蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法以及抗体的纯化方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 109336968 A(43)申请公布日 2019.02.15

(21)申请号 201811332123.X(22)申请日 2018.11.09

(71)申请人 杭州奕安济世生物药业有限公司

地址 310000 浙江省杭州市经济技术开发

区白杨街道科技园路2号5幢11层01-09单元(72)发明人 金雄华　汤炜　梁泊宁　徐志豪　(74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理

事务所(普通合伙) 11371

代理人 葛松生(51)Int.Cl.

C07K 16/00(2006.01)C07K 1/22(2006.01)

权利要求书1页 说明书10页

()发明名称

蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法以及抗体的纯化方法(57)摘要

本发明提供了一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法以及抗体的纯化方法。蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法：循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目标抗体：填料为MabSelect LX、Amsphere A3或Praesto Jetted A50，柱高为5～15cm，线性流速为200～500cm/h；在用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用pH值为5～6，电导率为20～100mS/cm的缓冲液洗涤柱床。本发明通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的填料，既降低了介质成本，又提高了纯化效率；还通过增加中间清洗的步骤提高了对HCP、DNA的去除能力，进而提高了阴离子交换层析去病毒的能力。

CN 109336968 ACN 109336968 A

权　利　要　求　书

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1.一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法，其特征在于，循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目标抗体：

填料为MabSelect LX、Amsphere A3或Praesto Jetted A50，填料的装柱高度为5～15cm，工艺运行线性流速为200～500cm/h。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标抗体为中国仓鼠卵巢细胞表达的抗体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述填料的装柱高度为5～12cm，优选5～10cm，更优选6～10cm；

优选地，所述工艺运行线性流速为300～500cm/h，优选300～400cm/h。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白A亲和层析的方法为：在上样之后和用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用中间清洗缓冲液洗涤柱床；

所述中间清洗缓冲液为：pH值为5～6，电导率为20～100mS/cm的缓冲液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为醋酸盐缓冲体系、磷酸盐缓冲体系或柠檬酸盐缓冲体系；

优选地，所述缓冲液为用氯盐调整电导率的缓冲液，所述氯盐优选氯化钠。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述中间清洗缓冲液的pH值为5.5～6，优选5.5～5.8。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述中间清洗缓冲液的电导率优选50～100mS/cm，更优选50～80mS/cm。

8.根据权利要求4～7任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白A亲和层析的流程依次为：消毒、平衡液洗涤、上样、平衡液洗涤、所述中间清洗缓冲液洗涤、平衡液洗涤、所述洗脱液洗脱目标抗体；

优选地，所述平衡液为Tris-HCl+150～160mM NaCl、pH7.2～7.6的缓冲液，优选50～55mM Tris-HCl；

优选地，所述目标抗体为CHO细胞表达的单抗时，所述洗脱液为NaAc-HAc、pH3.0～3.5的缓冲液，优选50～55mMNaAc-HAc。

9.一种抗体的纯化方法，其特征在于，先采用权利要求1-8任一项所述的方法洗脱目标抗体，然后对收集的洗脱液进行阴离子交换层析处理：

依次消毒、平衡液洗涤、上样、平衡液洗涤；优选地，所述阴离子交换层析时的平衡液为Tris-HCl、pH7.2～8.0的缓冲液。10.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析的填料为POROS 50HQ、Q Sepharose FF、Capto Q或Eshmuno Q。

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蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法以及抗体的纯化方法

技术领域

[0001]本发明涉及抗体纯化领域，尤其是涉及一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法以及抗体的纯化方法。

背景技术

[0002]生物制药行业迅速发展，连续生产工艺以高效、快速和更稳定的特性越来越被关注。连续生产技术在生物制药行业中的应用开始于21世纪初，其越来越多地被应用以取代传统的批次生产方法，来提高一致性、降低生产成本和缩短交货期。在生物制药上游工艺中，连续生产始于灌流培养的方式，一些不稳定的生物制品已经在上游实现了的商业化的连续生产，如凝血因子VII和凝血因子VIII。[0003]相比于上游的灌流培养工艺，连续的下游生产工艺更复杂，而连续层析步骤具有更大的挑战性。

