代谢组学在胆汁酸种属差异及肝胆疾病分析的应用

代谢组学在胆汁酸种属差异及肝胆疾病分析的应用

姓名：斯日古楞申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：杨凌20090501

中文摘要目的为了综合研究胆汁酸在生物样本中种属差异以及寻找肝胆疾病分型代谢标志物，为疾病的诊断、治疗打下物质基础。我们对胆汁酸在不同种属动物胆汁及不同肝胆疾病病人胆汁及血浆中分布进行了系统研究，并建立了全面分析胆汁中胆汁酸的代谢组学方法。方法利用ＵＦＬＣ—ＤＡＤ及ＵＦＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳ两种色谱技术对生物样品进行代谢分析。采用多种统计学方法对样品进行分类，寻找代谢标志物。结果通过胆汁化学指纹分析发现不同种属胆汁具有不一致的胆汁酸组成，基于代谢指纹相似性开展了胆汁种属差异研究。借助主成分分析提取了的１２个特征代谢物（胆汁酸），并芬得种间界限相对清晰的种属分类结果。同时通过对不同肝胆疾病病人胆汁的分析，研究两种疾病聚类类型的分布，得到了明显的区分。结论基于特征标识物的胆汁酸分类获得了种间界限清晰的分类结果。应用代谢组学方法可以将两种疾病区分开并初步探讨了两种肝胆疾病病变标记物的归属。为系统研究胆汁酸打下良好基础并提供科学依据，同时也为今后进一步开拓代谢组学在临床研究中的应用奠定了基础。关键词胆汁酸代谢组学种属差异肝胆疾病ＴｈｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｅｔａｂｌｏｍｉｃｓｉｎＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙＤｉｓｅａｓｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｎａｎｄＳｐｅｃｉｅｓＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓＡｂｓｔｒａｃｔＢｉｌｅＡｃｉｄｓＯｂｊｅｃｔｉｖｅＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｂｉｌｅａｃｉｄｓａｍｏｎｇｖａｒｉｏｕｓｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｄｉｓｃｏｖｅｒｓｅｖｅｒａｌｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｒｅｌａｔｅｄｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｆｉｌｉｎｇｗｅｒｅｕｔｉｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｏｄｙｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂｉｌｅｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｍｍａｌａｎｄｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅｐａｔｉｅｎｔｓ．ＭｅｔｈｏｄｔｏｓｅｔａＡｖａｌｉｄＵＦＬＣｆｉｎ－ｆｒａｍｅｗｏｒｋｆｏｒｔｈｒｅｅｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅａｎａｌｙｓｉｓＷａｓｕｓｅｄｓｐｅｃｉｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｌａｓｓｉｆｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｉｌｅｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｈｅｐａｔｏ－ｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｆｉｎｄｓｅｖｅｒａｌｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，ＵＦＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳａｎｄｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｉｎｃｌｕ·ｃｌｉｎｇｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎａｌｙｓｉｓ（ＰＣＡ）ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ（ＨＣＡ）ｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓｓｔｕｄｙ．ＲｅｓｕｌｔＴｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎｒａｐｉｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｂｉｌｅｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｓｐｅｃｉｅｓ，ａｎｄｄｅａｒｓｐｅｃｉｅｓｄｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｗａｓｆｉｎａｌｌｙｏｈ－ｔａｉｎｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｈｉｓｎｅｗｅｈｅｍｏｔａｘｏｎｏｍｉｃａｐｐｒｏａｃｈ．Ｂａｓｅｄｗｅｒｅ０１１ＰＣＡｌｏａｄｉｎｇｓ，ｔｗｅｌｖｅｂｉｌｅａｃｉｄｓｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｂｉｏｍａｒｋｅｒｓａｎｄｕｓｅｄｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｏｒｅｗｅｒｅｐｒａｃｔｉｃａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＴｈｅｂｉｌｅａｃｉｄｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｐａＲｅｍｉｎｂｉｌｅａｎｄｐｌａｓｍａｏｂｔａｉｎｅｄａｎｄｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｆｒａｍｅｗｏｒｋｉｎｔｈｏｓｅ锄ｐｌ伪ｗａｓｓｅＳ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｅｘｐｌｏｒｅｄ．ＴｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅＡｖａｌｉｄｆｏｕｎｄｉｎｔｗｏｈｅｐａｔｏｂｉｈａｒｙｄｉｓｅａ－ｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒ－ａｎｄｒａｐｉｄ越ａｌｙｌｉｃａｌｍｅｔｈｏｄＷ８８ｄｅｖｄｏｐｏｄｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｉｒｔｅｅｎｂｉｌｅａｃｉｄｓｆｒｏｍｂｉｌｅｏｆｔｈｒｅｅｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓｍｅｔｈｏｄａｄａｐｔｅｄｔｏｔｈｅｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｎｄｂｉｏｍａｒｋｅｍＷｆｆｌ宅ｃｌ班随ｃｔ既ｉｚｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｈａｓｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｅｏｆｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｔｈｅｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓＢｉｌｅａｃｉｄｓａｎｄ印ｐｌｉｃａｔｉｏｎＫｅｙｗｏｒｄｍｅｔｈｏｄｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｓｔｏｄｙ．ＭｅｔａｂｌｏｍｉｃｓＳｐｅｃｉｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅ２内蒙古医学院学位论文原创性声明郑重声明：本人所呈交的学位论文是在导师指导下，独立进行研究所取得的研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文内容不包含其他个人或集体已经公开发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人学位论文与资料若有不实，愿意承担一切相关的法律责任。论文作者签名ｐｊ年６学位论文版权使用授权书ＲＳＢ本人完全了解学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学院保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。学院享有发表、复制、查阅、借阅及申请专利等权利。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。同时本人保证：毕业后发表、使用学位论文以及结合学位论文研究课题再撰写的文章，作者署名单位一律为内蒙古医学院。论文作者签名／指导教师签名盖壶凌．年４时日刁砒¨代谢组学在胆汁酸种属差异及肝胆疾病分析的应用代谢组学是上世纪９０年代后期发展起来的－－ｆｌ新兴学科，它通过考察生命个体对由疾病生理刺激或遗传修饰引起的内源性代谢产物的变化，来研究整体的生物学状况。目前代谢组学已被广泛应用疾病诊断、毒理学、药理学和基因功能组学等领域。它所关注的是相对分子质量为１０００以下的小分子。作为崭新的方法学，代谢组学已成为国际上疾病与健康研究的一个重要热点。根据研究的对象和目的的不同，可将代谢组学分为４个层次，即：１）代谢物靶标分析（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅａｂｏｌｉｃｐｒｏｆｉｌｉｎｇｐｒｉｎｔｉｎｇｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｓｉｓ），２）代谢轮廓（谱）分析（ｍｅｔ－ｆｉｎｇｅｒ－ａｎａｌｙｓｉｓ），３）代谢组学（ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｅｓ），４）代谢指纹分析（ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｎａｌｙｓｉｓ）ｏ胆汁酸是动物体内重要的内源性物质，具有多种重要的生理功能，而且其组成变化可以较为准确的反映肝脏的功能状况，进而用于考察及推导肝脏的受损程度。我们运用代谢组学的研究方法，建立了超高液相色谱联接紫外检测（ＵｌｔｒａＦａｓｔ／Ｈｉｇｈ—ＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＬｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｄｉｏｄｅａｒｒａｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＵＦＬＣ—ＤＡＤ）胆汁代谢组学检测方法，通过对不同种属动物胆汁中胆汁酸代谢组学对比研究分析，大鼠、猪与病人都得到了明显的分离，说明了在胆汁酸这种重要的内源性物质上，不同种属问有着显著的差异。同时建立了超高效液相色谱与质谱联用技术（ＵｌｔｒａＦａｓｔ／Ｈｉｇｈ—Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｈｙ—ＭａｓｓＬｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ－ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＵＦＬＣ—ＭＳ）代谢组学检测方法，分析了两种肝胆疾病病人胆汁中胆汁酸的代谢组学差异及血清的分布差异，发现两种疾病的胆汁样本得到了明显的分离，并对两组分离做出贡献的胆汁酸进一步分析，初步鉴定了六种贡献较大的胆汁酸，推测了可能的分子式及结构，为这两种肝胆疾病的临床诊断研究奠定了基础。第一部分基于胆汁酸轮廓分析的种属差异研究胆汁酸是动物体内重要的内源性物质，具有多种重要的生理功能，但是，由于胆汁酸种类较多，在不同动物中胆汁酸的种类和含量是不同的。虽然近年来许多技术方法已经被应用于不同动物的胆汁酸检测‘卜‘１，但这些分析报道都存在一些缺陷，因此，急需开发一种有效的、灵敏的分析技术考察胆汁酸在不同种属的分布情况。然而，借助常规分析３噍蓥直医堂瞳亟±婴窒生堂垡迨塞（三螋生２手段很难对生物样本中胆汁酸进行系统的化学分析。一方面，生物样本化学成分钕其复杂且多为微量成分。另一方面，胆汁酸的紫外吸收非常低，以至于普通ＨＰＬＣ难以分析检测［５１。在此情况下，本研究将采用代谢组学分析这一实用的分析手段来考察不同种属胆汁酸的整体分布情况，并基于代谢组学相似性开展胆汁酸的种属差异研究。最近出现的一种新型的液相色谱技术一一超高效液相色谱法（ＵｌｔｒａＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＬｉｑｕｉｄＦａｓｔ／Ｈｉｇｈ—ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＵＦＬＣ）采用了小粒径色谱柱填料，不仅使柱效大幅提高，而且在较宽的流速范围内柱效保持恒定，从而有利于通过提高流动相的流速而缩短分析时间，提高分析通量Ｍ】ｏ超高效液相色谱（ＵＦＬＣ）提供了更高的效率，因而具有更强的分离能力【７Ｊ’９】ｏ基于２．２１【Ｊｕｎ小颗粒技术的ＵＦＬＣ，与人们熟知的ＨＰＬＣ技术具有相同的分离原理。不同的是：ＵＦＬＣ不仅比传统ＨＰＬＣ具有更高的分离能力，而且结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。使用ＵＦＬＣ可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果ｏＵＦＬＣ具有以下优点：ａ．超高分离度ＵＦＬＣ使用了小微粒的填料２．’２阻颗粒的柱效比５岬颗粒提高了３倍。