前，磷酸化蛋

白的富集方法主要有固定离子亲和色谱、金属氧化物亲和色谱、亲水色谱、亲和免疫法等[2-6] o固定

金属离子亲和色谱(IMAC)4-]因其强特异性而备受科研工作者的青睐。相比于传统的稼、铝、铁等

收稿日期：2019 -05 -27；修回日期：2019 -07 -01基金项目：福建省中青年教师教育科研项目(JAT171008)；福建海洋生物制品创新服务平台(闽海洋高新[2016]21号)*通讯作者：林子俺，博士，研究员，研究方向：现代分离分析，E - maii: zianlin@ fzu. 3pu. 3y第3期谢青等：TO固载的纳米复合硅球的制备及其在磷酸化蛋白分离富集中的应用1229三价离子，钛离子(TO)、错离子(zP+)具有更多的磷酸化蛋白结合位点，已被广泛应用于磷酸化蛋

白的分离富集0点击化学(Click chemistry)由SSarpless于2001年首次提出°2],具有效率高、副反应少、分离提纯

简单、环境污染小等优点，已被广泛应用于表面修饰、生物大分子、DNAs、生物与化学传感器等领 域°5「3]0“疏-烯”反应作为点击化学中的一种，具有无需金属催化、简便高效、便捷可控、后处理

方便且对水、氧不敏感等优点，逐渐成为化合物改性和聚合物固化反应的有效途径°4\"8。\"一锅法” (“one-Cot”)°5是一种简便的有机合成方法，可同时进行多步反应而无需将产物分离，在经济上和

环境上较为友好，应用广泛。将“一锅法”引入磷酸化蛋白分离富集材料制备，可极大地简化合成过

程。基于“疏-烯”点击反应的磷酸化蛋白分离富集材料的“一锅法”制备，目前尚未见报道。基于此，本文结合简便高效的“疏-烯”点击反应与“一锅法”，制备了一种固载T14的纳米二

氧化硅复合材料(S102-T1X),在金属离子亲和色谱的基础上，将其应用于磷酸化蛋白的选择性分离

富集。该亲和材料在最优条件下对a酪蛋白具有良好的富集效果,并成功应用于牛奶实际样品中磷酸

化蛋白的分离富集，表现出良好的应用前景。1实验部分1. 1仪器与试剂UV -2457紫外可见分光光度计(日本SSimakzu公司),Tecnai G22透射电子显微镜(荷兰FEI公

司)，ESCALAB257 X射剁;电子能谱仪(美国Thermo FRher ScientOO公司)，Nicolet 0777傅立叶红外

光谱仪(美国Nicolet公司),SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE)仪(美国BO - Rad公司)。四乙氧基硅烷(TEOS)、y酪丙基三甲氧基硅烷(y-MPTS)、硫酸钛、辣根过氧化物酶(HRP, M”

44UDa ； pI7.2)、乙烯基麟酸(VPA)、a 酪蛋白(aCasein, M„ 22-27 kDa ； pl 4. 2 ~ 4. 7)、0一酪蛋白 (0-Casein, M” 24 kDa ； pI4.6~5.1)、鸡蛋卵清白蛋白(OVA , M” 44. 3 kDa ； pl 4.6)、牛血清白蛋白

(BSA , Mw 66 kDa ； pl 4. 9)、转铁白蛋白(TP, M” 88 kDa ； pI 7.9)均购自Sigma公司。其余试剂均为

分析纯,实验用水为二次蒸僧纯制水。1.2 SiO2-Ti4 +纳米复合材料的制备采用Sober法制备二氧化硅纳米粒子：首先将D mL无水乙醇、3 28 mL浓氨水和3 2 mL二次水 加入到三颈烧瓶内混合均匀，磁力搅拌条件下加入2. 2 mL TEOS和0.1 mL y-MPTS , 32 °C水浴条件下

反应20 ho利用“疏-烯”点击反应,将磷酸基修饰到硅球表面，步骤如下：向反应完全的硅球溶液中依次 加入22 mL水、30咽VPA和质量分数为1%的偶氮二异丁｛(AIBN),氮吹22 md后，于75 C水浴