[0004]常规的做法是用多柱连续层析的方式，把相同的层析填料填充在多根层析柱中，在上样阶段优化条件使得层析填料达到满载，提高效率，节省填料和缓冲液的用量。在商业化的单克隆纯化工艺中，通常利用蛋白A亲和层析来捕获细胞培养收获液中的目标物，而蛋白A填料的价格又异常昂贵。传统的蛋白A亲和层析工艺对载量的有效利用率很低，所以连续层析技术在单抗的捕获阶段就显得更加实用。连续层析技术也带来相应的挑战，更多层析柱之间的连接带来系统设计的复杂性，需要相应的阀路设计满足来工艺的需求。为了满足多柱位连续层析，需要特殊设计的层析系统，常见的有：GE公司的3柱位或4柱位的运行

PCC连续流层析设备，Pall公司的使用一次性管路及多柱位的Cadence BioSMB工业

系统，以及ChromaCon公司的2柱位Contichrom CUBE连续流层析设备。可见，多柱位连续层析的方式存在介质成本高的问题。[0005]为解决以上问题，生产厂家现在已经广泛采用“每批次多次循环”的方式处理高滴度细胞培养液。然而，这种放大设计显著延长了纯化时间、缓冲液消耗和洗脱产品的体积，这了这种方法在工业生产中的广泛应用。[0006]有鉴于此，特提出本发明。发明内容

[0007]本发明的第一目的在于提供一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法，该方法通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的蛋白A亲和填料，来提高蛋白A亲和填料的利用率；还通过降低柱高，提高线性流速，来缩短单次循环时间；最后通过单柱多次循环来实现蛋白A亲和层析的连续捕获工艺，既降低了介质成本，又提高了纯化效率。[0008]本发明的第二目的在于提供一种抗体的纯化方法，该纯化方法通过在蛋白A亲和层析过程中增加中间清洗的步骤提高了对HCP、DNA的去除能力，进而提高了阴离子交换层析去病毒的能力。

[0009]为了解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：

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一种蛋白A亲和层析法纯化抗体的方法为：循环利用以下蛋白A亲和层析柱纯化目

标抗体：

[0011]填料为MabSelect LX、Amsphere A3或Praesto Jetted A50，填料的装柱高度为5～15cm，工艺运行线性流速为200～500cm/h。[0012]以上方法为单柱多次循环的纯化工艺，主要通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的蛋白A亲和填料，来提高蛋白A亲和填料的利用率；还通过降低柱高，提高线性流速，来缩短单次循环时间；最后通过单柱多次循环来实现蛋白A亲和层析的连续捕获工艺，既降低了介质成本，又提高了纯化效率。[0013]另外，本发明的另一个优势是：无需增加额外工艺步骤即可提高单位时间单位填料体积的处理量，替代现有工艺的成本低，对抗体的生产链没有影响，且工艺稳健、可靠。[0014]综上，与现有技术相比，本发明的以上工艺具有填料利用率高、单位时间单位填料体积的处理量高、成本低、工艺稳健可靠等优点。[0015]本发明中，MabSelect LX、Amsphere A3、Praesto Jetted A50填料通常为固定的厂家，分别为GE Health Care公司、JSR公司和Purolite公司。[0016]本发明中，填料的装柱高度在5～15cm范围内任意选择，例如5cm、5.5cm、6.0cm、6.5cm、7.0cm、7.5cm、8.0cm、8.5cm、9.0cm、9.5cm、10.0cm、10.5cm、11.0cm、11.5cm、12.0cm、12.5cm、13.0cm、14.0cm、14.5cm或15.0cm等。[0017]本发明中，工艺运行线性流速在200～500cm/h范围内任意选择，例如200cm/h、250cm/h、300cm/h、350cm/h、400cm/h、450cm/h或500cm/h等。[0018]本发明的纯化方法主要适用于抗体的纯化，尤其是单抗的纯化，尤其是中国仓鼠卵巢细胞表达的抗体。[0019]在以上基础上，工艺的其他条件还可以进一步改进，具体如下。[0020]优选地，所述填料的装柱高度为5～12cm，优选5～10cm，更优选6～10cm。[0021]优选地，所述工艺运行线性流速为300～500cm/h，优选300～400cm/h。[0022]填料的装柱高度和工艺运行线性流速是影响纯化效率的关键参数，经优化，采用以上条件效率大幅提高，单位时间单位填料体积的处理量显著提高。[0023]优选地，所述蛋白A亲和层析的方法为：在上样之后和用洗脱液洗脱目标抗体之前，先用中间清洗缓冲液洗涤柱床；[0024]所述中间清洗缓冲液为：pH值为5-6，电导率为20-100mS/cm的缓冲液。[0025]以上方法利用：pH值为5-6，电导率为20-100mS/cm的缓冲液清洗样品，去除其中的HCP、DNA。相比无中间清洗步骤的层析工艺，本发明对HCP、DNA的去除率有显著改进，所得洗脱液中HCP含量低于1000ppm，残留DNA的含量低于100pg/mg。[0026]中间清洗缓冲液的pH值和电导率使去除HCP、DNA的关键参数，pH可采用5-6范围内的任意值，例如5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0等，电导率可采用20-100mS/cm范围内的任意值，例如20mS/cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45mS/cm、50mS/cm、55mS/cm、60mS/cm、65mS/cm、70mS/cm、75mS/cm、80mS/cm、85mS/cm、90mS/cm、95mS/cm、100mS/cm等。