因为分离度与粒度的平方根成反比，因此分离度提高了７０％ｏ在梯度分离中也具有同样的优越性，此时分离能力用峰容量衡量。ＵＦＬＣ比普通Ｉ－ＩＰＬＣ能分离出更多的色谱峰，从而对样品提供的信息达到了—个新的水平，并且大大缩短了开发方法所需的时间ｏｂ．超高速度由于ＵＦＬＣ系统用２．２１ｕｎ颗粒，柱长可以比用５岬颗粒时缩短３倍而保持柱效不变，而且使分离在高３倍的流速下进行，结果使分离过程快了多倍而分离度保持不变。其快速分析亦节省了以往一向耗时的方法认证的时间，使方法认证变得简单快速。ｃ．超高灵敏度ＵＦＬＣ使用小颗粒技术可以得到更高的柱效（因而改善了分离度）、更窄的色谱峰宽，即更高的灵敏度。因为色谱峰变得更窄，峰高也就更高了；同样，当ＵＦＬＣ用于快速分析、用较短色谱柱而使柱效不变时，色谱峰高会相应增加。因此，使用ＵＦＬＣ技术，不仅可以在保持与ＨＰＬＣ相同分离度时提高峰高，而且在改善分离度的同时亦可提高峰高即灵敏度。与传统的ＨＰＬＣ相比，ＵＦＬＣ的速度、灵敏度及分离度分别是其９倍、３倍及１．７倍【６】。因此其在蛋白质、多肽、代谢组学分析及其它一些生化领域里将会得到广泛应用。本章应用ＵＦＩ￡一ＤＡＤ方法，利用标准品建立定性定量的分析方法，同时结合多元统计建立了胆汁样本中胆汁酸的ＵＦＬＣ—ＤＡＤ分析方法，并应用此方法对不同种属胆汁酸差异进行研究。４Ｏ婚萝’图Ｉ．１胆汁酸的化学结构Ｆｉｇｕｒｅ１．１Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｂｉｌｅａｃｉｄｓ１实验材料与方法１．１仪器与试剂超高速液楣色谱系统（日本岛津公司）配备有ＣＢＭ一２０Ａ系统控制器，ＤＧＵ一２ＱＡ３在线脱气机，ＬＣ一２０ＡＤ二元梯度泵，ＣＴＯ一２０Ａ柱温箱，ＳＩＬ一２０ＡＣＨＴ自动进样器及ＳＰＤ—Ｍ２０Ａ二极管阵列检测器。色谱纯乙腈及色谱纯甲醇购自美国ＴＥＤＩＡ公司，ＨＰＬＣ用水为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ纯水系统（法国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）所制超纯水，其它试剂为分析纯。胆汁酸标准品（纯度≥９８％）奥一ｃｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ（Ｇ—ＤＣＡ），ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ（Ｔ—ＣＡ）。ｃｈｏｌｋ：ａｃｉｄ（ＣＡ），ｃｈｅｎｏｄｅ－５ｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ（ＣＤＣＡ），ｄｅｏｘｙｅｈｏｌｉｃａｃｉｄ（ＤＣＡ），ｔａｕｒｏｌｉｔｈｏｅｈｏｌｉｃｃｈｏｌｉｅａｅｉｄ（Ｇ—ＣＡ），ｇｌｙｅｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｅａｅｉｄ（Ｇ—ＣＤＡ），ｔａｕｒｏｅｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｅ（Ｔ—ＣＤＡ），ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ（Ｔ—ＤＣＡ），ｇｌｙｃｏｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃｏｘｙｃｈｏｌｉｃ●＿－。。‘’。‘。。’。’。。‘‘’。‘。。。●＿一Ｔ内蒙古医学院硕士研究生学位论文（２００９年）ａｃｉｄ（ＴＬＣＡ），ｇｌｙ静ａｃｉｄａｃｉｄ（ＧＬＣＡ），ｔａｕｒｏｕｌ刊ｅ－ａｃｉｄ（Ｔ—ＵＤＣＡ）及ｇｌｙｅｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ（Ｇ—ＵＤＣＡ）均购自ｓｉｇｎｍ化学试剂公司ｏ１．２样品信息健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠（２００＋５９），购自大连医科大学，均为８周龄。饲养一周禁食一天后取胆汁。市场猪胆囊购自大连棒棰岛屠宰场，均为１．２年龄，立即取胆汁。人胆汁由大连医科大学附属第一医院提供，年龄见表２．１１．３样品的前处理依次用１ｍＬ甲醇、１ｍＬ０．０５％甲酸溶液活化固相萃取小柱。ｌｍＬ０．０５％甲酸溶液中加入２００灿标准品，混匀１ｍｉｎ后上小柱。依次用１ｍＬ０．０５％甲酸溶液、１ｍＬ甲醇水溶液（４５：５５，ｖ／，ｖ）冲洗。在重力作用下滴干后，真空抽干。再用１．５ｍＬ甲醇洗脱，洗脱液在６０℃氮气吹干，残余物溶于１００止甲醇中，漩涡混匀１ｍｉｎ。取２０止进行ＵＦＬＣ—ＰＤＡ分析，检测时间１５ｍｉｎｏ１．４胆汁酸ＵＦＬＣ—ＤＡＤ分析方法固定相为Ｃ１８色谱柱（１００Ｘ２．１ｍｉｌｌｉ．ｄ．，２．２岬）；流动相包括乙腈（Ａ）与１０ｒａＭｍｉｎ，３０％Ａ；２—８ｍｉｎ，３０—４５％磷酸二氢钾溶液（Ｂ），采用如下梯度洗脱条件：０—２Ａ；８—１１ｍｉｎ，４５－８０％Ａ；ｌｌ一１５ｍｉｎ，８０％Ａ；１５一１８ｍｉｎ，平衡至３０％Ａ．。检测波长：２００ｎｍ；流速：０．５ｍＩＪｍｉｎｏ检测温度：６０℃。１．５数据处理和分析在代谢组学的研究中，大多数情况是要从检测到的代谢产物信息中进行分类（如基因突变前后的响应）或多类（如杂交后各不同表型间代谢产物）的判别分类，因此在数据分析的过程中应用的技术也就集中在模式识别技术上，包括无监督模式识别和有监督模式识别两类。无监督学习方法用于从原始谱图信息或预处理后的信息中对样本进行归类，并采用相应的可视化技术直观地表达出来，不需要有关样品分类的任何背景信息。该方法将得到的分类信息和这些样本的原始信息（如药物的作用位点或疾病的种类等）进行比较，建立代谢产物与这些原始信息的联系，筛选与原始信息相关的标记物，进而考察其中的代谢途径。用于这个目的的方法无可供学习利用的训练样本，所以称为无监督（ｕｎｓｕ．６囱鐾直匿堂堕塑圭堑塞生堂焦迨塞ｆ兰塑生２ｐｅｒｖｉｓｅｄ）学习方法。主要有主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ线性映射‘１２】、簇类分析（ＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌＣｌｕｓｔｅｒｉｎｇＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓＡｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）ｕＤ·ｕ１、非Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＨＣＡ）‘１３１等。有监督学习方法用于建立类别间的数学模型，使各类样品间达到最大的分离，并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测。本章数据分析基本过程如下：原始数据采用ＳｈｉｍａｄｚｕＣｌａｓｓ—ＶＰ软件进行色谱谱峰识别以及峰匹配，然后构建多维数据集，并采用归一化法进行多维数据的分析。数据分析的方法包括主成分分析方法（ＰＣＡ）和簇类分析方法（ＨＣＡ）ｏ２结果与讨论２．１ＵＦＬＣ分析方法的建立及验证胆汁成分极其复杂，其甲醇溶解物中不但含有胆汁酸等胆汁的特征次生代谢产物，还含有大量水溶性物质及非极性成分。为考察不同种属问胆汁特征代谢产物（主要是胆汁酸类物质）的分布差异，本研究参照已有文献【ｌ引，采用固相萃取作为样品前处理方式，除去甲醇溶解物中水溶性及非极性成分，保留并富集中等极性的胆汁酸类化合物作为主要研究对象进行ＵＦＬＣ分析。７ＵＦＬＣ分析方法的验证分别开展了精密度、重现性及稳定性测试。精密度通过对样品１连续进样六针来测定，发现所有被选物质峰的保留时间及峰面积的相对标准偏差分别为０．５％与１．７％。通过对来自不通种属胆汁样品进行ＵＦＬＣ分析发现，被选物质峰的保留时间及峰面积百分比偏差小于３．２％，说明此方法可获得重现性高的ＵＦＬＣ指纹谱。日内差通过对同—个样品于一天内在不同进样量下（５，１０，１５及３０斗Ｌ）重复进样后获得，其保留时间及峰面积的相对标准偏差分别为０．８％和２．２％ｏ日间差通过对同一样品在连续三天内重复进样后获得，其保留时间及峰面积的相对标准偏差小于５％ｏ测定了十三种胆汁酸的检测限及定量限，发现检测限介于０．２Ｉｌｇ到０．６ｎｇ之间；定量限介于１ｎｇ到２Ｉｌｇ之间。加样回收率通过对样品中加入已知量的１３种胆汁酸标准品进行考察，其加样回收率介于９０％至１０５％。以上结果证实该ＵＦＬＣ分析方法适于部分纯化后的胆汁分析ｏ２．２不同种属胆汁中胆汁酸分布差异在过去二十多年中，借助ＨＰＬＣ及ＬＣ—ＭＳ等技术，国内外学者已发现各个物种诸如大鼠、猪、人等种属生物样本的胆汁酸含量。然而，对于多个种属的胆汁酸分布模式上的系统比较还未见报道。近年来，以胆汁酸作为生物样本标记的研究逐渐增多，意义重大。因此本研究选择不同种属来源的胆汁样品为研究对象，借助ＵＦＬＣ分析考察了不同７种属的胆汁酸分布差异。本研究首先开展了不同种属来源的胆汁样品的ＵＦＬＣ分析，图２．１显示了四种不同种属胆汁样品的ＩＪＦＬＣ—ＤＡＤ谱图，从图中可以看出，不同种属来源的胆汁样品具有完全不同的谱图，暗示不同种属胆汁中具有完全不同的胆汁酸化学分布。此外，借助ＵＦＬＣ—ＤＡＤ分析还发现在３—１５分钟色谱区域内分布的主要物质峰都具有与胆汁酸类化合物一致的紫外特征吸收（２００ＩｌＩＴＩ），提示胆汁中富集了大量的胆汁酸类化合物。表１．ＩＴ＆ｂｋ１．Ｉ三种种属胆汁样本的胆汁酸分布和含量１１ｌｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｂｉｌｅａｃｉｄｓｉｎｂｉｌｅＳｍｐｌ，，脚ｃ酬（％一一１）“ＣＤｃ＾Ⅸ二＾弧胁ａⅡＩｃ＾ＯＣ＾Ｔｃ＾ＧａＸ＾１１旺ｃ＾市Ｘ＾ＣＤｃ＾ｎ￡＾Ｃ“■ＮＱ１０．＂／３Ⅷ旺７４‘＆ｌｌＮＱ５．耵１．∞３１．∞ＮＱ１０．．∞Ｉ。７ｌ脚∞ＮＱＮＱ队２ｈｈ●５．鸽№ＮＱ鄞．ＯＩ，７，Ｏｌ１１１．４５，．．９４ＮＱ剪．７５笠．Ｍ阳№ＮＱｚ３ｌ盹哪№ＮＱ５．∞４．∞ｚ４６ＮＱＯ．∞位复５．∞№№ＮＱＮＱ仉甜粥．剪ｌＡ．‘６．鹞３．３阳２０．日仡９４∞．３ｌ∞．‘６±＿ｈ±ｎＩｌ№№№№眦№№２．．叠ｔ阳４．５１９．如ｔ№Ｉ．田３．五土１．７３阳１．姥９．冀№№№阳螂．４＇７５１．ＳＩｍｎｔ量４４＆Ｄ．１工孵№№№阳呻ＮＱ阳一Ｑ挣．５６．∞埘．刃ｎ．Ｏ‘剪．６０笛．位ＺＨ圩．墨２．忿ｌ笳．４６５．６ｌＮＱ，曰．，６丘籍ＮＱ陶＇．‘掰．６１３．．Ｉ５ｌｔ７，翻６．２ｌ啦２啊３ＰＩｌ４哪呻啦阳弘．∞—Ｏ孵．１４，—Ｑ仡３ＺＨ．９４阳４９．盯叼№日．３１竹．１叠．，，ｌ国．０５∞ｌ一±＇Ｌｇ脚７．８４仡∞Ｍ．罄１譬ｔ孔蕾∞．劈鱼■●也４１１■Ｑ阳啦啦啦呻１２２．５ｌ—口■皿ｔ曩卫∞‘．一ＮＱ｜．Ｑ‘．曰ｔ，．１０—－ｔ％５如ｔ丑岱Ｊｏ．曰拼．．５Ｚ王ｏｔ‘伍士６弧Ｍ，旺７９±Ｍｌ蕾憎鹫．●‘Ｉ‘．侈４＂／．６Ｉ瓢７ｌ２００．６搬．丑阳№第．悖№Ｉ吣№№脚№觚荔Ｉｌ弦９４３ｌ缸４５ｌａ５．％ｈ岫２●鲺盆ｈ妇３脚．６４＾妇‘乳．９■＿±Ｊ匝ｌ●纰７１呻№勰．ｍ—Ｑ—Ｑ３４．诏藏３７２７．钒矗罄●．麓阳№链７ｔ凹盹№哪啊蛐№№№№啦脚哪盹№ｌ叼埘脚脚心心廿．霓复曩±丑．１２５．４４±一Ｉ笛６．们ｎ基Ｚ基工ｎ．皿．业Ｚ墨．盘也丑ＮＱｎｏｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ根据表１．１结果，在大鼠胆汁样本中，大约９５％的胆汁酸是牛磺酸结合型胆汁酸，其中浓度最高的是ＴＣＡ，原因可能是在啮齿类动物体内的牛磺酸浓度和氮一酰基移酶（Ｎ－ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）的活性较高。在猪胆汁样本中，大约６５％的胆汁酸是甘氨酸结合型胆汁酸，其中含量较高的是ＧＤＣＡ（４５．７１％）及ＧＣＡ（１８．８８％）。而在胆结石病人胆汁样本中，游离胆汁酸的比例占了８９．４６％，主要的游离胆汁酸为ＣＤＣＡ（６０．７６％）及ＣＡ（２８．７０％），而这两种胆汁酸可以促进胆固醇的分泌及胆固醇淤积，高浓度的胆固醇又是胆结石形成的直接原因。另一方面，胆汁酸由一系列的转运载体转运至胆道，如胆酸盐转运载体（ｂｉｌｅｓａｌｔｅｘｃｒｅｔｏｒｙｐｕｍｐ，ＢＳＥＰ）及多药耐药蛋白（ｍｕｈｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ，Ｉ－ＩＲＰ）。胆结石病人胆汁中高浓度的ＣＡ及ＣＤＣＡ可能由于转运结合型胆汁酸的转运载体发生异常。８图１．２标准品及三种动物胆汁的ＵＦＬＣ谱图：（Ａ标准品；Ｂ大鼠胆汁；Ｃ猪胆汁；Ｄ胆结石病人胆汁）ｂｉｌｅａｃｉｄｓ；（Ｂ）Ｆｉｇｕｒｅ１．２Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓｏｆ（Ａ）ｓｔａｎｄａｒｄｏｆｔｈｉｒｔｅｅｎｒａｔｂｉｌｅ（２）；（Ｃ）ｐｉｇｂｉｌｅ（４）；（Ｄ）ｃｈｏｌｅｌｉｔｌｌｉａｓｉｓｐａｔｉｅｎｔｂｉｌｅ＊Ｐｅａｋｌ，Ｔ－ＵＤＣＡ；２，Ｔ－ＣＡ；３，Ｇ－ＵＤＣＡ；４，Ｇ—ＣＡ；５，Ｔ－ＣＤＣＡ；６，Ｔ－ＤＣＡ；７，ＣＡ；８，Ｇ—ＣＤＣＡ；９，Ｇ—ＤＣＡ；１０，Ｔ－ＬＣＡ；ｌｌ，ＣＤＣＡ；１２，ＤＣＡ；１３，Ｇ－ＬＣＡ２．３胆汁酸种属差异研究传统的代谢组学分类往往基于个别化合物在不同种属样品中的平均含量来完成物种间的相似性评估，且这些化合物通常是人为预先指定的。但该方法不可避免人为选择的盲目倾向，且在种内化合物定量差异显著的种属分类研究中，往往会导致错误的结果。已有研究以及我们相关的定量分析结果显示，同一种属来源的胆汁样品中一些胆汁酸的定量差异可达４００％以上【１５１ｏ年龄、性别等因素均可造成巨大的种间定量差异。因此，基于个别胆汁酸定量数据的化学分类在动物种属分类中很难取得良好的结果。与之相对的是，基于代谢指纹相似性的化学分类采用所选物质峰的相对值为原始数据，不但可避免由于显著定量差异造成的错误分类；还可避免人为选择标识物的盲目性；更为重要的是，与个别化合物的化学信息相比，代谢标志物的整体差异更能代表样品间化学分布上的差异ｏ２．３．１种属分类的数据提取与处理９●－－＿·。ｏ－‘ｏｏ＿＿＿＿＿＿＿’＿＿ｏｏ＿‘ｏ＿＿＿－ｏｏ。－－＿－‘‘ｏ－·－＿＿·－●＿＿＿＿－＿·＿－＿＿＿·＿－一ｉ内蒙古医学院硕士研究生学位论文（２００９年）ＵＦＬＥ—ＤＡＤ分析得到的原始数据不能直接用于后续的数据分析，必须经过一个前处理过程，这个过程主要包括峰判别，峰对齐，归一化等步骤。经过前处理后的数据方可进行多维及单维数据分析，从而得到更接近生物学意义的结果和解释。将得到的样品的ＵＦＬＣ—ＤＡＤ图谱数据通过ＳｈｉｍａｄｚｕＣｌａｓｓ—ＶＰ判峰程序，该程序将自动执行基线校正，峰辨识，峰对齐等计算过程，最终得到一个由指定的峰序列号（与保留时间和质荷比对相对应）、观测点（样品号）以及峰强度组成的三维矩阵，这个矩阵经过归一化之后将用于所有后续的数据分析ｕ６．。