检验医学与临床２０１３年２月第１Ｏ卷第４期Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１３，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．４ ・・ ４６ｌ ・ 综 述・ 抗体分离纯化技术研究进展 甘丽晶 综述， ，胡质毅 审校（１．广州中医药大学国家重点学科实验室， 广州 ５１０４０５；２．广东药学院基础学院，广州 ５１０００６） 【关键词】抗体； 分离纯化 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－９４５５．２０１３．０４．０４２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２—９４５５（２０１３）０４—０４６１－０４ 抗体是一种特殊的蛋白质分子，是机体免疫系统中最为重 要的效应分子，由于其Ｆａｂ片段能特异性结合抗原，Ｆｃ片段具 度及抗体分子所带电荷的情况所决定，当溶液中存在高浓度的 中性盐，将会夺取抗体分子的水化层，降低其溶解度；同时高浓 度的中性盐也改变了溶液离子强度，中和抗体表面大量电荷， 有与补体、免疫细胞（如巨噬细胞、ＮＫ细胞）ＦｃＲ（Ｆｃ受体）的 结合位点，因此抗体具有中和毒素或病毒、介导细胞毒和促进 吞噬等功能，在抗感染、抗肿瘤、免疫调节与免疫监视等方面有 进一步降低抗体溶解度。在两种因素的综合作用下，抗体发生 凝集而沉淀析出。盐析法使用的中性盐有多种：硫酸铵、硫酸 相当重要的作用。现今，抗体在同种异体免疫排斥、自身免疫 反应抑制、肿瘤治疗、感染性疾病治疗以及作为检测诊断试剂 等方面应用非常广泛ｌ＿】］。 钠、硫酸镁、氯化钠及磷酸盐等。由于硫酸铵有溶解度高，受温 度影响小，溶解于水时不产生热量，对蛋白质有保护作用，高浓 度时可抑制微生物和蛋白酶的活性，价格低廉等优点，故最为 常用。但是，硫酸铵在碱性环境中不能作为沉淀剂进行盐析反 应ｌ２］。盐析法可获得较纯的抗体粗制品，要获得更高纯度 ＩｇＧ，还需采用其他方法做进一步纯化，如可再用ＤＥＡＥ纤维 素柱层析纯化，该法技术含量高有经济意义，且制得的Ｉｇ（ 也 迄今抗备技术的发展大致分为三个阶段：（１）１８９０年 Ｂｅｈｒｉｎｇ和Ｋｉｔａｓａｔｏ发现白喉抗毒素（抗白喉毒素抗体），开始 了以抗原免疫动物来获得多克隆抗体（ＰＡｂｓ）即抗血清的途 径；（２）１９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｒｅｉｎ创建杂交瘤技术制备单克隆 抗体（ＭｃＡｂ）；（３）１９８４年Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ以基因工程方法制备 基因工程抗体（ＧＥＡｂ）。根据制备方法抗体可分为三大类型： 有一定的经济价值。 １．２辛酸一硫酸铵法辛酸一硫酸铵沉淀法是在硫酸铵沉淀法 多克隆抗体，单克隆抗体，基因工程抗体，目前噬菌体抗体以及 用转基因小鼠制备的抗体和人源化抗体均属于基因工程抗体。 的基础上结合有机溶剂沉淀法发展而来的。辛酸沉淀法是在 酸性条件下（ｐＨ４．５）往血清中加入一定量短链脂肪酸辛酸， 使血浆蛋白中的清蛋白、ａ及 球蛋白成分沉淀，取ＩｇＧ成分 为主的上清液，再经硫酸胺沉淀。该法仅需两步沉淀分离，过 程简便，成本低廉。陈丹等＿３ 分别采用辛酸法，硫酸铵法和辛 酸一硫酸铵联合沉淀法纯化抗体。结果表明，联合使用辛酸一硫 酸铵较单纯的辛酸法或硫酸铵法效果好。目前，多抗以亲和层 析为主要的纯化方式。 但不论用何种方法所制备的抗体，都必须在后期选择合适的分 离纯化方法对抗体进行分离纯化，以满足不同要求。 抗体的纯化有两个原则：（１）在确定抗体的具体纯化方法 之前，先明确纯化后抗体的用途，不同用途的抗体，纯化要求也 不同。（２）从多克隆抗体、单克隆抗体到基因工程抗体及其他 抗体类型，制备方法的不同导致最终所含的杂蛋白也有很大的 差异。另外重链类别、亚型、相对分子质量的不同也将使纯化 的方法存在差别。最后，在能达到纯度要求的情况下，应尽可 能使用较少的纯化步骤，以提高产率、节约成本。根据不同的 抗体类型，下面将分别予以介绍。 １多克隆抗体 多克隆抗体（简称多抗），即抗血清是将一种天然抗原经不 同途径免疫动物，由于抗原性物质具有多个抗原决定簇，可以 刺激机体多个Ｂ细胞克隆产生抗体，合成和分泌抗多种决定 １．３亲和层析法（ＡＣ） 在生物分子中有些分子的特定结构 部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结 合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合 既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生 物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这 样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。亲和层析的最大优点 在于：利用它从粗提液中经过一次简单的处理便可得到所需的 高纯度活性物质。