[0027]在以上增加中间清洗的基础上，还可以进行以下改进：[0028]优选地，所述缓冲液为醋酸盐缓冲体系、磷酸盐缓冲体系或柠檬酸盐缓冲体系。

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这些缓冲液不会引来外源性杂质，而且原料易得。

[0030]对于缓冲液的浓度没有特定限定，例如50mM NaAc-HAc或1M NaAc-HAc等。[0031]优选地，所述缓冲液为用氯盐调整电导率的缓冲液，所述氯盐优选氯化钠。[0032]当然，也可以采用其他溶解性好的盐调节电导率，且不仅限于加入一种盐，或者多种组合后加入。[0033]经考察，在以上填料的层析柱中增加中间清洗的步骤，可达到事半功倍的效果，对HCP、DNA的去除能力显著提高。[0034]优选地，所述中间清洗缓冲液的pH值为5.5-6，优选5.5-5.8。[0035]优选地，电导率为50-100mS/cm，优选50-80mS/cm。[0036]优选地，所述蛋白A亲和层析的流程依次为：消毒、平衡液洗涤、上样、平衡液洗涤、所述中间清洗缓冲液洗涤、平衡液洗涤、所述洗脱液洗脱目标抗体。[0037]优选地，所述平衡液为Tris-HCl+150～160mM NaCl、pH7.2～7.6的缓冲液，优选50～55mM Tris-HCl。[0038]优选地，所述目标抗体为CHO细胞表达的单抗时，所述洗脱液为NaAc-HAc、pH3.0～3.5的缓冲液，优选50～55mM NaAc-HAc。[0039]优选地，在所述蛋白A亲和层析之后还包括对收集的洗脱液进行阴离子交换层析：[0040]依次消毒、平衡液洗涤、上样、平衡液洗涤。[0041]优选地，所述阴离子交换层析时的平衡液为Tris-HCl、pH7.2～8.0的缓冲液。[0042]优选地，所述阴离子交换层析的填料为POROS 50HQ、Q Sepharose FF、Capto Q或Eshmuno Q。[0043]综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：[0044](1)在不增加额外工艺步骤的前提下，通过选用载量高、传质能力好、运行流速快的蛋白A亲和填料，来提高蛋白A亲和填料的利用率；还通过降低柱高，提高线性流速，来缩短单次循环时间；最后通过单柱多次循环来实现蛋白A亲和层析的连续捕获工艺，既降低了介质成本，又提高了纯化效率；[0045](2)通过在蛋白A亲和层析提纯抗体时增加中间清洗步骤，提高了对HCP、DNA的去除能力，并且相比传统层析有实质性提高；[0046](3)通过优化蛋白A亲和层析和阴离子交换层析中的其他工艺参数，进一步改善了纯化工艺对HCP、DNA的去除能力。具体实施方式