¨ｏ２．３．２基于簇类分析的化学分类研究簇类分析法（ＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌＣｌｕｓｔｅｒｉｎｇＡｎａｌｙｓｉｓ，ｒｍＡ）是代谢组学相关研究中常用的算法，是根据事先确定的待聚类数目把待聚类样本分为Ｎ类，计算两两之间的距离，构成距离矩阵，合并距离最近的两类为一新类，计算新类与当前各类的距离［１８。１引。再合并、计算，直至只有一类为止。簇类分析算法已在很多领域得到了广泛的应用。进行簇类分析前首先要计算相似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ），然后可使用以下四种方法计算类与类之间的距离：最短距离法（ＮｅａｒｅｓｔＮｅｉｇｈｂｏｒ）、最长距离法（ＦｕｒｔｈｅｓｔＮｅｉｇｈｂｏｒ）、类间平均链锁法（Ｂｅｔｗｅｅｎａｇｅ）或类内平均链锁法（ＷｉｔｈｉｎｇｒｏｕｐｓｇｒｏｕｐｓＬｉｎｋ·Ｌｉｎｋａｇｅ）。本文将以组内的相似度为依据，采用欧氏距离作为判断相似度的标准，即距离越近相似度越大，距离越远相似度越小。图１．３显示了基于不同种属胆汁样品ＵＦＬＣ指纹相似性的簇类分析结果，从中可以看出，大鼠胆汁样本（１，２，３，４，５，６）聚为一类，猪胆汁（７，９，１０，１１）聚为一类，胆结石病人胆汁（１２，１３，１４，１５）聚为一类。从图中可以看出，８号样品比较特殊，它和猪的距离比较远，和病人的距离比较近。这种算法将原本属于第二组的８号样品归为第三组。这也是这种分类方法的局限性口●·●·●●ＩＩＩＥｔ▲ｌＣＩＩＣ▲ＬＣＬ－ＳｌＥｔ▲Ｉ▲ＬＩＳＩＳ·●·●●‘加ｎｄｌ＇ｏｆｆ／ｍｑ妇ｃ呻ｋｔｏ０５ｔｉｎｋ≈ｏｌ俄｜ｌ一班ｌｔ帕Ｃｌ蕾ｔ以ｃａ●ｂｉ－１０１５加‘箱图１．３基于ＵＦＬＣ指纹相似性的三种动物胆汁样品的层次聚类分析图Ｆｉｇｕｒｅ１．３ＨＣＡｄｅｎｄｒｏｇｒａｍｏｆｔｈｒｅｅｓｐｅｃｉｅｓｂａｓｅｄ０１１．ｔｈｅｒａｗｄａｔａｓｅｔ１０直鐾直匿堂堕亟±婴壅生堂垡途塞（兰Ｑ塑望２２．３．３基于主成分分析的化学分类研究主成分分析（ＰｒｉｎｃｉｐａｌＣｏｍｐｏｎｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）也是代谢组学研究常用而且比较有效的模式识别方法，即将分散在一组变量上的信息集中到几个主成分（ＰＣ）上，利用描述数据集的内在模式‘轨２¨。主成分是由原始变量按一定的权重经线性组合而成的新变量，这些变量具有以下性质：１、任意两个主成分之间都是正交的；２、第一个主成分包含了数据集的绝大多数方差，第二个主成分次之，以此类推。这样，有前两个或三个主成分作图，就能够很好的反应数据集所包含的生物化学变化。这样的主成分图能够直观的描述病理生理改变之后生物体内的代谢模式的变化。每一个样本在主成分图上的位置纯粹由它的代谢反应所决定，处于相似病理生理状态的样本具有相似的组成，因此在主成分图上也处于相似的位置。在这种比较简单的方法中，将供试样本与代谢模型进行比较，就可以确定它在主成分图上的位置，从而确定其机理，并有可能找到代谢标志物。本研究基于三种不同种属１５个胆汁样品中１２种胆汁酸的化学信息开展了主成分分析，图１．４是基于这些胆汁酸分类结果，结合得分矩阵图和主成分分析打分（表１．２）可以看出大鼠胆汁所有点在得分矩阵图的ＰＣＩ和ＰＣ２的负方向排列，猪胆汁大部分点ＰＣ２的正方向排列，而结石患者胆汁ＰＣＩ的正方向和ＰＣ２的负方向排列，其中有一个猪胆汁的点向ＰＣ２的负方向偏移。和ＰＣＡ法的结果进行比较，ＨＣＡ算法的结果不如ＰＣＡ算法的结果令人满意。表１．２Ｔａｂｌｅ１．２Ｔｈｅ１２个所选物质峰及其主成分分析打分ｔｈｅｆａｃｔｏｒ￥ｃｏｒｅｍａｔｒｉｘｆｒｏｍＰＣＡｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ汹ａｎｄ０．１１Ｏ．０７Ｏ．０７０．１６００Ｏ００００．６９０．１４１．０００．９９０．５８Ｏ００ＯＯ．０２０３０．０００ｒ７０．００２４０．００３００．０１８１０Ｉ．０００００．０４５５０．３５６５ｌ２３４５６７８９ｌＯｌｌ１２１３１４１５０ＯＯＯＯ．０２０．ＯｌＯ．０２０．０２Ｏ．０ｌＯ０ＯＯＯＯ０．１５Ｏ．３２１．００Ｏ．０２００．９７０Ｏ１．００ＯＯＯ００ＯＯＯ０００．２８Ｏ．３ｌ０．３３１．０００．０６０．０３０．０２Ｏ．０４Ｏ．２１０Ｏ０００ＯＯ．∞Ｏ０Ｏ０Ｏ．ｃｒ７０．８ｌＯ０ＯＯ０Ｏ０．０ＩＯ０．ＯｌＯ．２ｌ０．６２０．２６１．００Ｏ．０４０．０３ＯＯＯＯ００００．２５０．０５Ｏ．７６０．１３０．５９０．６５０．３００．２２Ｏ．０３０．１２Ｏ．３ｌ０．１８０Ｏ０Ｏ０．０２Ｏ．仇０ＯＯ０．５ｌＯＯＯ．２６０．∞Ｏ．１５Ｏ．１８１．∞０．１５１．０００．２０ＯＯＯ０Ｏ．５６０．９ｌＯＯ０．７７Ｏ．５００．６３０．幻０．７８０Ｏ０Ｏ０．６ｌＯ．８９０．８００．１００．０４１．∞０．６ｌＯ０００Ｏ．３２３９０．８１２８０．１６２７Ｏ，０９１７０．１２７３Ｏ．００８５１．∞０．７８ＯＯＯＯＯ．２０Ｏ．１７Ｏ．３６１．∞Ｏ．０２０．２０Ｏ．４５１．０００Ｏ０ＯＯ．１３Ｏ．０ｌＯ．６ｌ１．∞Ｏ．０５１１▲ＨＥａ鲫‘Ｉ·５吨色１图１．４基于成分因子对１４个胆汁样品分类图（◇）鼠胆汁（口）猪胆汁（△）人胆汁Ｆｉｇｕｒｅ１．４ＴｈｅＰＣＡｐｌｏｔｂａｓｅｄｐｉｇｂｉｌｅｏｎｓａｍｐｌｅ（△）ｃｈｏｌｅｌｉｔｈｉａｓｉｓｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ：（◇）ｒａｔｂｉｌｅｐａｔｉｅｎｔｂｉｌｅｓａｍｐｌｅｓａｍｐｌｅ（口）以上结果表明，基于代谢指纹或基于特征化学标识物（胆汁酸）分布相似性化学分类可以较为客观的反映不同动物各种属间的相互关系。同时也从侧面反映了亲缘关系相近的物种不但具有相似度高的ＤＮＡ序列，其化学分布同样具有相近趋势陋∞】。３不同种属动物的胆汁酸分布及其代谢规律从ＵＦＬＣ—ＤＡＤ代谢轮廓分析结果可以看出，不同种属来源的胆汁的代谢轮廓和化学组成完全不相同，暗示不同种属的胆汁中胆汁酸存在不同的代谢框架（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｒａｍｅ—ｗｏｒｋｓ）ｏ大鼠最重要的化学特征是富含ＴＣＡ，这也暗示该物种存在这种胆汁酸的次生合成路径。市场猪最重要的化学特征是Ｇ一结合的胆汁酸浓度高，而结石病人胆汁中的游离型胆汁酸和结合ＬＣＡ浓度偏高。通过不同的数据处理方法，初步确定大鼠胆汁中代谢标记胆汁酸为ＴＣＡ，猪胆汁中为ＧＣＤＣＡ，胆结石患者胆汁中为ＣＡ及ＣＤＣＡｏ。一ｎＣ扩一／。：—广‘≮１一』：《！；要卜。』＝：￡芦。』：ｌ！≠ｊ§飞。，ｃ￡！；主卜。““。…．＼彭一万～．ｑ５《＝＝＝∥＋ｎｏｒａ●＿Ⅲ鼍蚤ｐ，、Ｐ＾、－、∥客一＼一。一｜｜矮ｙ“＿｜图１．５胆汁中胆汁酸ｑ三物合成框架Ｆｉｇｕｒｅ１．５Ｐｒｏｐｏｓｅｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｒａｍｅｗｏｒｋｆｏｒｂｄｅａｃｉｄｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｂｉｌｅ１２直苤直匿堂医亟圭婴童生堂焦迨塞（兰塑生２胆汁中的化学组成及其在结构上的相似性（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）可以帮助我们推导该组织中的次生代谢网络，尤其是对胆汁酸的生物合成路径及调控位点。图１．５显示了胆汁中胆汁酸问的生物合成关系，从中可以看出，ＵＦＬＣ—ＤＡＤ分析所获得的胆汁成分主要是胆汁酸生物合成的末端产物，而胆汁酸生物合成的上游产物及中间体由于都为非极性化合物，对它们的分析则需要借助ＧＣ—ＭＳ来完成Ⅲ】。４小结本章首先开发了适于胆汁酸分析的ＵＦＬＣ分析方法，并采用此方法获取了三种哺乳动物的ＵＦＬＣ—ＤＡＤ胆汁图谱。通过对比不同动物种属来源胆汁样品的代谢指纹图谱后发现，不同种属种属动物胆汁胆汁酸分布完全不同，显示了不同的代谢指纹代谢框架。在此基础上，借助多变量分析技术，首次开展了胆汁酸种属差异和代谢框架研究。基于代谢相似性的胆汁酸分类可将３个不同种属区分为３组，但种间的界限并不清晰。进而利用主成分分析的降维能力及等度簇类分析的分类能力，提出了基于特征标识物的胆汁酸化学分类新方法。采用主成分分析寻找并选择了与胆汁酸分类相关的１３种胆汁酸特征峰作为化学分类的标识物（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ），并借助聚类分析技术首次开展了基于特征代谢物分布相似性的胆汁酸化学分类研究。结果显示，基于特征标识物的胆汁酸化学分类获得了种间界限清晰的分类结果。该方法不但克服了传统化学分类（基于人为设定化学标识物的绝对量）受人为因素影响大等弊端；还具有很强的实用性，可被应用于生物样品的种属来源鉴定。通过ＵＦＬＣ分析方法对不同种属胆汁酸代谢进行轮廓分析并定量分析１３种胆汁酸，发现不同种属来源的胆汁酸代谢轮廓和化学组成完全不相同，说明不同种属的胆汁中胆汁酸存在不同的代谢框架（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ）。此外，借助ＵＦＬＣ—ＤＡＤ技术监测了所选１２种胆汁酸的特征分类标识物，结果显示，这些特征标识物不但在不同种属胆汁样本中的分布具有差异性，且在个别种属中的种问含量也具有特异性。第二部分ＵＦＬＣ—ＭＳ代谢组学方法在肝胆疾病胆汁分析中的应用肝脏是人体重要的代谢器官，具有代谢体内内源性物质、药物和毒物的功能，它１３囱鏊直匡堂医亟主班壅生堂垡迨塞（！塑生２是一个多功能器官，在维持人体内环境的稳定性中起着重要的作用。当胆固醇浓度过高使肝细胞发生进行性破坏，经过较长时间后肝细胞不能充分代谢体内物质和维持内环境稳定，因而出现胆结石和胆囊炎症状，胆结石和胆囊炎发展到终末期，引起肝脏大部分损害，因而体内出现代谢功能障碍，致使其积蓄在体内的胆汁酸而引起一系列自身中毒症状。由此可见，早期发现这两种疾病并得到及时治疗对患者生存和愈后都有非常重要的意义。大量研究表明，早期检测治疗胆结石及胆囊炎有着重要的临床和经济学价值。人的胆汁样本成分复杂，内源性代谢产物比较丰富，目前已从胆汁中分离获得胆汁酸、胆色素、黏蛋白体及氨基酸、少量脂肪、胆甾醇、卵磷脂、胆碱以及氯化钠、磷酸钙等不同类别的数百种化合物，而且大部分胆汁酸是色谱保留行为相似的多种异构体，借助常规分析手段很难实现系统分析。因此应当开发一种适于胆汁复杂样品的快速灵敏的代谢轮廓分析方法。ＵＦＬＣ—ＭＳ兼具了ＵＦＬＣ强大的色谱分离能力以及质谱的高灵敏度及良好的结构解析能力等特点，也在近年来被广泛用于复杂生物样品的代谢轮廓分析‘２５－２７１及不同疾病分型的研究‘２３１。针对胆汁样本内源代谢物复杂等特点，本章以采集的胆结石及胆囊炎病人胆汁为样本，应用建立的ＵＦＬＣ—ＭＳ代谢组学方法进行检测分析，对胆囊炎及胆结石的早期诊断进行探索研究，基于质谱信息开展了胆汁中胆汁酸的归属，对获得的原始数据运用代谢组学的模式识别方法进行统计分析，以期建立两种疾病的代谢组学模型并发现其可能，并寻找其可能的代谢标志物或代谢标志群，为以后该方法应用于临床奠定基础。１实验材料与方法１．１仪器与试剂超高效液相色谱单重四极杆质谱联用仪（日本岛津公司）配备有二元溶剂管理器、在线脱气机、样品管理器、ＴＵｖ紫外检测器、ＳＱＤ检测器。ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１质谱工作站软件ｒ日本岛津公司）。色谱纯乙腈购自美国ＴＥＤＩＡ公司，ＨＰＬＣ用水为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（法国Ｍｉｌｌｉ·ｐｏｒｅ公司）超纯水，其它试剂为分析纯。胆汁酸标准品购自Ｓｉｇｍａ公司。１．２不同疾病样品信息与处理不同疾病的样本信息见表２．１，样品前处理方式同本论文１．２．３。１４表２．１ＵＦＬＣ—ＭＳ疾病分析所用的２０个病人胆汁样品ＡｓｕｍｍａｘｙｏｆｂｉｌｅｓａｍｐｌｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓＴａｂｌｅ２．１ｍａｙ１．３不同疾病胆汁的ＵＦＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳ代谢轮廓分析方法液相色谱条件：色谱柱为Ｃ１８柱（２．１×１００ｍｉｌｌ，粒径２．２ｐａｎ）；流动相包括１０ｒａｍ醋酸铵（Ａ）与乙腈（Ｂ），采用如下梯度洗脱条件分析胆汁样品：０—５分钟，７０％－６４％Ａ；５—８分钟，６４％一５３％Ａ；８—１０分钟，５３％一１０％Ａ；１０一１３．５分钟，１０％Ａ；１３．５—１７分钟平衡至７０％Ａｏ检测波长：２００ｒｉｍ；流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ；柱温：４０℃；进样体积：５此ｏ１．３．１质谱条件优化液相色谱一质谱联用仪配有离子源和三重四级杆质谱检测器，对样品离子化影响较大的参数主要有毛细管电压、源温、脱溶剂气温度、锥孔气流等，其中尤以毛细管电压、源温对样品的离子化影响最大，本课题重点对这两个参数进行了考察。１．３．１．１毛细管电压优化毛细管电压是影响电喷雾过程中带电液滴表面电荷的主要。在其他参数相同的条件下，改变毛细管电压，观察毛细管电压对样品电离的影响，分别得到ＥＳＩ一（４．０ｋｖ、４．２ｋｖ）的直接进样图谱，见图２．１。发现毛细管电压为４．０ｋｖ时，电离效果较好。图２．１ＥＳＩ一模式下毛细管电压分别为４ｋｖ、４．２ｋｖ时总离子流图Ｆｉｇｕｒｅ２．１Ｔｙｐｉｃａｌｔｏｔａｌｉｏｎｃａｐｉｌｌａｒｙｖｏｌｔａｇｅｃｕｒｒｅｎｔ汀Ｉｃ）ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆＥＳＩ．ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔ１．３．１．２源温优化源温是影响物质电离的重要因素之一，当源温过高时有的化合物的分子离子可能被打碎，当源温过低时有的物质可能无法被电离。在其他参数相同的条件下，改变源温，观察源温对样品代谢物图谱的影响，分别比较源温２００。Ｃ、２７５。Ｃ的离子化效果，发现在源温为２７５℃时，效果较好。最终确定质谱分析条件：在负离子化条件下检测；扫描范围：ｍ／ｚ２００—８０００其它质谱参数包括：毛细管电压，４ｋｖ；离子源温度，２７５℃；锥孔反吹气（Ｎ：），５０Ｌ／小时；去溶剂气温度，３５０ａＣ；去溶剂气流量（Ｎ２），８００ｔｅｄ，时ｏ１．４数据选择及数据分析选择代谢轮廓分析获得的９种胆汁酸及其在两种肝胆疾病分布信息（ＮＤ代表未检测到；＋代表微量；＋＋代表中等含量；＋＋＋代表高含量）为研究基础数据，构成原始数据集。