条件下反应16 ho反应结束后，将所得纳米二氧化硅复合材料离心并用二次水清洗若干次，60 C下真

空干燥6 ho合成SO2 -T0 +材料：称取57 mg纳米二氧化硅复合材料溶于3 mL Ti(SO/)2水溶液(0. 1 mol/L) 中，反应1 h ,使磷酸根与T0+反应完全。将固定上T0+的纳米复合材料离心，并用二次水洗涤若干

次，64 C真空干燥备用。1.3 SO2-TO +纳米复合材料吸附性能考察分别测定S1O2-TO +材料对不同浓度磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的吸附量，作等温吸附曲线：平

行称取36份SiO2-T0 +材料mg置于2 mL离心管中，分别加入570咽质量浓度为0.3、1. 22, 0. 30、0. 0. 50、0. 6。mg/mL 的 a-casein> ^0-casein> OVA、HRP、TP、BSA溶液(蛋白溶液均用含 0.2 mol/L NaCl的3-(N-吗‘)丙磺酸(MOPS , 0.01 mol/L , pH 6.0)缓冲溶液配制)，超声使其均匀分

散，室温下吸附2 ho离心后，在波长230 nm和D nm处测定上清液的吸光度。进行3次平行实验, 取平均值。考察S1O2-TO +材料对不同蛋白在不同时间段的吸附量Q,制作吸附动力学曲线：分别称取0.5 mg SiO2 -T0 + 材料各 42 份，加入 0.5mg/mL 的 a-casein, 0Casein、OVA、HRP、TP、BSA 溶液(蛋白

溶液制备方法同上)各500 ,室温下超声振荡，按间隔时间段(3、3、30、45、60、99、32 min)离1230分析测试学报第33卷心取上 ，测

以吸附量Q对吸

280 nm和AOS nm波长处的吸光度值，计算出不同蛋白在不同时间段的吸附量Q，方作图。以糖蛋白HRP作为竞争蛋白进行竞争吸附实验：称取2.5mgSiO2-T0*材料于离心管中，取质量

浓度为0. 5 m//mL的汁casein和0. 5 m//mL的HRP混合溶液（体积比1 ： 1）厶。。叽。室温下超声分散育2 h后，离心取上 ，用紫外-可见分 度计在波长280 nm和AOS nm处测 吸光度值，根

据溶液吸附前后蛋白质浓度的变化，利用吸光度加合法计算吸附前后蛋白质的浓度，得出SOO-TO*

材料对两种 白的吸附量。1.4样品制备与SDS-PAGE凝胶电泳实验模拟蛋白质混合样的制备：配制^-casein （0. 4 m//mL）和HRP（0. 2 m//mL）的混合液（体积比

1 : 1）5 mL，于 4 °C

用。际样品制备：定量移取I。。^L伊利牛奶于6 mL离心管中，用含0. 2 moig NaCi的MOPS（0. 01

moig，pH 6.0）纟

稀释6。倍，于4C 用。分析。另外，

准确称取SOO-TO*材料1.0 me和2.0 me，分别加入厶。。叽的模拟蛋白质混合样、稀释6。倍的

牛奶样品，室 振荡2 h并离心，取其上 ，待SDS-PAGE凝

水洗涤两次，去除非特异性吸附的蛋白，

采用5。％乙月青、1% 乙酸、 用10%的氨水100叽洗分析。色。脱SOO-Ti4*材料特异性吸附的磷酸化蛋白，离心并取其上 ，待SDS-PAGE凝

亮蓝R250染色液对凝

实验采用5%浓缩胶与12%分离胶进行SDS - PAGE凝胶电泳实验，上样量均为10叽，以考马斯

色，使用乙醇-乙酸-水 （吃醇：V乙酸：V水二1 ： 1 ： 0）纟

2结果与讨论2.1 SiO2-Ti4 +材料的表征分别采用透射电镜、红外光谱（FT-IR）和X射线电子能谱（XPS）对所合成的SOO-Ti4*复合材料 征。如图1所示，硅球呈现规整的球形结构，粒径均一，分散性好，用nao meSurer软件统计