[0047]下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。[0048]实施例1

[0049]

使用GE的Pure 25层析系统，采用Praesto Jetted A50填料，层析柱

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Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高6.5cm，柱体积6.2ml，操作流速200cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用冰袋降温的方式与层析系统对接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行10个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时77分钟，实际用时90分钟(层析系统泵冲洗，会消耗额外时间)，15个小时处理目标蛋白3.1g，产量为：33.3g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理33.3g单抗)。

[0050]而如果采用传统工艺(流程如对比例1)，每个循环需要耗时215分钟，产量为：9.8g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理9.8g单抗)。并且传统工艺需要的填料体积会远远增加。单柱连续流层析优势明显。[0051]对比例1

[0052]

使用GE的Pure 25层析系统，采用MabSelect Sure填料，层析柱Vantage 

11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20.0cm，柱体积19.0ml，操作流速200cm/h。样品来源

为CHO细胞表达的单抗(Mab1)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用冰袋降温的方式与层析系统对接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为35g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行4个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时201分钟，实际用时215分钟(层析系统泵冲洗，会消耗额外时间)，14.3个小时处理目标蛋白2.66g，产量为：9.8g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理9.8g单抗)。[0053]实施例2

[00]对实施例1进行工艺放大，使用PALL的一次性层析系统，采用Praesto Jetted A50填料，层析柱BPG140/50(GE)，直径14cm，柱高10cm，柱体积1.5L，操作流速300cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用无菌对接方式与层析系统连接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为60g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行10个循环。当所有亲和层析循环结束后，

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最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时77分钟，实际用时77分钟(层析系统无泵冲洗)，13个小时处理目标蛋白900g，产量为：46.1g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理46.1g单抗)。500L的生物反应器，24小时就可完成亲和捕获，而只需要1.5L的填料。而如果采用传统工艺(即对比例1)，每个循环需要耗时215分钟，填料量为6.2L(BPG200/50)，也需要24小时以上。单柱连续流层析优势明显。[0055]实施例3

[0056]

使用GE的Pure 25层析系统，采用Amsphere A3填料，层析柱Vantage 11/

250(Millipore)，直径1.1cm，柱高10cm，柱体积9.5ml，操作流速300cm/h。样品来源为CHO细

胞表达的单抗(Mab2)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用冰袋降温的方式与层析系统对接。用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)冲洗层析柱，用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行10个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时77分钟，实际用时90分钟(层析系统泵冲洗，会消耗额外时间)，15个小时处理目标蛋白4.75g，产量为：33.3g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理33.3g单抗)。[0057]而如果采用传统工艺(见对比例2)，每个循环需要耗时215分钟，产量为：9.8g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理9.8g单抗)。并且传统工艺需要的填料体积会远远增加。单柱连续流层析优势明显。[0058]对比例2

[0059]

使用GE的Pure 25层析系统，采用Eshmuno A填料，层析柱Vantage 11/250

(Millipore)，直径1.1cm，柱高20.0cm，柱体积19.0ml，操作流速200cm/h。样品来源为CHO细

胞表达的单抗(Mab1)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用冰袋降温的方式与层析系统对接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为35g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行4个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时201分钟，实际用时215分钟(层析系统泵冲洗，会消耗额外时间)，14.3个小时处理目标蛋白2.66g，产量为：9.8g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理9.8g单抗)。[0060]实施例4