数据采用簇类分析（ＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓ１１．０，ＳＰＳＳａｇｅｂｅｔｗｅｅｎＣｌｕｓｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓ，ＨＣＡ）及主成分分析（ＰｒｉｎｃｉｐａｌｆｏｒｗｉｎｄｏｗｓｌｉｎｋＡｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）构建不同病人系统发生树。使用ＳＰＳＳ软件（ＳＰＳＳＩｎｅ．，ＵＳ）开展簇类类分析及主成分分析，并选择平均关联方法（ａｖｅｒａｇｅｇｒｏｕｐｓ）及Ｐｅａｒｓｏｎ关联分析（Ｐｅａｒｓｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）用于相关性研究。ＰＣＡ作图借助ＭＡＴＬＡＢ７．０完成ｏ２结果与讨论２．１不同肝胆疾病代谢轮廓分析及整体化学分布特征１６ＡＢ从八一．～～，、，、图２．２两种疾病胆汁负离子模式下的总离子流图（Ａ胆结石病人；Ｂ胆囊炎病人：）Ｆｉｇｕｒｅ２．２Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｔｏｔａｌｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）ｏｆｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅ（Ａ，ｂｉｌｅｏｆｃｈｏｌｅｌｉｔｈｉａｓｉｓｐａｔｉｅｎｔ；Ｂ，ｂｉｌｅｏｆｃｈｏｌｅｃｙｓｔｉｔｉｓｐａｔｉｅｎｔ）在过去二十多年中，ＬＣ—ＭＳ技术被广泛用于不同生物样品的化学分析中‘凹－３３１，且已有研究发现ＥＳＩ源更适于胆汁中胆汁酸类化合物的分析阻】。本研究应用ＵＦＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳ代谢轮廓分析方法对胆囊炎７例、胆结石１３例患者的胆汁进行了检测分析，得到其原始谱图和数据并系统开展了两种肝胆疾病胆汁的化学成分分析。结果显示，在ＥＳＩ正离子及ＥＳＩ负离子模式下，胆汁酸类化合物均可被离子化，并获得相应的分子离子峰用于化合物分子量的确定，但在负离子模式下离子化的效果更好。在负离子模式下ＥＳＩ源对胆汁酸分析几乎不产生碎片离子，全部产生分子离子峰，这些分子离子峰对于胆汁酸类的结构归属非常重要。在优化后的检测条件下，１５种胆汁酸的检测限在０．０５到０．１ｎｇ之间，说明该ＵＦＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳ代谢轮廓分析方法适于复杂生物样品微量化学成分的分析。图２．２中显示了两种肝胆疾病病人胆汁样品提取物在负离子模式下的总离子流图（负离子流图更加接近ＵＦＬＣ—ＤＡＤ色谱图）。从中可以看出，两种疾病的胆汁样品具有完全不同的代谢轮廓。进一步开展了胆汁样品中胆汁酸的鉴定与归属，表２．２及２．３列出了两种肝胆疾病胆汁样品中分布的９种胆汁酸分布信息，从中可以看出不同疾病的胆汁具有不同的胆汁酸分布情况。在负离子模式下，胆汁样本中的多数成分显示了显著的分子离子峰［Ｍ—Ｈ］．。由于在负离子模式下，中等的ＥＳＩ一级锥体电压可使所有胆汁酸类化合物产生特征分子离子峰，这些可帮助我们确定胆汁酸类化合物的结构归属（负离子流图更加接近ＵＦＬＣ—ＤＡＤ色谱图）。因此，本研究中胆汁中所含胆汁酸成分的鉴定与归属主要依托负离子模式下的质谱信息来完成。表２．２基于ＵＦＬＣ—ＭＳ分析获得的胆结石疾病胆汁化学成分的归属及分布信息Ｔａｂｌｅ２．２ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｈｏｌｅｌｉｔｈｉａｓｉｓｐａｔｉｅｎｔｓｂｙＵＦＬＣ—ＭＳＩｄｅａｆｉｆｉ—ＰｍｄｕｅｔＮｏ．ｔ－‘Ｍ．Ｗ．ｏ嘞０１１●ａ暗ｌｍ７ｚＪ１３４５６７８９１０１１１２１３ｌ２３４５６２．６９８２．８２３５１５４６５４９９４４９４９９４４９眦ＧｃＡ５１４４６４＋＋＋＋＋＋＋＋４－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋３．９６７４．１９４－Ｉ【Ｄｃ＾４９８ａＪＤ（＝＾４４８１Ｄｃ＾４９８ＧＤＣＡ４４８＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋４．１９４４．５２５＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＾ＤＮＯ表２．３基于ＵＦＬＣ—ＭＳ分析获得的胆囊炎疾病胆汁化学成分的归属及分布信息２．７３２６２．８２４．１０５１５’Ｉ℃Ａ４６５ＧＣＡ５１４４６４＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋４－４－＋４－４－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋４－４－＋＋＋４－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＮＤ＋＋＋＋＋＋９６．６７躬３ＧＬｃＡ４３２ＮＤ＋＋４－‘ｔＲ，保留时间（分钟）６Ｍ．Ｗ．，分子量；ＮＤ表示未检测到；＋、＋＋及＋＋＋分别代表微量成分、中等含量成分及高含量成分；。负离子模式下检测。‘ｔＲ，ｒｅｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｒａｉｎ）；“Ｍ．Ｗ．．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ；ＮＤｍｅａｌｌｓｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄ，＋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ＋＋＋ｓｔａｎｄｓｆｏｒａｂｕｎｄａｎｔ；。Ｉｎｎｅｇａｔｉｖｅ—ｉｏｎｍｏｄｅ．ｔｒａｃｅａｍｏｕｎｔ，＋＋ｍｅａ［Ｉｓｍｅｄｉｕｍａｍｏｕｎｔ；ａｎｄ２．２数据分析及结果借助ＵＦＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳ代谢轮廓分析技术从两种肝胆病人胆汁中共发现了９种胆汁１８囱鐾直匡堂睦亟±堑窒生堂焦迨塞！兰塑生２酸（表２．２，表２．３）ｏ本课题应用ＭｉｃｍｍａｓｓＭａｒｋｅｒｌｙｎｘ软件对原始数据进行归一化处理，对处理后的数据应用ＳＰＳＳ统计学软件进行ＰＣＡ分析和ＨＣＡ分析。ＰＣＡ分析图上每一个点代表一个样本，每—个样本的位置有其代谢特点决定，处于相似病理生理状态的样本通常具有相似的组成，因此在图上也处于相似的位置，距离越远表示其病理生理状态差距越大。而ＨＣＡ分析图中每一类样本相似度越大会聚为一类，样本相似度越小，距离越远。从中可以看出：№１一１３胆结石病人聚为一类，而Ｎｏ１４－２０号胆囊炎病人聚为一类。同时本研究也基于两种不同肝脏疾病２０个病例胆汁酸分布信息开展了主成分分析，以期找到对分型影响最大的胆汁酸峰，作为潜在代谢标识物。图２．５是基于主成分的病人样品分类结果，从中可以看出，两种疾病明显的分为两个部分，各自聚为一类。以ＰＣＡ计算这２０例患者胆汁中检测到的９种胆汁酸，得到结果为胆结石患者胆汁中的ＴＣＤＣＡ，ＧＵＤＣＡ，ＧＤＣＡ及胆囊炎患者胆汁中的ＴＤＣＡ，ＧＬＣＡ，ＴＬＣＡ能够解释８８．２％的整体变量信息，所以把它们作为选择的主成分，暗示它们应该为这两种疾病分型的代谢标志物。图２．３基于ＵＦＬＣ／ＭＳ代谢轮廓分析的肝胆疾病关系图Ｆｉｇｕｒｅ２．３ＤｅｎｄｒｏｇｒａｍａｔｔｈｅｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅｂａｓｅｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇＵＦＬＣ／ＭＳｏｎｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｆｉｌｅｓ图２．４基于成分因子对２０个胆汁样品分类图（口）胆囊炎患者胆汁样品（◇）胆结石患者胆汁样品Ｆｉｇｕｒｅ２．４ＴｈｅＰＣＡｐｌｏｔｂａｓｅｄｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ：（口）ｔｈｅｂｉｌｅｓｉｍｐｌｅｏｆｃｈｏｌｅｃｙｓｔｉｔｉｓｐａｔｉｅｎｔ（◇）ｔｈｅｂｉｌｅｓｉｍｐｌｅｏｆｃｈｏｌｅｌｉｔｈｉａｓｉｓｐａｔｉｅｎｔｏｎ１９囱鐾直匿堂医亟±塑壅生堂焦迨塞（兰塑！生２．２．３胆汁酸类代谢标志物的质谱鉴定借助ＵＦＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳ技术从胆结石病人胆汁中中共发现１３个化合物其中鉴定了６个化合物，为６种胆汁酸（详见表２．２），从胆囊炎病人中发现１３个化合物其中鉴定了９种胆汁酸（详见表２．３）。由此可见，胆汁酸类化合物是病人胆汁中的主要成分，因此对胆汁酸类化合物的鉴定及归属是明晰不同肝胆疾病化学成分的关键步骤。通过与标准品保留时间及质谱规律的对比，胆结石病人胆汁样品中显著存在的４个胆汁酸被归属为ＴＣＡ，ＣＣＡ，ＴＣＤＣＡ，ＣＵＤＣＡ，保留时间分别为２．７０，２．８２，３．９７，及４．２０分钟（表２．２）。胆囊炎病人胆汁样品中显著存在３个胆汁酸被归属为ＴＣＡ，ＧＣＡ及ＴＤＣＡ其保留时间分别为２．７０，２．８２及４．１０分钟（表２．３）ｏ通过多种统计分析技术，本课题对上述胆汁酸中对分组有重要贡献的代谢标志物进行了具体分析，经三重四级杆质谱检测，借助标准品来完成（对照色谱保留时间及质谱信息），得到了其中６种代谢标志物（胆汁酸）的精确分子量，并据此推断了其分子式及结构，见表２．４及图２．５。表２．４对分组有贡献的胆汁酸Ｔａｂｌｅ２．４Ａ吼ｍ如诅ｒｙｏｆｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｂｉｌｅａｃｉｄｓＡＢ一．·］ｊｊ—叩一一‘Ｉｉｊ—Ｉ｜：ｊ．－｜．ｊｌ二．一。●１ｌ‘。图２．５两种肝胆疾病病人胆汁中五种重要的胆汁酸（Ａ，ＴＣＡ，ＧＣＡ；Ｂ，ＴＤＣＡ；Ｃ，ＧＤＣＡ，ＧＣＡ；Ｄ，ＧＬＣＡ）Ｆｉｇｕｒｅ２．５Ｎｅｇａｔｉｖｅ·－ｉｏｎＥＳＩ··ＭＳｓｐｅｃｔｒａｏｆｆｉｖｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｉｌｅａｃｉｄｓｆｒｏｍｂｉｌｅｏｆｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅ（Ａ，ＴＣＡ，ＧＣＡ；Ｂ，ＴＤＣＡ：Ｃ，ＧＤＣＡ，ＧＣＡ；Ｄ，ＧＬＣＡ）２０囱蓥查匡兰瞳亟±堑塞生堂焦迨塞！兰Ｑ塑生２．３小结在本章研究中应用胆汁代谢物分析方法分别检测分析了胆囊炎病人７例、胆结石病人１３例，并运用代谢组学研究方法对这２０例胆汁样本所获得的代谢物信息进行了统计学分析，得到以下结果：负离子模式下，胆结石组与胆囊炎组呈现聚类型分布，两组之问未见任何交叉与重叠得到了有效的分离；ＰＣＡ和ＨＣＡ两种方法对结果的判断分析基本一致，ＰＣＡ分离效果更好。通过两种软件作出的分析结果，本课题对位两组分离贡献作出的胆汁酸进一步分析，经ＥＳＩ—ＭＳ检测，得到其精确的分子量，并据此推断了其可能的分子式及结构。本研究所建立的代谢组学方法应用于两种重大肝脏疾病的分型，比较了不同疾病胆汁中的胆汁酸浓度及种类的分布差异，实现了两种疾病的有效区分，初步发现与疾病诊断、治疗相关的代谢标记物，为两种疾病的分型、诊断、治疗打下基础。第三部分ＵＦＬＣ—ＭＳ血浆分析方法的建立及其在疾病分析中的应用．本章开展了血浆的ＵＦＬＣ—ＭＳ代谢轮廓分析（图３．１）。由于伦理的原因，我们不能取得正常人及大量取得不同肝胆疾病的胆汁样本，而且取得血浆的方法简单，成本低廉，所以建立ＵＦＬＣ—ＭＳ血浆分析方法是十分必要的。与胆汁中成分相比，血浆中成分更为复杂，即血浆样本具有相对复杂的代谢轮廓。由于血浆中含有大量不同的酶类、蛋白及微量的胆红素等成分，所以对其前处理要更加严谨口Ｌ剐。针对血浆成分复杂且多为微量成分等特点，本章初步开发了适于血浆样品的前处理及ＵＦＬＣ—ＭＳ代谢轮廓分析方法，并采用该方法系统考察了不同疾病病人血浆中的化学组成。表３．１Ｔａｂｌｅ３．１ＵＦＬＣ—ＭＳ疾病分析所用的８个病人血浆样品ＡｓｕＩｎｌｌｌ８Ｉ）ｒｏｆｐｌａｓｍａｓａｍｐｌｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ２１内蒙古医学院硕士研究生学位论文（２００９年）１实验材料与方法１．１仪器与试剂本研究使用的仪器与试剂与２．２．１相同１．２样品信息及制备不同疾病的样本信息见表３．１样品前处理方式：将血浆样本室温解冻取适量加入９倍体积的甲醇，旋涡混合器振荡、混合均匀，１４０００ｒｐｍ离心１０ｒａｉｎ，取上清液即为供试样品溶液。１．３不同疾病血清的Ｕｂ＇ＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳ代谢轮廓分析方法本研究采用的代谢轮廓分析方法同２．２．３。２结果与讨论２．１不同肝胆疾病血浆的代谢轮廓分析图４．１中显示了两种肝胆疾病病人血浆样品在负离子模式下的总离子流图。从中可以看出，两种疾病的血浆样品具有不完全相同的代谢轮廓ｏＡＢ图３．１病人血浆总离子流图（八胆结石病人血浆；Ｂ，胆囊炎病人血浆）Ｆｉｇｕｒｅ３．１Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｔｏｔａｌｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）ｏｆｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙｄｉｓｅａｓｅｐｌａｓｍａ（Ａ，ｐｌａｓｍａｏｆｃｈｏｌｅｌｉｔｈｉａｓｉｓｐａｔｉｅｎｔ；Ｂ，ｐｌａｓｍａｏｆｃｈｏｌｅｃｙｓｔｉｔｉｓｐａｔｉｅｎｔ）对两种疾病病人的胆汁和血浆样本比较后发现，胆汁中的胆汁酸种类和浓度明显多于血浆中的胆汁酸种类和浓度，这可能是由于胆汁酸是由肝脏合成并形成肝肠循环，在疾病的程度未达到严重时，在血中只是微量存在。但是，在血浆中发现许多胆结石及胆囊炎患者血浆中共有的物质，如ｍ／ｚ为２８１，３７９及２５５，３５３的物质，对这类物质的鉴２２凼鏊查匡堂眭亟±班塞垒堂焦迨塞（兰Ｑ塑生２定，仍需进一步的实验研究ｏ３小结本研究利用已建立的复杂样品代谢轮廓分析的超高效液相一电喷雾质谱（ＵＦＬＧ—ＥＳＩ—ＭＳ）方法。利用该轮廓分析方法系统考察了不同肝胆疾病血浆代谢物的分布情况。通过对８例不同肝胆疾病病人血浆样品的分析发现，两种疾病的血浆样品具有不完全相同的代谢轮廓，同种病人血浆与胆汁比较，发现血浆中胆汁酸的种类及含量远远低于胆汁中的胆汁酸种类及含量。