得到的粒径

66 nm°图1 SiO2 - T4*材料的透射电镜图

Fio 1 TEM imaaes of SiO2 - TO * nanocomposites从红外谱图（图2A）可以判断，1 090、799 oT1处为SO—O—SO的振动吸收峰，2 925 oT1处为

—CH的伸缩振动峰° 1 161 cm » 现的吸收峰为P—O的伸缩振动峰，该峰

乙烯基麟酸的特征吸收峰， 乙烯基牒酸已成 合到SOO纳米粒子 ° XPS谱图（图2B）表明所合成材料中含TO4 *成

有C、O、Si和TO元素° P2p在133 eV处的峰较弱，可能是因为XPS测得的只是SiO2 - T4*材料表面 的元素含量。TO和/的峰

纳米复合 的 °第3期50403020谢青等：T0+固载的纳米复合硅球的制备及其在磷酸化蛋白分离富集中的应用1231

(迟0 七

UISUE.IH006

100- 4 000 3 500 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 500Wavenumber(cm_1)图2 ,02 -T0 +材料的红外光谱(A)与X射线电子能谱(B)

Fig. 2 FT-IR(A) and XPS(B) of SiO2 - TO + nanocomposites2.2 SO2-TO +材料的吸附性能实验考察了 SiO2 - Td+材料在不同pH值条

对蛋白的吸 pH 6. 0的

。从图3可以 ，该材对磷酸化蛋白具有最高的吸附量，且不同pH值下,02 -Td+材

对0cweiu的吸附量 高于HRP和BSA ,说明材 的TO +对磷酸化蛋白中的磷酸基团有很强的亲和力。将0. 5 mg SX2 -Td +材 入

到 570 |±L 含 0.2 mol/L Nil 的 MOPS（0. 01 m（_/

L , pH 6.0）纟

中， 一系列 度图3 pH值对SiO2 - TO -材料吸附性能的影响Fig. 3 EEect of pH value on aksop/oa propePies of

SiO2 - TO - nanocomposites的蛋白质溶液，孵育2 ho从吸附等温线（图4A）

以 ，复合材料对磷酸化蛋白（acosein、

0cweiu和OVA）的吸附量

白质量浓度的增,该材料对非磷酸化蛋白（TP,大而增大，当蛋白质量浓度达0. 5mg/mL时,吸附基本趋于平衡。计算可得a-coseiu ,仔-coseiu和OVA

的最大吸附量分别为3.27、3.13、5.47 pnol/go

HRP和BSA）的吸附量变化不大，在蛋白质量浓度为0.2mg/mL时，吸附已基本达到饱和，此时TP、HRP和BSA的吸附量分别为3 6。、3 3、3 46 pmol/g。以上数据说明SX2 -Ti4 +材料对磷酸化蛋白进行了选择性的富集且吸附量较大。通过吸附动力学曲线考察了 SiO2-Ti4+材料对蛋白的吸附速率。从图4B可知，SiO2-Ti4 +对蛋白均具有较快的吸附速率，但由于T0+与磷酸化蛋白的亲和作用需一定的

此在34 md左右才基本达到饱和吸附。而对

磷酸化蛋白，主要 的是纳米复合材料与蛋白的非特异吸附作用，因此呈现扩散性吸附，吸附速率快且吸附量随时间的变化不明显。图4 SiO2 -Td +材料对蛋白的吸附等温线(A)及吸附动力学曲线(B)Fig. 4 A/sorp/oa isotherms of protein by SiO2 -T0+ nanocomposites ( A) an/ kinetics of protein aksorp/oaonto SiO2 - TO - nanocomposites( B)1232分析测试学报第33卷为了验证SOO -TO*材料在混合溶液中对磷酸化蛋白的特异性识别性能，本实验选择HRP作为竞