[0061]对实施例3进行工艺放大，使用PALL的一次性层析系统，采用Praesto Jetted A50

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填料，层析柱BPG140/50(GE)，直径14cm，柱高10cm，柱体积1.5L，操作流速300cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab2)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用无菌对接方式与层析系统连接。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行10个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时77分钟，实际用时77分钟(层析系统无泵冲洗)，13个小时处理目标蛋白750g，产量为：38.4g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理38.4g单抗)。500L的生物反应器，30小时就可完成亲和捕获，而只需要1.5L的填料。而如果采用传统工艺(见对比例2)，每个循环需要耗时215分钟，填料量为6.2L(BPG200/50)，也需要29小时。单柱连续流层析优势明显。[0062]实施例5[0063]MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0mL，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(编号Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.5，电导率88.5mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为900ppm，DNA残留量为85pg/mg。[00]POROS 50HQ，层析柱BenchMark 06/25(Omnifit)，直径0.66cm，柱高20cm，柱体积6.8mL，操作流速220cm/h。样品来源为上步亲和洗脱液，调整pH至7.5，并且经0.22μm滤膜过滤，X～MuLV的添加量为1％(v/v)。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl，pH7.5)平衡层析柱；将pH调整和澄清后的样品上样到层析柱，上样载量为100g/L；再用3CV的平衡液洗涤柱床，收集流穿液；最后再用再生溶液(50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH7.5)对层析柱再生；用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，最后用3CV的保存液保存层析柱。该步骤对X～MuLV的清除能力可以达到5.1log10。[0065]对比例3[0066]MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0mL，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(编号Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为3600ppm，DNA残留量为400pg/mg。

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POROS 50HQ，层析柱BenchMark 06/25(Omnifit)，直径0.66cm，柱高20cm，柱体积

6.8mL，操作流速220cm/h。样品来源为上步亲和洗脱液，调整pH至7.5，并且经0.22μm滤膜过滤，X～MuLV的添加量为1％(v/v)。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl，pH7.5)平衡层析柱；将pH调整和澄清后的样品上样到层析柱，上样载量为100g/L；再用3CV的平衡液洗涤柱床，收集流穿液；最后再用再生溶液(50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH7.5)对层析柱再生；用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，最后用3CV的保存液保存层析柱。该无亲和层析中间清洗步骤的清除能力除能力为4.0log10。[0068]比较实施例5和对比例3，可看出：亲和中间清洗步骤可有效提高X～MuLV的清除能力。

[0069]实施例6[0070]MabSelect SuRe，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速200cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab2)。用3CV的平衡液(20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH7.4)冲洗层析柱，用3CV的0.1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为30g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(1M NaAc-HAc，pH5.8，电导率47.3mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(100mM HAc，pH3.0)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为960ppm，DNA残留量为90pg/mg。[0071]Q Sepharose FF，层析柱BenchMark 06/25(Omnifit)，直径0.66cm，柱高20cm，柱体积6.8ml，操作流速200cm/h。样品来源为上步亲和洗脱液，调整pH至8.0，并且经0.22μm滤膜过滤，MVM的添加量为1％(v/v)。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl，pH8.0)平衡层析柱；将pH调整和澄清后的样品上样到层析柱，上样载量为60g/L；再用3CV的平衡液洗涤柱床，收集流穿液；最后再用再生溶液(50mM Tris-HCl+1M NaCl，pH8.0)对层析柱再生；用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，最后用3CV的保存液保存层析柱。该步骤对MVM的清除能力可以达到4.5log10。[0072]对比例4[0073]MabSelect SuRe，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速200cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab2)。用3CV的平衡液(20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH7.4)冲洗层析柱，用3CV的0.1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为30g/L；再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(100mM HAc，pH3.0)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.1mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为3710ppm，DNA残留量为524pg/mg。[0074]Q Sepharose FF，层析柱BenchMark 06/25(Omnifit)，直径0.66cm，柱高20cm，柱体积6.8ml，操作流速200cm/h。样品来源为上步亲和洗脱液，调整pH至8.0，并且经0.22μm滤膜过滤，MVM的添加量为1％(v/v)。用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl，pH8.0)平衡层析柱；将pH调整和澄清后的样品上样到层析柱，上样载量为60g/L；再用3CV的平衡液洗涤柱床，收集流穿液；最后再用再生溶液(50mM Tris-9