第四部分结论与展望１结论胆汁酸的生物合成是以胆固醇为原料在肝脏中合成，是人体中重要的内源性物质，它反映了人体胆固醇类物质的代谢路径，从而反映了动物及人体的肝胆状况。本研究针对生物样品的特殊性，运用代谢组学的研究方法建立了ＵＦＬＣ—ＤＡＤ及ＵＦＬＣ—ＭＳ两种不同的分析方法并应用于胆汁酸种属差异研究及胆汁及血清中代谢物分析，并基于不同肝胆疾病的胆汁酸化学分布差异开展了疾病分型研究。得到以下结果：建立了复杂生物样品的代谢指纹分析方法并将其用于不同种属胆汁酸分布差异的考察。首先基于代谢指纹相似性对比了不同种属胆汁样品，借助主成分分析提取了胆汁中分布的１２个特征标记物，进而基于特征代谢物的分布相似性开展了针对胆汁酸的种属差异研究且获得了种间界限清晰的分类结果。建立适于复杂样品的ＵＦＬＣ—ＭＳ代谢轮廓分析方法，该方法具有快速、灵敏及分离度高等优点。通过胆结石及胆囊炎病人胆汁的代谢组学对比研究发现，２０个病人病例中鉴定出９种胆汁酸类化合物，且发现不同疾病来源的生物样品具有不同的代谢轮廓，提示不同的肝胆疾病中存在不同的代谢框架。运用代谢组学的研究方法进一步分析了对两组分离做出较大贡献的六种胆汁酸，应用质谱技术得到其精确分子量并推测其可能的分子式及结构。对两组疾病血浆中含量变化较大的其他代谢物，本课题也进行了初步的分析，为下一步的结构鉴定奠定了基础。综上所述，应用本课题工作建立两种代谢组学方法，对胆汁酸的种属差异及疾病分型进行了代谢组学研究，取得了预期的效果，为下一步的研究奠定了基础。我们相信随２３内蒙古医学院硕士研究生学位论文（２００９年）着代谢组学的深入，胆汁酸代谢它必将在疾病诊断以及药物开发等领域发挥更大的作用。２后续工作建议本研究所鉴定出的生物标志物需要通过更多的病例分析以进一步确认，重要的是对病人胆汁、血浆及尿液的代谢物进行监测，尤其是对血浆样品的代谢组学分析，对其中含有的化合物通过查阅文献及实验进行鉴定，并需要深入探讨其相应的生物反应途径。胆汁酸类代谢产物种类及数量繁多，且这些化合物的结构差异很大。因此单单基于ＬＣ—ＭＳ技术无法实现胆汁酸合成过程的全监测。未来应采用不同的分析技术如Ｃ，Ｃ—ＭＳ、ＮＭＲ方法等，相互映证，得到更为全面的认识和结论。生物体系复杂，胆汁酸的分布及含量对外界干扰的敏感性差，未来可结合动物细胞培养等技术开展胆汁酸代谢组学研究及代谢物的动态监测。３参考文献［１】ＡｇｅｌｌｏｎＬＢ，ＴｏｒｃｈｉａＥＣ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２０００，１４８６：１９８—２０９，ＹＷａｎｇ，ＰＪＨ．Ｊｏｎｅｓ，ＬＡＷｏｏｌｅｔ，ｅｔａ１．ＴｒａｍＲｅｓ，２００６，１４８：３７－４４［２】ＹＷａｎｇ，ＰＪＨ．Ｊｏｎｅｓ，ＬＡＷｏｏｌｅｔ，ｅｔａ１．ＴｒａｍＲｅｓ，２００６，１４８：３７－４４Ｍ，ＢａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎＮ，ＭａｋｉｓｈｉｍａＭ，ｅｔａ１．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００１，２７６：２８８５７［３］ＡｎａｎｔｌＩａｎａｒａｙｓｎａｎ．．２８８６５［４］Ｐａｒｋｓ［５］ＲｏｓｓｉＤＪ，ＢｌａｎｃｈａｒｄＳＧ，ＢｌｃｄｓｏｅＲＫ，ｅｔａ１．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４：１３６５—１３６８ＣＳＳ，ＨｏｆｒａａｎｎＪＬ，Ａ．Ｆ．ＪＬｉｐｉｄＲｅｓ，１９８７，２８：５８９—５９５Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｎｏｔｅ，２００５，５９８９—５９０８ＥＮａ１．Ａ［６］Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．Ａｇｉｌｅｎｔ［７］ＰｌｕｍｂＢＳ。Ｇｒａｎｇｅｒｍ，ＳｔｕｍｐｆＣＬ，ｅｔｒａｐｉｄ鲫傥ｎｉｎｇａｐｐｒｏａｃｈｔＯｍｅｍｂｏｎｏｍｉｃｓｕｓｉｎｇＵＰ·ＬＣａｎｄＯａ—ＴＯＦｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏａｇｅ，ｇｅｎｄｅｒａｎｄｄｉｕｒｎａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｎｏｒｍａｌ／ＺｕｃｋｅｒｏＪ）ｅｓｅｒａｔｓａｎｄｂｌａｃｋ，ｗｈｉｔｅａｎｄｎｕｄｅｍｉｃｅ．Ａｎａｌｙｓｔ，２００５，１３０（６）：８４４－９Ｏｎ［８］ＹｉｎＰ，ＺｈａｏＸ，ＬｉＱ，ｅｔａ１．ＭｅｔａｂｏｎｏｍｌｃｓｓｔｕｄｙｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｆｉｓｕｔｈｓｂａｓｅｄｕｌｔｒａｐｅｆｆｏｒｍａｎｅｅＰｒｏｔｅｏｍｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈＱ—ＴＯＦｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ｖＰＬｃ／Ｑ－ＴＯＦＭＳ）．ＪＲｅｓ，２００６，５（９）：２１３５－４３［９］Ｙｕ—ａＫ，ＬｉｔｔｌｅＤ。ＰｌｕｍｂＲ，ｅｔａ１．Ｈｉ【出一ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒａｄｒｕｇｍｉｘｔｕｒｅｉｎｒａｔｐｌａｓｍａｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍｍａｒｌ８ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｗｉｔｈｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍ脚ｔａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ，２００６，２０（４）：５４４—５２［１０：ＷａｇｎｅｒＳ，ＳｃｈｏｌｚＫ，ＳｉｅｂｅｒＭ，ｅｔａ１．Ｔｏｏｌｓｉｎｍｅｍｂｏｎｏｍｉｅｓ：ａｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒＬＣ—ＭＳｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｍｅｒｃａｐｔｕｒｉｃａｃｉｄｓｉｎｈｕｍａｎｕｒｉｎｅ．ＡｎａｌＣｈｅｍ．２００７，７９２４痊蓥直匿堂医堕主受塞生堂焦迨塞（圣塑生２（７）：２９１８２２９２６１［Ｉ１］ＨｏｌｍｅｓＥ，Ａ丑ｔｔｉＨ．ＣｈｅｍｏｍｅｔｒｉｅｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｔＯｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｅｓ：ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌｓｏｌｕｔｉｏｎｓｔｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｉｎｇａｎｄｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＮＭＲｓｐｅｃｔｒａ．Ａｎａｌｙｓｔ，２００２，１２７（１２）：１５４９—１５５７［１２］ＫｅｕａＨＣ，ＥｂｂｅｌｓＴＭＤ，ＢｏｔｌａｒｄＭＥ，ｅｔａ１．Ｇｅｏｍｅｔｒｉｅｔｒａｊｅｅｔｏｒｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ锄ｄｅｆｉｎｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｆｉｌｅｓ．ＣｈｅｍＲｅｓＴｏｘｉｅｏｌ，２００４，１７（５）：５７９—５８７［１３］ＷｅｌｊｉｅＡＭ，ＮｅｗｔｏｎＪ，ＭｅｒｃｉｅｒＰ，ｅｔａ１．ＴａｒｇｅｔｅｄＰｆｏｌｄｉｎｇ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＨ—ＮＭＲｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓｄａｔａ．ＡｎａｌＣｈｅｍ，２００６，７８（１３）：“３０－４４４２［１４］ＴｅｓｓｉｅｒＥ，ＮｅｉｒｉｎｅｋＬ，Ｚｈｕｚ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢ，２００３，７９８：２９５—３０２［１５］ＢｕｒｋａｎｔＩＥ，ＲｅｎｔｓｃｈＡ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢ，２００５，８２６：１４７—１５９［１６］ＭａｓｓａｒｔＢ，ＧｕｏＱ，ＱｕｅｓｔｉｅｒＦ，ｅｔａ１．Ｄａｔａｓｔｒｕｃ缸ｊｔｒｅｓａｎｄｄａｔａｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｆｏｒｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇｃｈｅｍｉｃａｌｄａｔａ．ＴｒｅｎｄｓＡｎａｌ［１７］协Ｒ．ＭｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅＣｈｅｍ，２００１，２０：３５－４１ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄｄａｔａ：ｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ．知ｌａｌＣｈｉｍＡｃｔａ，２００４，５２７：４５－５１［１８］ＤＩｌｄａＲ０，ＨａｒｔＰＥ，ＰａｕｅｍＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＳｃｅｎｅＡｎａｌｙｓｉｓ．ＷｉｌｅｙＴｏｒｏｎｉｏ，１９７３［１９］ｓｅ晒∞Ｔｈｅｏｄｏｒｉｄｉｓ，ＫｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｓＫｏｕｔｒｏｕｍｂａｓ，ＰａｔｔｅｍＲｅｅｏｇｎｉｔｉｏｎ（ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ）．北京：机械工业出版社，２００３。１６３［２０］ⅥｚＢ，ＹｕＹ，ＩＡａｎｇＹｚ，ｅｔａ１．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｆｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｍｏｄｅｏｆｂｅｒｂｅｒｉｎｅｂｙＩ．￡／ＥＳＩ—ＭＳｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ．ＪＰｈａｒｍＢｉｏｍｅｄＡｎａｌ，２００７．４４：３０１—３０４［２ｔ】ＤｒｅａｓｓｉＥ，ＺｉｚｚａｒｉＡＴ，ＡｒｅｚｍＳＤ。ｅｔｅ１．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｕａｚａｔｉｎｅｍｉｘｔｕｒｅｂｙＬｃａｎｄＬＣ—ＭＳａｎｄａｎｔｉｍｙｃｏｆｉｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．ＪＰｈａｒｍＢｉｏｍｏｄＡｎａｌ，２００７，４３：１４９９一１５０６［２２］ＷｉｎｋＭ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｆｒｏｍ皿ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｐｅｒ－ｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，“：３一１９［２３］ＮｙｍａｎＴ，Ｊｕｌｋｕｎｅｎ—ＴｉｉｔｔｏＲ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎａｎｄａｍｏｎｇｓｉｘｎｏｔ＇ｔｈｅｍｗｉｌｌｏｗｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｈｙｔｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，６６：２８３６—４３［Ｍ］ＶａｎＥｒｐｅｅｕｍＫＪ，ＶａｎＢｅｉｇｅＨｅｎｅｇｏｕｗｅｎＧｐ啦ｏｆＰ，ＤｉｇｅｓｔＬｉｖｅｒＤｉｓ，２００３，３５：８一ｌｌ［２５］ｈｌａｇ如Ｓ，ＮｏｄａＴ，ＭｉｎＪＺ，ｅｔａ１．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｒａｔｈａｉｒａｎｄ∞碳：ｎｉⅡｇｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｕｓｉｎｇ１１１吨ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｌｉｍｅ—ｏｆ—ｆｌｉｇｈｔ皿腿ｓｐｅｅ·ｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＪＣｈｍｍａｍｇｒＡ，２００７。１１７６：９４—９９［２６］ｕＬ，ＰａｂｂｉｓｅｔｔｙＤ，ＣａｒｖａｌｈｏＰ。ｅｔａ１．Ｕｌｔｒａ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｉｎｒａｔｓｅｎｌｍａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｐｈａｒ－ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢ，２００８，８６７：１３１—１３７２５囱鐾直匡堂医亟±受塞生堂垡迨塞（三塑生２［２７］ＤａｎＭ，ＳｕＭ，ＧａｏＸ，ｅｔａ１．ＭｅｔａｂｏｌｉｔｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆＰａｎａｘｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇｕｓｉｎｇＵＰＬＣ—ＥＳＩ—ＭＳ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，６９：２２３７—２２“［２８］ＸｉｎＬａ，ＸｉｎｊｉｅＺｈａｏ，ＣｈａｎｇｍｉｎＢａｉ，ｅｔａ１．ＬＣ—ＭＳ—ｂａｓｅｄｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓ．ＪＣｈｒｏｍａ－ｔｏｇｒＢ，２００８，８６６：６４－７６［２９］ＢｈｙＰＩｇＳ，ＴｈｉｂａｕｈＰ，ＴｈｉｈｅｒｇｅＮ，ｅｔａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔａｘｏｌａｎｄ咒铡ｔａⅪｍ船ｆｒｏｍｏｒｔａｘｕｓｃａｎａ－ｄｅｎｓｉｓｕｓｉｎｇｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｎ蛆嘲ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｔｒｙ．ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎＭａｓｓＳｐｅｃ缸Ｄｍ，１９９３，７：６２６—６３４ｔａｎｄｅｍｍ麟８ｐｅｃｔｌ＂ｏｍｅ—［３０］ＫｅｒｎｓＥＨ，ＶｏｌｋⅪ，眦ＳＥ，ｅｔ８ｔｒｕｃｎｌ】ｆａｌａｎａｌｙｓｉｓａ１．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ删ｔａｘａｌｌｅｓｍｉｎｇＬＣＪＭＳａｎｄ咄ｈＩｓ／ＭＳｓｕｂ－ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎＭａｓｓＳｐｅｅｔｒｏｍ，１９９５，９：１５３９－４５［３１］ＲｏｙｅｒＩ，ＡｌｖｉｎｅｒｉｅＰ，ＷｒｉｇｈｔＭ，ｅｔａ１．Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎｈｕｍａｎｐｌａｓｍａａｎｄｕｌ＇ｉｎｅ．，Ｉｄｅｎ－ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ６一ｈｙｄｒｏｘｙｔａｘｏｌ，７一ｅｐｉｔａｘｏｌａｎｄｔａｘｏｌｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｐｒｏｄｕｃｔｓｕｓｉＩｌｇｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ－ｐｈｙ／ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ—ｐｒｅｓｓｕｒｅｃｈｅｍｉｃａｌｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔｒｏｍ，１９９５，９：４９５—５０２ｍ躐ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＲａｐｉｄＣｏｍｍｕｎＭａｓｓＳｐｅｃ·［３２］ＭａｄｈｕｓｕｄａｎａｎＫＰ，ＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙＳＫ，ＴｒｉｐａｔｈｉＶ，ＳａｓｈｉｄｈａｒａＩＧｒ，ＫｕｍａｒＳ．ＭＳ／ＭＳｐｒｏｒａｉｎｇｏｆｔａｘｏｉｄｓｆｒｏｍｔｈｅｎｅｅｄｌｅｓｏｆＴａｘｕｓｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ．ＰｈｙｔｏｅｈｅｍＡｎａｌ，２００２．１３：１８—３０［３３］ＶａｉｎｃｈｔｅｉｎＬＤ，ＴｈｉｊｓｓｅｎＢ，ＳｔｏｋｖｉＥＳ，ｅｔａ１．ＡｓｉｍｐｌｅａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｎＭ喀ｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐａｃｌｉｔａｘｅｌａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎｈｕｍａｎｐｌａｓｍａｕｓｉｎｇｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔａｎｄｅｍｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＢｉｏｍｅｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ，２００６，２０：１３９—１４８［３４］ＣｈｕｒｃｈｗｅｉｌＭＩ，ＴｗａｄｄｌｅＮＣ，ＭｅｅｋｅｒＬＲ，ｅｔａ１．ＪＣｈｍｍａｔｏｇＢ。２００５，８２５：１３４—１４３ａ１．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｂｉｌｅａｃｉｄｓｉｎｈｕｍａｎｓｅｒｕｍｂｙＯｎ［３５］Ｋ．Ｂｅｎｔａｙｅｂ，Ｒ．Ｂａｆｆｌｅ，Ｃ．Ｓ’ａｎｃｈｅｚ，ｅｔ—ｌｉｎｅｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄａｃｃｅ路ｍａｔｅｒｉａｌ—ｕｌｔｒａｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ一ⅡＩ鹪８ｓｐｅｃ·ｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ。２００８，８６９：ｌ一８［３６］ＭａｓａｙｕｋｉＡｎｄｏ，ＴｏｈｍＫａｎｅｋｏ，ＲｉｔｓｕｋｏＷａｔａｎａｂｅ，ｅｔａ１．ＨｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒａｔｓｅｒｕｎｌｎＭ略ｓｂｉｌｅａｃｉｄｓｂｙｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｔａｎｄｅｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ，２００６，４０：１１７９一ｌ１８６ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ２６文献综述代谢组学及胆汁酸代谢研究进展摘要本文对代谢组学的研究进展及其在胆汁酸代谢分析上的应用做了综述。关键词代谢组学胆汁酸代谢分析ｌ代谢组学研究方法近年来，以基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学为代表的系统生物学迅猛发展，研究者逐渐转变传统的研究思路，开始从生物系统的整体性分析人手，探索疾病早期诊断理论和方法学的新途径。从代谢物分析角度去有针对性地研究疾病的发生、发展及其所引发的一些代谢性疾病病理过程的代谢产物中的共性以及特异性指标，寻找特异性生物标志物（ｂｉｏ—ｍａｒｋｅｒ），对于疾病及其引发的代谢性疾病发病机制的研究、早期诊断、预防和药物干预评价将可能产生突破性的成果。代谢组学（ｍｅ￡ａｂｌｏｒｎｊｃ＆／础蝴ｏⅡｌｉｃｓ）是上世纪９０年代中期发展起来的一门对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的一门新学科。它是通过考察生物体系受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后）其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的代谢途径的一种技术【１１；它所关注的是相对分子质量为１０００以下的小分子。作为崭新的方法学，代谢组学已成为国际上疾病与健康研究的一个重要热点。根据研究的对象和目的的不同，Ｆｉｅｈｎ等【２１将代谢组学分为４个层次，即：１）代谢物靶标分析（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｓｉｓ），２）代谢轮廓（谱）分析（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ－ａｎａｌｙｓｉｓ），３）代谢组学（ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｅｓ），４）代谢指纹分析（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｍｇａｎａｌｙｓｉｓ，ｏ目前，对代谢组全面的分析如何进行描述有两种不同的看法。有人采用”ｍｅｔａｂｏｌｏ－－ｍｉｃｓ”一词，而另外一些人采用”ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ”一词。有人认为可用分析时所采用的技术平台来区分代谢组的全面分析技术【３】。Ｆｉｅｈｎ认为代谢组学是指对代谢组的全面分析，¨ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ”应该属于代谢指纹分析更合适。不管是何种技术，Ｓｕｍｎｅｒ等［３１认为为了与ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ、ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ相一致，应该采用”ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ¨一词来描述对代谢组的全面分析较为合适。２７直鐾直匿堂堕亟圭班蕉垒堂焦迨塞ｆ２塑！笙２代谢组学相关研究可追溯到始于上世纪７０年代，Ｂａｙｌｏｒ医学院发表了有关代谢谱分析方面的论文【４】，开创了对复杂样品进行代谢谱分析的先河。此后，代谢谱分析技术广泛用于病人血和尿等样品中化合物的定性和定量分析，以对疾病进行筛选和诊断∞Ｊ。这种在临床上利用气相色谱和质谱联用仪（ＧＣ／ＭＳ）分析来诊断有关的疾病的方法一直延用至今。进入的８０年代，人们开始应用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）和ＮＭＲ技术来进行代谢谱分析工作。进入９０年代后，代谢谱分析技术一直平稳地发展，但这阶段人们研究的目标更加集中在诸如药物在人体内的代谢等方面口】。１９９７年，Ｓｔｅｈｖｅｎｏｈｖｅｒ小组提出了通过对代谢产物的数量和质量性分析来评估酵母基因的遗传功能及其冗余度的必要性，并率先提出了代谢组学的概念【６】。接着德国ＭａｘＰｌａｎｃｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅ的科学家开始了植物代谢组学的研究１３ｊｏ代谢组学技术作为一种基因功能研究的新技术就这样正式登台了。代谢组学研究一般包括代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标记物识别和途径分析等步骤。生物样品（如尿液、血液、组织、细胞和培养液等）采集后进行生物反应灭活、预处理。运用核磁共振、质谱或色谱等检测其中代谢物的种类、含量、状态及其变化，得到代谢谱或代谢指纹，而后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘，并研究相关代谢物变化涉及的代谢途径和变化规律，以阐述生物体对相应刺激的响应机制、发现生物标记物。代谢组学研究在整个样品处理和分析过程中，应尽可能保留和体现样品中代谢物的信息，生物样品的收集、灭活、储存、处理、仪器分析和数据处理等环节的标准化问题已越来越引起研究者的重视¨叫。图１代谢组学研究的技术路线Ｆｉｇｕｒｅ１ｔｈｅｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｌａｒｇｅｓｃａｌｅｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓｒｅｓｅａｒｃｈ２８凼蓥直匡堂医亟±堡塞生堂焦迨塞（！塑生２（１）样品的制备样品的制备包括样品的提取和预处理。代谢产物通常用水或有机溶剂（如甲醇、己烷等）分别提取，以分别获得水提取物和有机溶剂提取物，从而把非极性的亲脂相和极性相分开，以便分别进行分析。分析之前，常先用固相微萃取，固相萃取，亲和色谱等预处理ｏ（２）完成样本的采集和预处理后，样品中的代谢产物需通过合适的方法进行测定。代谢组学分析方法要求具有高灵敏度、高通量和无偏向性的特点，由于代谢产物和生物体系的复杂性，至今为止，尚无一种能满足上述所有要求的代谢组学分析技术，现有的分析技术都有各自的优势和适用范围ｎｏ‘１引。最好采用联用技术和多种方法综合分析。色谱‘１５１、质谱‘１０１、ＮＭＲｌｌ６１、毛细管电泳Ｄｖ，ｘｓｌ、红外光谱［１９，２０】、电化学检测‘２１３等分离分析手段及其组合都出现在代谢组学的研究中。分离技术同检测及鉴定技术的不同组合就构成了各种主要的代谢组分析技术（表１中的组合）ｏ各种代谢组分析技术有各自的特点和用途。目前，代谢组分析技术中最常用的还是要数气相色谱和质谱联用仪（ＧＣ／ＭＳ），液相色谱和质谱联用仪（ＬＣ／ＭＳ），毛细管电泳和质谱联用仪（ＣＥ／ＭＳ）以及核磁共振（ＮＭＲ）。液相色谱和质谱联用仪（ＬＣ／ＭＳ）又名高效液相色谱和质谱联用仪（ｈｉｇｈｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｍａｓｓｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＨＰＬＣ／ＭＳ）ｏ此法用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）来对样品进行分部分离，它除了分析之前样品不经过衍生化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）处理外，其原理与Ｃ，ＣｙＭＳ相似。为了区分异构体，有关代谢产物用ＬＣ进行纯化并分部收集后，须再用核磁共振进行结构解析。此法适合那些不稳定、不易衍生化、不易挥发或分子量较大的化合物。ＬＣ／ＭＳ与ＧＣ／ＭＳ选择性和灵敏度都较好，但分析的时间相对较长。核磁共振是上世纪６０年代末发展出的分析技术。ＮＭＲ核磁共振可以检测和定量许多低分子量的代谢产物，并可以用于结构的测定。ＮＭＲ快速、选择性好。ＮＭＲ的优点还在于它与ｎＩＲ一样，不会对所分析的样品造成破坏。但其灵敏度比ＭＳ差，不适合于痕量化合物的鉴定Ｃ２］。在选择代谢组分析方法时，如何选择适当的方法是大家所面临的一个共同的问题。其原则是要同时考虑仪器和技术的检测速度、选择性和灵敏度，以选择出一种最适合目标化合物的分析方法。２９表１代谢组学分析技术ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｍｅｍｂｏｌｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒＣ，ＣＣＦ＿／ＭＳＧｃ／ｗＭＳ．．．ＨＰＬＣ／ＭＳＣＦＪＭＳＩ－ＩＰＬＣ／ＭＳ／Ｍ￥ＬＣ／ＮＭＩ。＇ＭＳ／ＭＳ附一潞ＩＲｍＵＶ【（’／０／／】眦‰一：一ＣＥ／ＥＩＦＮＭＲ肌Ｃ／ＮＭＲＥＣＤｂｌａｎｋ（３）数据处理数据预处理方法：由上述分析仪器导出的源数据（ｍｅｔａｄａｔａ），不能直接用于模式识别分析，还需对数据进行预处理，将源数据转变为适合于多变量分析（主要是模式识别Ｊ的数据形式。主要的数据预处理包括滤噪、重叠峰解析（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）、峰对齐、峰匹配、标准化和归一化等。