亲和层析法对设备要求不高、操作简便、适 用范围广、特异性强、分离速度快、分离效果好、分离条件温和 等优点。其不足在于亲和吸附剂通用性较差，故要分离一种物 簇的抗体于动物血清中形成的抗体混合物。多抗可用于一般 抗原检测及被动免疫治疗，但由于成分复杂，只在感染早期有 效及有一定的毒性，其应用受到一定的。常用的纯化方法 有：盐析法、辛酸一硫酸铵沉淀法、抗原吸附法、冷乙醇沉淀法、 离子交换层析和蛋白质Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）、蛋白质Ｇ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）或 ＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇ分离纯化。 １．１盐析法盐析法是一种较为传统的纯化方法，原理是：抗 质几乎都需要重新制备专用的吸附剂，较好地控制洗脱条件， 避免生物活性物质的变性失活。 经典的亲和纯化流程如下见图１。 由于配基的不同，亲和层析可分为以抗原为配基的免疫亲 和法，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ和Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ亲和法 ］，蛋白质Ａ类似物作为 体在水溶液中的溶解度由它的亲水基团与水形成的水化膜程 配体的亲和层析，合成有机小分子化合物纯化法以及以金属离 ＊ 基金项目：教育部留学回国人员启动基金资助项目（编号；４４１４３ｏ０６）。 ・ ４６２ ・ 检验医学与临床２０１３年２月第１Ｏ卷第４期Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１３，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．４ 子为配基的亲和层析法。 故不适用于工业规模大量生产。封琳等 为从猪瘟病毒高免 疫猪血清中纯化猪瘟病毒抗体，将猪瘟病毒接种于猪传代肾细 ２单克隆抗体 单克隆抗体（简称单抗）的概念是相对于多抗，它是由杂交 瘤细胞经筛选的单个细胞增殖而形成的细胞群所合成的、 胞ＰＫ一１５培养，获得猪瘟病毒。并将猪瘟病毒抗原与环氧氯 丙烷活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ一４Ｂ偶联，制备成免疫亲和层析柱纯化 针对某一特定决定簇的抗体，其分泌的抗体来源于单个Ｂ细 胞所衍生的克隆。单抗的问世具有划时代的意义，根本上解决 该病毒抗体，采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＩ ＩＳＡ进行抗体纯度和活 性，结果表明纯化的猪瘟病毒抗体纯度高，活性强。 了免疫学中“特异性”和“重复性”两大难题。目前，单抗已被广 泛作为检测、诊断试剂和药物用于移植排斥反应、癌症、感染性 疾病和炎症等。 单抗的纯化方法大致可分为沉淀法和层析法两大类。沉 淀法除了上文介绍的硫酸铵法，辛酸一硫酸铵沉淀法之外，还可 以采用：优球蛋白沉淀法、聚乙二醇（ＰＥＧ）沉淀法【５］、丙酮沉淀 法、三氯醋酸沉淀法、低温有机溶剂沉淀法（辛酸法）等。沉淀 法多作为初级的纯化，常常需要进一步处理才能满足实验或临 床使用要求。层析法包括：亲和层析，离子交换层析，凝胶过滤 层析，疏水层析，亲硫层析，疏水电荷诱导层析。层析法纯化的 单抗具有活性损失小、纯度高、周期短等优点。 否 图１ 亲和纯化流程 ２．１亲和层析法（ＡＣ） 亲和层析法在多抗的纯化中已经提 及，同样的，在单抗的分离纯化亦常作为首选方法。 ２．１．１ ＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇ亲和层析法Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ是金黄色葡萄球 菌细胞壁上的一种蛋白质，天然Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ由５个ＩｇＧ结合域 和其他未知功能的非Ｆｃ结合域组成，能特异性地与人和哺乳 动物抗体（主要是ＩｇＧ）的Ｆｃ区结合。因而，将Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ与琼 脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填 料。近年来，基因重组蛋白Ａ获得ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ亦作配基使用， 其效果较Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ高 ］。 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ是一种从链球菌中提取的细菌细胞壁蛋白， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ不仅与免疫球蛋白的恒定区相结合，亦能与清蛋白、 ａ２一巨球蛋白相结合，这使得用Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ亲和色谱无法除去体 系中存在的清蛋白和巨球蛋白。