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HCl+1M NaCl，pH8.0)对层析柱再生；用3CV的0.5mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，最后用3CV的保存液保存层析柱。无亲和层析中间清洗步骤的清除能力除能力为3.3log10。[0075]比较实施例6和对比例4，可看出：亲和中间清洗步骤可有效提高MVM的清除能力。[0076]实施例7[0077]MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)。用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)冲洗层析柱，用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH5.0，电导率91.3mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为810ppm，DNA残留量为78pg/mg。[0078]实施例8[0079]MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)。用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)冲洗层析柱，用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(1M NaAc-HAc+NaCl，pH6.0，电导率85.1mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为970ppm，DNA残留量为90pg/mg。[0080]实施例9[0081]MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0mL，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(编号Mab1)。用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)冲洗层析柱，用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+·0.2M NaCl，pH5.5，电导率20mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为990ppm，DNA残留量为98pg/mg。[0082]实施例10[0083]MabSelect SuRe LX，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0mL，操作流速220cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(编号Mab1)。用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)冲洗层析柱，用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(50mM NaAc-HAc+

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1.2M NaCl，pH5.5，电导率100mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为0ppm，DNA残留量为90pg/mg。[0084]实施例11[0085]Praesto Jetted A50，层析柱Vantage 11/250(Millipore)，直径1.1cm，柱高20cm，柱体积19.0ml，操作流速300cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用5CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为60g/L；用3CV的平衡液清洗柱床，用3CV的中间清洗缓冲液(1M NaAc-HAc+NaCl，pH5.5，电导率88.5mS/cm)洗涤柱床，再用3CV平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液；最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。洗脱液的HCP含量为980ppm，DNA残留量为97pg/mg。[0086]对比例5

[0087]

使用GE的Pure 25层析系统，采用MabSelect LX填料，层析柱Vantage 11/

250(Millipore)，直径1.1cm，柱高10cm，柱体积9.5ml，操作流速300cm/h。样品来源为CHO细

胞表达的单抗(Mab1)，目标蛋白浓度为3.5g/L，蛋白料液采用冰袋降温的方式与层析系统对接。用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，再用3CV的平衡液(50mM Tris-HCl+150mM NaCl，pH7.4)平衡层析柱；将澄清后的细胞培养收获液(HCCF)上样到层析柱，上样载量为50g/L；用3CV的平衡液清洗柱床；再用3.5CV的洗脱液(50mM NaAc-HAc，pH3.5)洗脱，收集洗脱液。最后用3CV的1mol/L的醋酸溶液对层析柱再生，用2CV的平衡液平衡层析柱后，进入下一个亲和层析循环；连续进行10个循环。当所有亲和层析循环结束后，最后再用3CV的0.2mol/L的氢氧化钠溶液冲洗层析柱，用3CV的平衡液平衡层析柱后，最后用3CV的保存液保存层析柱。经测试，每个循环理论用时63分钟，实际用时75分钟(层析系统泵冲洗，会消耗额外时间)，12.5个小时处理目标蛋白4.75g，产量为：40.0g mAb/L resin/hr(每升填料，每小时可以处理40.0g单抗)。洗脱液的HCP含量为3900ppm，DNA残留量为420pg/mg。[0088]而如果采用含中间清洗的工艺(流程如实施例1、实施例2、实施例3和实施例4)，洗脱液HCP含量分别为910、990、930和0ppm，洗脱液DNA残留量分别为92、93、和95pg/mg。虽然去除中间清洗步骤可以提高产量，但是中间清洗步骤可有效去除HCP和DNA，优势明显。[00]实施例12

[0090]该实施例与实施例1的区别仅在于柱高不同，为5cm，填料类型及其他纯化条件均与实施例1相同，结果显示每次循环所需的时间为72分钟，产量为：41.6g mAb/L resin/hr。[0091]实施例13

[0092]该实施例与实施例1的区别仅在于柱高不同，为15cm，填料类型及其他纯化条件均与实施例1相同，结果显示每次循环所需的时间为175分钟，产量为：17.1g mAb/L resin/hr。

[0093]最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依

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然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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