在实际操作中，并不是这些步骤都需要进行，而是根据实际情况．只做几种预处理。广泛应用的滤噪技术是正交信号校正技术（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｒｅｃｔｉｏｎ。ｏｓｃ）‘２２·圳。ｓｉｓｎａｔｃｏｔ－代谢组学研究需要储存、重新获取和分析海量的数据。目前数据分析的主要技术有寻找模式的非监督方法（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｍｅｔｈｏｄ），监督方法（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄｍｅｔｈｏｄ）和基于理论的系统鉴定法（ｓｙｓｔｅｍｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＣＡ）、蝴分析（ｐｍｉｐａｌｂａｓｅｄ０１１ｔｈｅｏｒｙ）这几类。非监督方法有聚类分析（ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓ，ｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）和自组织图（ｓｅｌｆ－ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇｍａｐｓ，ＳＯＭｓ）ｆｕｎｃｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌ等；监督方法有辨别式功能分析（ｄｉｓｅｒｉｍｉｎａｎｔ（ｃｈｅｍｉｃａｌｋｉｎｅｔｉｃｓ），代谢控制分析（ｍｅｔａｌｌｉｃａｎａｌｙｓｉｓ，ＤＦＡ）；统鉴定法有化学动力学ａｎａｌｙｓｉｓ）等ｏ３０直鐾直匿堂医壁±堑壅生堂焦迨窒（兰塑生上２胆汁酸代谢研究进展２．１胆汁酸分类及合成正常人胆汁中的胆汁酸按结构可分为两大类：一类为游离型胆汁酸（ｆｒｅｅｂｉｌｅａｃｉｄ），包括胆酸（ｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＣＡ）、去氧胆酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＤＣＡ）、鹅去氧胆酸（ｃｈｅｎｏｄｅ—ｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＣＤＣＡ）和少量的石胆酸（１ｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＬＣＡ）；另一类是游离胆汁酸与ｂｉｌｅ甘氨酸或牛磺酸结合的产物，称结合型胆汁酸（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｃｉｄ），主要包括甘氨胆酸（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｅａｃｉｄ，ＧＣＡ）、甘氨鹅去氧胆酸（ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＧＣＤＣＡ）、牛磺胆酸（ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｅａｃｉｄ，ＴＣＡ）及牛磺鹅去氧胆酸（ｔａｕｒｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＴＣＤＣＡ）等。从来源上可分为初级胆汁酸（ｐｒｉｍａｒｙｂｉｌｅａｃｉｄｓ）和次级胆汁酸（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｂｉｌｅａｃｉｄｓ）ｏ肝细胞内以胆固醇为原料直接合成的胆汁酸称为初级胆汁酸，包括胆酸和鹅去氧胆酸。初级胆汁酸在肠道中受细菌作用，进行２７位脱羟基生成的胆汁酸，称为次级胆汁酸，包括去氧胆酸和石胆酸。胆汁酸为双亲性分子，其环戊烷多氢菲核Ｑ侧的羟基（一ＯＨ）、羧基（一ＣＯＯＨ）、磺酰基（一ＳＯ，Ｈ）是亲水性基团，Ｂ侧的甲基（一ＣＨ，）、烃核是疏水性基团。因此胆汁酸又可以分为亲水性胆汁酸（ｈｙｄｍｐｈｉｌｉｃ（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｂｉｌｅｂｉｌｅａｃｉｄｓ）和疏水性胆汁酸ａｃｉｄｓ）‘２４１。胆汁酸合成主要有两种合成途径：一为经典途径（中性途径），在限速酶胆固醇７ａ一羟化酶（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ７０ｒ—ｈｙ妇）咖，ＣＹＰＴＡｌ）的催化下，肝细胞内胆固醇转化为７ａ一羟胆固醇。而后经过固醇核的还原、羟化、侧链的断裂和加辅酶Ａ等多步反应，最后生成具有２４碳的初级胆汁酸，主要是胆酸（ＣＡ）和去氧胆酸（ＤＣＡ）以及其与甘氨酸和牛磺酸结合形成的结合胆汁酸。另一途径为替代途径（酸性途径），其第一步反应由限速酶２７ｅｔ一羟化酶（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ２７０ｔ—ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ＣＹＰ２７Ａ１）催化，把胆固醇转化为”一羟化胆固醇。２．２胆汁酸分泌及吸收胆汁酸的分泌是一个复杂的过程。肝细胞基侧膜通过依赖牛磺胆酸共转运体（ＮＴ－ＣＰ）将结合胆汁酸盐重吸收肝细胞这部分胆汁酸与肝细胞内新合成的初级胆汁酸在肝细胞毛细胆管膜一系列转运蛋白（主要是ＡＢＣ—ＡＴＰ结合的蛋白质超家族蛋白以及一种ＡＴＰ酶ＨＣｌ）的作用下，克服浓度梯度差，以胆盐形式进入毛细胆管。这个过程包括：①胆汁内成分通过肝细胞面向肝窦基膜和侧膜进入肝细胞。②在肝细胞内将相关物质输送到毛细胆管。③毛细胆管腔膜的转运体，将有关物质排入管腔（图２）‘冽。３１直鐾直匿芏壁亟±堑塞垒芏堡垒塞ｆ２Ｑ塑生２图２肝细胞膜和小胆管膜的主要转运分子Ｆｉｇｕｒｅ２ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｉｎｌｉｖｅｒｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ肠道中的各种胆汁酸平均有９５ｑｏ被肠壁重吸收。由肠道重吸收的胆汁酸（包括初级和次级胆汁酸；结合型和游离型胆汁酸）均由门静脉进入肝脏，在肝脏中游离蛩胆汁酸再转变为结合型胆汁酸，再随胆汁排人肠腔。此过程称为”胆汁酸的肠肝循环”。正常人每天产生胆计酸约０２—０６９，肝胆的胆汁酸池共约３—５９，这些胆汁酸即使全部倾人小肠也难满足饱餐后小肠内脂类乳化的需要。因此，肠肝循环可以补充肝合成胆汁酸能力不足和人体对胆汁酸的生理需要。人体每天约进行４—１２次肠肝循环，每餐后约２—３次，从肠道吸收的胆汁酸总量可达１２—２４９／ｄ（３０—６０衄ｏｌ／ｄ）。正常人肝脏每小时约可重吸收１８９（４５０１９ｎ０１）的胆汁酸胆汁酸在肠中通过两种机制被机体重新吸收：（１）主动运输：主要发生在回肠远端。在回肠远端，所有类型的胆汁酸都通过这一机制进行运输，但速率不同．主要取央于羟基的数目，以及胆汁酸分子是结合态还是游离态。羟基数目多．且为游离态的胆汁酸易被吸收．如胆酸；（２）被动运输：主要发生在３２囱鐾直匡堂医亟主婴窒垒堂焦迨塞（兰Ｑ塑至２小肠和结肠。这种被动的、选择性的重吸收速率取决于胆汁酸的离子化程度及极性。未结合的胆汁酸和二羟基胆汁酸的甘氨酸结合物（以非离子化的形式存在），也通过简单扩散的方式被重吸收。这种通过小肠膜的非离子化扩散可在小肠的任何部位及结肠发生。胆汁酸在肠道的重吸收主要依靠主动重吸收方式汹】ｏ石胆酸及其复合物可溶性差，因而大部分不被吸收而排出。胆汁酸重吸收入血液后，和白蛋白或ＨＤＬ结合，由门静脉进入肝脏。在肝细胞基底膜上有Ｎａ＋依赖性的牛磺酸／钠共同转运蛋白，这是主要的胆盐摄取系统。参与肝细胞基底侧膜钠离子依赖性胆盐摄取的另一个蛋白是微粒体环氧化物水解酶（ｍＥＨ），其作用仍在进一步研究中。非Ｎａ＋依赖的胆盐转运与№＋依赖的胆盐摄取不同，并非单一的转运蛋白在起作用。目前已经证实它由数个系统协同构成，因此命名为”多特异性胆酸转运蛋白”，其中包括ＢＳＰ／胆红素结合蛋白，有机阴离子结合蛋白（ＯＡＢＰ）以及自血窦摄取胆红素的胆红素转运酶（ｂｉｌｉ—ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ，ＢＴＬ）ｏ胆汁酸被肝细胞重吸收后，与胞质液蛋白结合降低胆盐的潜在毒性。研究表明，蛋白结合胆盐向毛细胆管膜的运输主要是通过快速扩散完成的，胆盐与蛋白结合后由脂性囊泡沿微管运送至毛细胆管膜面而排出。最近也有研究表明尚有另一途径，系直接从高尔基体运送至毛细胆管膜，有关的转运蛋白可能有多耐药糖蛋白ＭＤＲｌ，ＭＲＰ２等Ⅲ】ｏ２．３胆汁酸功能胆汁酸分子内既含有亲水性的羟基及羧基或磺酸基，又含有疏水性烃核和甲基。亲水基团均为ｄ型，而甲基为Ｐ型，两类不同性质的基团恰位于环戊烷多氢菲核的两侧，使胆汁酸构型上具有亲水和疏水的两个侧面。胆汁酸具有较强的界面活性，能降低油水两相间的表面张力，促进脂类乳化，同时扩大脂肪和脂肪酶的接触面，加速脂类的消化。胆汁酸还具有防止胆石生成的作用，胆固醇难溶于水，需掺人卵磷脂一胆汁酸盐微团中，使胆固醇通过胆道运送到小肠而不致析出。如胆汁酸及卵磷脂与胆固醇比值降低，则可使胆固醇过饱合而以结晶形式析出形成胆石。不同胆汁酸对结石形成的作用不同，鹅去氧胆酸及熊去氧胆酸可使胆固醇结石溶解，而胆酸及脱氧胆酸则无此作用汹’２７１胆汁酸保护内脏不受细菌感染，正常情况下，人小肠中菌群数量较低（１０４—１０５菌落／ｍ１），结合胆汁酸浓度较高（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）。在人体及动物体肝硬化中，胆汁酸分泌降低，细菌过量生长。将动物胆管结扎也会导致小肠内细菌过量生和宿主粘膜损伤，导致细菌穿越机体粘膜屏障并造成系统感染，对实验小鼠进行经口饲喂胆汁酸，可抑制由胆管阻抑引发的细菌过量增长，对黄疸病人提前进行胆汁酸口服，可抑制肠道细菌产生过量内毒素。这些都提示，在胆汁酸和肠道细菌之间存在着某种联系。体外实验表明，结３３囱鐾直匡堂医亟±堡壅垒堂丝迨塞（兰塑生２合及非结合的胆汁酸均可抑制细菌生长。Ｉｎａｇａｋｉ等基于小鼠的实验表明，结合胆汁酸在末端小肠中的抗菌效果是受由法尼酯衍生物Ｘ受体（ｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｒｎｅｓｏｉｄＸｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＸＲ）参与的细胞途径调控的，ＦＡＲ被结合胆汁酸活化，进而激活血管生成素Ｉ（ａｎｇｉｏ－ｐｏｉｅｔｉｎＩ，ＡｎｇＩ）、一氧化氮合成酶（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＮＯｓｙｎｔｈａｓｅ，ｉＮｏｓ）和白细胞介素ｌ８（ｉｎｔｅｒ－ｌｅｕｋｉｎ一１８，１１．一１８）等基因的表达，这些基因的表达可发挥抑菌作用。将胆管结扎，饲喂ＦＸＲ的激活剂ＧＷ４０６４仍可抑制细菌生长．但Ｉｎ鳄出的实验设计仍有不足，如未验证在将ＦＸＲ敲除的小鼠中，饲喂胆汁酸是否抑制细菌生长（这种结果容易与胆汁酸累积引起的细胞凋亡混淆）；尽管用微阵列分析表明了ＦＸＲ激活了一些基因表达（如ｉＮｏｓ），但缺乏ｉＮｏｓ基因的小鼠并未在小肠中呈现细菌过量生长汹瑚】。尽管如此，Ｉｎａｇａｋｉ的实验仍有助于人们合成一些ＦＸＲ的激活剂应用于胆汁流阻塞或降低的病人，或者是一些对细菌过度增殖较敏感的人群，这仍有待于进一步研究。近年来，人们研究发现，胆汁酸也可作为一种信号分子汹’３¨，其主要参与的３种信号分子途径机制已被人们阐明：激活有丝分裂激活的蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｔｅｉｎｐｒｏ－ｋｉｎａｓｅ，乩心Ｋ）途径；作为信号分子与Ｇ蛋白偶联的受体（Ｇ—ｐｒｏｔｅｉｎ—ｅｏｕｐｌｅｄｒｅ．ｆａｍｅｓｏｉｄＸｒｅｃｅｐ－ｅｅｐｔｏｒ，ＧＰＣＲ）ＴＧＲ５结合；激活法尼酯衍生物Ｘ受体（ｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｔｏｒ，ＦＸＲ）的表达．通过激活这些不同的信号传导途径，胆汁酸可以分别起到调节体内能量代谢平衡、控制肥胖的作用以及抑制肠道细菌过度增殖。３结语一方面，代谢组学并不是特殊假设驱动的代谢整体分析方法，而是一门分析遗传和环境变化如何导致代谢产物的水平发生变化并根据有关实验结果（数据）产生新的假说的一门科学。在应用方面，代谢组学要生存和发展，必然要有特色，从表型着手回答其他组学不能回答的生物问题。与其他组学一样，如何克服瓶颈从大量的代谢产物中找出特异性的生物标记物（特别是低丰度的标记物）是决定此技术能否在药物和临床领域广泛应用的—个重要因素。另一方面，胆汁酸是由肝脏合成的一类重要的内源性物质，它们具有如脂类吸收、药物的重吸收和排泄、毒素的排泄等重要的生理功能。对胆汁酸的系统分析不但可用于考察胆汁酸不同种属及不同组织中的代谢物分布差异并可基于化学分布差异开展胆汁的种属鉴定。还可在明晰各种属胆汁酸种类及含量的基础上探讨胆汁酸代谢网络的组成及胆汁酸的累积和分布规律。胆汁酸作为动物胆汁中主要的的特征次生代谢产物，其在胆汁中中的生物合成路径已基本明确，因此其代谢路径的分析将有助于揭示各种次生代３４囱蓥直匿堂睦亟±受塞垒堂鱼途塞【垫塑生２谢产物之间的相互关系，以及胆汁酸类化合物的生物合成规律及调控机制。４参考文献［１］ＮｉｃｈｏｌｓｏｎＪＫ，Ｂｏｌｌａｒｄ舰，ＬｉｎｄｏｎＪＣ，ｅｔａ１．Ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｅｓ：ａｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒ咖ｄ她ｄｒｕｇｔｏｘｉｃｉｔｙＭｏｌＢｉｄ，２００２，４８：１５５ａｎｄｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＯｒｕｓＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００２，１：１５３［２】Ｆｉｅｈｎ—－１７１０．Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｅｓ：ｔｈｅｌｉｎｋｂｅｔｗｅｅｎｇｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｐｌａｎｔ［３］ＳｕｍｍｅｒＬＷ，ＭｅｎｄｅｓＰ，ＤｉｘｏｎＲＡ．Ｐｌａｎｔｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｅｓ：昧ｓｃａｌｅｐｈｙｔｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙｉｎｔｈｅｆａｍｅ．ｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｐｈｙｔｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，６２：８１７－８３６［４］ＨｏｍｉｎｓＭＧ，ＭｕｒａｋａｍｉＳ，ＨｏｍｉｎｇＥＣ．Ａｎａｌｙｓｅｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ，ｅｅｒａｍｉｄｅｓ，ａｎｄｅｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅｓｂｙｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ懈ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＡｍＪｍｅｔａｂｏｌｉｃ皿衄ｎｇｂａｓｅｄｏｎＯｌｉｎＮｕｔｒ，１９７１，２４（９）：１０８６—１０９６［５］ＧａｔｅｓＳＣ，ＳｗｅｅｌｅｙＣＣ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ，１９７８，２４：１６６３—１６７３［６］ＯｌｉｖｅｒＳＧ．Ｙｅａｓｔ鹪ａｎａｒｉｇａｔｉｏｎａｌｔｏｏｌｉｎｇｅｎｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１９９７。１４３：１４８３—１４８７ｏｎ［７］Ｆｉｅｌｄ［８］ＦｉｅｈｎＤ，ＳａｎｓｏｎｅＳＡ．Ａｓｐｅｃｉａｌｉｓｓｕｅｄａｔａｓｔａｎｄａｒｄ．Ｏｎｌｉｃｓ，２００６，１０（２）：８４—９３ａｎｄＯ，ＫｒｉｓｔａｌＢ，ＶａｎＯｒｎｍｅｎＢ，ｅｔａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｒｅｐｏｒｔｉｎｇｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｅｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓｔｕｄｉｅｓ：ａｃａｌｌｆｏｒｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ．Ｏｍｉｅｓ，２００６，１０（２）：１５８—１６３Ｅ，ｅｔａ１．Ｓｕｍｍａｒｙｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓｆｏｒｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ【９］ＬｉｎｄｏｎＪＣ，ＮｉｅｈｏｌｓｏｎＩＫ，Ｈｏｌｍｅｓｐｏｒｔｉｎｇｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃａｎａｌｙｓｅｓ．Ｎａｔａｎｄ静Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２００５，２３（７）：８３３—８３８［１０］ｅｔｔｍｅｒＫ，ＡｗｎｏｖＰＡ，ＨａｍｍｏｃｋＢＤ．Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｂａｓｅｄｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍＢｅｙ，２００７，２６（１）：５１—７８［１１］ＡｅｋｅｒｍａｎｎＢＬ，Ｈａｌｅ皿，Ｄｕ氐ｉｌｎｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．ＣｕｒｔＤｒｕｇＫＬ．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆ１１１８ｓ￥ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｉｎｂｉｏｍａｒｋｅｒｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄＭｅｔａｂ，２００６，７（５）：５２５－５３９［１２］ＤｕｎｎＷＢ，ＥＩｌｉｓＤＡｎａｌＩ．Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔａｎａｌｙｔｉｃａｌｐｌａｔｆｏｒｍｓａｎｄｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ．ＴｒａｃＴｒｅｎｄｓ２９４１Ｃｈｅｍ，２００５，２４（４）：２８５２［１３］ＨｏｌｌｙｗｏｏｄＫ，ＢｒｉｓｏｎＤＲ，Ｇｏｏｄａｃｌ！ｅＲ．Ｍｅｍｂｏｌｏｍｉｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｔｒｅｎｄｓ．Ｐｍｔｅｏｍｉｅｓ，２００６，６（１７）：４７１６—４７２３【１４］ＤｕｎｎＷＢ，ＢａｉｌｅｙＮＪＣ，ＪｏｈｎｓｏｎＨＥ．Ｍ删毗吨ｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ：ｃｕｒｒｅｎｔａｎａｌｙｔｉｃａｌｔｅｃｌｍｏｔｏ－ｇｉ∞．Ａｎａｌｙｓｔ，２００５，１３０（５）：６０６—６２５［１５］ＹａｎｇＪ，ＸｕＧＷ，ＺｈｅｎｇＹＦ，ｅｔａ１．Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｌｉｖｅｒｃａｎｃｅｒｕｓ咄ＨＰＬＣｂａｓｅｄｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓａ．ｖｏｉｄｉｎｇ‰ｐｏｓｉｔｉｖｅ８１３（１２）：５９—６５［１６］Ｇｏｖｉｌｒｅｓｕｌｔｆｒｏｍｈｅｐａｔｉｔｉｓａｎｄｈｅｐａｔｏｃｉｒｒｈｏｓｉｓｄｉｓｅａｓｅｓ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢ．２００４。Ｇ１Ｍｅｔａｈｏｎｏｍｉｅｓ：ａｎｅｗｆｒｏｎｔｉｅｒｏｆｎｕｅｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｅ弛∞ｒ姗ｃｅ（ＮＭＲ）．ＮａｔＡｃａｄＳｃｉＬｅｔｔ３５内鐾古医学院硕士研究生学位迨文ｆ２００９年）Ｉｎｄｉａ，２００４，２７（９—１０）：２８９—２９９［１７］ａｍａｕｔａｒＲ，ＤｅｍｉｒｃｉＡ，ｄｅＪｏｎｇＧＪ．Ｃａｐｉｌｌａｒｙｄｅｃｔｍｐｈｏｒｅｓｉｓｉｎｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ．ＴｒａｃＴｒｅｎｄｓＡｎａｌＣｈｅｍ，２００６。２５（５）：４５５—４６６［１８］Ｂｒｉｔｚ—ＭｅＫｉｂｂｉｎＰ．ＴｅｒａｂｅＳ．Ｏｎ—ｌｉｎｅｐｒｅｃｏｎｃｅｎｌｒａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒ［１ａｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｅｔａｂｏ－ｌｉｔｅｓｂｙｃａｐｄｋＩｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ，２００３，１０００（１２）：９１７—９３４［１９］ＬａｓｃｈＰ，ＢｏｅｓｅＭ，ＰａｃｉｆｉｃｏＡ，ｅｔａ／．ＦＴ－ＩＲｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓｏｆｓｉｎ【出ｃｅｉｌｓ蚰ｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｅｖｄ．ＶｉｂＳｐｅｃｔｍａｃ，２００２，２８（Ｉ）：１４７一１５７８ｅｎｌｌｎ［２０】ＳｃｈｍｉｕＪ，ＢｃｅｋｅｓＦｏｕｒｉｅｒＭ，ＢｒａｕｅｒＡ，ｅｔａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｃｒｕｐｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍｂｌｏｏｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ａｎａｌｂｙｔｒａ越ｏｌ＇ｎｌｉｎ６姗ｄＣｈｅｍ，２００２，７４（１５）：３８６５－３８６８［２１］ＧａｍａｃｈｅＰＨ，ＭｅｙｅｒＤＦ，ＧｒａｎｇｅｒＭＣ，ｅｔａｌ。Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ＪＡｍＳｏｃＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｕｍ，２００４，１５（１２）：１７１７—１７２６［２２］ＢｅｃｋｗｉｔｈＨａｌｌＢＭ，Ｂｒｉｎｄｌｅｙｒ，ＢａｒｔｏｎＲＨ，ｅｔａｌ。Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｓｉ斛ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｔｏｍｉｎｉｍｉｓｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｈｉ【ｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＨ—ＮＭＲｓｐｅｃｔｒａｏｆｂｉｏｉｌｕｉｄｓ．Ａｎａｌｙｓｔ，２００２，１２７（１０）：１２８３—１２８８［２３】Ｍａｏ甩，ＸｕＭ，ＷａｎｇＢ，ｅｔａ１．ＥｖａｌｕａｔｉＯｎｏｆｆｉｌｔｅｒｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｓｉｇｎａｌｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｏｎｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｅａｌｔｈｙｈｕｍａｎ鸵ｎｌｌｎＨ—Ｎ胍ｓｐｅｃｔｒａ．ＡｃｔｓＣｈｉｍＳｉｎ，２００７，６５（２）：１５２—１５８［２４］聂青和，张亚飞．胆汁酸代谢．肝脏，２００４，９（４）：２４７—２４８［２５］姚光弼．肝脏对胆汁形成和分泌的作用．Ｃｈｉ尬∞Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００４，９（２）：１０６—１０９［２６］李哲夫．胆圆醇胆石成因的研究进展．中国普通外科杂志，２００７，１６（２）：１７０—１７２［２７］郑吉春，王韫芳，裴雪涛．胆汁酸代谢对肝细胞功能的影响．Ｃｈｉｎｅｓｅ（４）：３０８—３１０Ｈｅｐａｍｌｏｇｙ，２００７，１２［２８］李灏，姜颖，贺福初胆汁酸功能及其与肠道细菌相互关系．中国生物化学与分子生物学报，２００７，２３（１０）：８１７—８２２［２９］黄延风．胆汁酸的毒性作用．国际检验医学杂志，２００６，２７（２）：１５２—１５７［３０］ＬｕｔｊｏｈａｎｎａｎｄＤ，ＨａｈｎＣ，ＰｒａｌｉｎｅＷ，ｅｔｓ１．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｒｉｆａｍｐｉｎｏｎｓｅｒｕｍｍａｒｋｅｒｓｏｆｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｂｉｌｅａｃｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎ嗽．ＩｎｔＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ．２００４，４２：３０７－３１３［３１］李新平，欧阳克清，蔡绍皙．胆汁酸合成和代谢调节的研究．医学综述，２００２，８（８）：４７６—４７８３６攻读学位期间发表文章情况序号作者（全体作者，按顺序排列）ＲｉＧｕＬｅｎｇ—Ｓｉ，Ｇｕａｎｇ—－ＢｏＧｅＧａｎｇＲａｐｉｄ发表或投题目稿刊物名称、级别发表的年月、卷期、起止页码被索引收录情况ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｃｉｄｓｉｎｂｉｌｅｔｏｇｒａｐｈｉａＳＣＩＣｈｒｏｌｌａａ－１ｚｈａｏｏｆｂｉｌｅＷｅｉ“Ｐｅｉ—ＰｅｉＤｏｎｇＹｉｎｇＨｕＬｉｎｇＹａｎｇｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｍａｍｍａｌｓｂｙＵＦＬＣ—－ＤＡＤ２斯１３古楞张志贤《内蒙古医２００８年１２不同肝胆病人胆汁的学院学报》月３０：３４—ＵＦＬＣ—ＭＳ代谢轮廓国家核心期３６分析刊《中国期刊网＞、＜中国学术期刊（光盘版）＞全文收录期刊３斯１３古楞刘洪涛中药酚酸的体内代谢研究进展《亚太传统２００８年０６医药》国家月４（６）：４９级期刊—５ｌ＜中国期刊网＞、＜中国学术期刊（光盘版）＞全文收录期刊４斯日古楞葛广波基于ＵＦＬＣ—ＭＳ的不第十七届全２００８年０４同肝胆疾病的代谢轮国色谱学术月报告会会议廓分析３７个人简历斯日古楞，男，内蒙古西乌旗人。２００６年毕业于内蒙古医学院药学系，获药学专业理学学士学位。同年进入内蒙古医学院研究生院药理学专业攻读硕士学位，师从杨凌研究员，主要从事体内内源性物质分析及药物代谢研究。攻读硕士学位期间，共发表各类学术论文４篇，其中ＳＣＩ论文１篇。３８致谢在硕士学业即将结束之际，衷心感谢导师杨凌研究员对我的关怀和培养．三年的学习期间，导师在工作和生活上给予我极大的关心和帮助，他严谨的科研作风、热忱的工作态度、忘我的工作热情和献身科学事业的精神是我终身学习的楷模。导师的言传身教将激励我不断前进。特别感谢葛广波师兄，这篇论文的每个实验细节和每个数据，都离不开他的细心指导，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励，让我受益良多。感谢大连医科大学附属第一医院及赵刚教授，宫爱花教授，李晓芳师姐提供病人样品。感谢我们１８０６组这个温暖大家庭的所有人的关心和帮助。感谢我的父母和所有家人，他们一如既往的理解、支持和信任，是我求学路上的巨大精神支柱，也使我得以专心学习！以充满感恩的心，将此论文献给所有曾经关心、帮助和鼓励过我的老师、同事、朋友和亲人，感谢他们给予我的帮助和支持！再次向他们致以诚挚的谢意１３９代谢组学在胆汁酸种属差异及肝胆疾病分析的应用

作者：

学位授予单位：

斯日古楞内蒙古医学院

1. 李晓芳 超快速液相色谱联合质谱分析法对胆道疾病的胆汁酸分析[学位论文]2009

2. 斯日古楞.葛广波.李晓芳.毛玉玺.梁思成.官爱霞.杨凌 不同肝胆病人胆汁的UFLC-MS代谢轮廓分析[会议论文]-2009

引用本文格式：斯日古楞 代谢组学在胆汁酸种属差异及肝胆疾病分析的应用[学位论文]硕士 2009