争蛋白，取1.0 me SiO2 - TO*材料及0. 5 m/mL蛋白质溶液加入到1 mL含0.2 mol/L NaCl的MOPS (0.01mol/L，pH 6.0)缓冲溶液中，孵育1 h，结果如图5A所示。从图中可以看出，SOO-TO*材料对 -casein的吸附量

HRP,说 材

白 的条件下，仍对磷酸化蛋白具有很好的吸 和识别性能°纳米复合材料的重复利用也是材料性能的一要指标，稳定性好的材 以多次使用，降低成

本。将SOO-TO*材 吸附1 h、10%的氨水 、重吸附，如此 使用后，检测其对-casein的

吸 ，

，

3 验，取 值。由图5B可知， 6 ，吸附量有所降低，主要的，且在离心过程中验过程中经离心和 ，材 的TO*有

以避免的材料损失。但总体上，材料的稳定性良好，可重复利用10-BIIIIIII8-2-0123456图5 SOO - TO*材料对蛋白的竞争吸附图(A)及SOO - TO*材料的循环利用吸附图(B)Fio 5 Competitive ansorption of protein by SiO2 -Ti4* nanocomposites ( A) and recycle ansorption of proteinby SiO2 - T4* nanocomposites( B)2.3 SiO2-Ti4 +材料对样品中磷酸化蛋白的富集通过SDS - PAGE凝胶电泳考察材料在混合溶液中对磷酸化蛋白的选择性分离效果，采用5%浓缩胶与12%分离胶，结果如图6A所示°kDa1161 2 3 4 566.245.035.025.018.414.4图6模拟样凝胶电泳图(A)与实际牛奶样品凝胶电泳图(B)

Fio 6 Gel electropPoresis of sioulate/ sample ( A ) and c mil/ rial sample ( B )可以看出，条带2为吸附之前的混合样(acasein + HRP),条带3为SOO-Ti4*材料吸附后的上清

液。对比可知，acasein几乎被SOO-Ti4*材料完全吸附，而HRP则很少被吸附。条带4为SOO-Ti4* 材料上

来的蛋白 谱图， 50%乙｛和1%三氟乙酸 特异吸附的蛋白后， 现了 a-casein电泳条带，而未出现HRP蛋白的条带，表明SOO - T4*材料能从混合样中选择性地分离富

集a-casein °将制得的SOO-Ti4*材料应用于牛奶实际样品的分析(图6B)，条带2为稀释60倍的牛奶谱图，蛋白分子量 Le)和ac白蛋白(a-ca)，

到小

3

现了 a-酪蛋白(a-casein)、—酪蛋白(—casein)、—酪 SOO-Ti4*材料吸附后的上

，与 2相比，

白(―3上磷酸

第3期谢 青等：TO +固载的纳米复合硅球的制备及其在磷酸化蛋白分离富集中的应用1233化蛋白a-casein和^-casein的电泳条带基本消失，其他区域的非磷酸化蛋白无显著变化。证实了 SX2- T0+材料可以选择性地分离富集牛奶样品中的磷酸化蛋白。条带4为SO4 -T0+材料洗脱后的电泳谱

图。与条带2相比，条带4中有磷酸化蛋白a-casein和^-casein的电泳条带，而未出现非磷酸化0吗g

和aCx。上述实验结果充分表明，本实验方法制得的SO4 -Td+材料对磷酸化蛋白具有良好的选择性 识别作用，可以用于复杂样品中磷酸化蛋白的选择性分离和富集。3结论本文结合“疏-烯”点击反应和“一锅法”，成功制备了 S04 -tR+纳米复合材料，并用于选择 性分离富集磷酸化蛋白。该材料制备过程简单方便，条件温和。实验结果表明该材料具有较好的形貌

特征,粒径均一，分散性好，并且对磷酸化蛋白具有良好的吸附效果。将该材料应用于复杂实际样品

中磷酸化蛋白的选择性分离富集,也获得了令人满意的结果。该材料有望在蛋白质组学领域得到更广 泛的应用。参考文献:[1]

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