目前，采用基因修饰的方法表 达出来的ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ可以克服上述缺点。 吴淑江等ｌ７ 采用ＨｉＴｒａｐ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ亲和层析柱纯化 已预处理的含乙肝核心抗原（ＨＢｃＡｇ）单抗的腹水，获得纯度 大于９５ 的抗ＨＢｃＡｇ单抗，回收率达７５ ，且纯化后的单抗 活性没有下降。 ２．１．２免疫亲和法（ＩＡＣ）该法以抗原（或抗体）作为配体与 载体结合，组成固定相，用于分离样品中能特异结合的抗体（或 抗原）。由于抗原与抗体的结合的特异性非常强，免疫亲和法 是分离抗体非常有效的方法，且纯度很高。但抗原相当昂贵， ２．１．３ 固定金属亲和层析法（ＩＭＡＣ） ＩＭＡＣ法的固定相基 质上鳌合了一些金属离子，如Ｃｕ 、Ｎｉ 、Ｆｅ 等，可通过配位 键鳌合侧链含有Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ和Ｈｉｓ的多肽， 而小肽序列中含有Ｈｉｓ—ｘ＿ｘ—Ｘ—Ｈｉｓ的结构最易结合到金属离 子亲和柱上，获得很好的纯化效果。利用金属螯合亲和层析分 离蛋白质时，ｐＨ在６～８就能被亲和柱吸附。洗脱可用降低 ｐＨ值、增加离子强度、或在缓冲液中加５ ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙 酸（ＥＤＴＡ）等方法。Ｍａｒｔｉｎｓｌ９ 等设计了用固定金属亲和层析 纯化单抗一步法。他们准备多种包含固定金属螫合物的固定 相以比较抗绿脓杆菌野生型酰胺酶的单克隆抗体的纯化状况。 研究发现：提高配基浓度，较长的隔离臂及更高的ｐＨ条件可 增大单抗的吸附量，提示进行ＩＭＡｃ方法纯化单抗时采用特 制的固定相及正确选择吸附条件的可以达到一步纯化ＩｇＧ。 ２．２离子交换层析法（ＩＥＣ） ＩＥＣ法是以具有离子交换性能 的物质做固定相，利用其与流动相的离子进行可逆的交换，从 而分离离子型化合物的一种方法。离子交换剂可用：ＤＥＡＥ一纤 维素（阴离子交换剂），ＣＭ一纤维素（阳离子交换剂），或者ＤＥ— ＡＥ／ＣＭ－葡聚糖凝胶等。纤维素的高度亲水性与蛋白质有很 好的相容性，但缺点也较明显：容量低、流速慢。近年，开发了 珠状交联葡聚糖、琼脂糖、交联纤维素等，极大的改善了离子交 换介质的性能，使得ＩＥＣ仍得到广泛应用。詹骞等 采用两 步离子交换层析法结合硫酸铵盐析法分离纯化ＷｕＴ３单抗， 在通过小量试验优化纯化参数后，进行中量试验和中试放大， 建立了一条生物反应器无血清培养杂交瘤细胞大规模分离纯 化单抗的工艺路线。 ２．３凝胶过滤层析法（ＧＦＣ） ＧＦＣ又称分子筛过滤，排阻层 析。凝胶具有立体网状结构，可将分子按大小进行分离。凝胶 过滤法的突出优点：层析用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸 附力弱，操作条件较温和；温度适用范围广；不需有机溶剂；能 较好地保持分离成分的理化性质。但是ＧＦＣ法样品处理量 小，因其原理是空间排阻效应，分子质量接近的蛋白质分子的 分离效果较差，常需与其他方法联合使用。凝胶过滤的一般过 程：先用适宜溶剂浸泡凝胶颗粒，使之充分吸液膨胀；再装柱， 加样；最后以同样溶剂洗脱，小分子物质较慢洗脱，大分子则较 快分离出来。可采用的凝胶种类：葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝 胶，琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺和琼脂糖交联物等。最常用的是 葡聚糖凝胶有两大类：Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｅｒｙｌ。马泓冰等Ⅲ 将含 单抗２Ｆ５的腹水经离心、过滤及缓冲溶液变换预处理后，先经 ＩＭＡＣ纯化，去除大部分杂蛋白，再经凝胶过滤层析法精细纯 化，并探讨了上样的流速和洗脱液的种类对单抗２Ｆ５纯度的 影响。发现纯化的单抗２Ｆ５在体外对外周血Ｔ细胞具有明显 的促增殖作用；而且其促增殖作用的活性优于Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ亲和 层析法纯化所获得单抗。并且这种两步串联层析纯化方法的 操作简便，所得单抗的纯度高、生物学活性好。 ２．４疏水层析法（ＨＩＣ） 八种常见氨基酸的侧链是非极性 检验医学与临床２０１３年２月第ｌｏ卷第４期Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１３，Ｖｏ！．１０，Ｎｏ．４ ・４６３・ 的，属疏水性氨基酸。其中大多数疏水性氨基酸残基包埋在分 有一定的晶体结构和形状磷酸钙晶体，基本分子结构为ｃａ 。 子内部，与周围的水性环境隔离。包埋在内部的疏水性基团与 （ＰＯ ）ｓ（ＯＨ） 。ＨＡＴ早在１９５６年就用于蛋白的分离纯化。 临近的疏水基团常发生作用。ＨＩＣ根据蛋白质分子表面疏水 该层析法以羟基磷灰石为吸附剂作固定相，在晶体中的Ｃａ 性残基的数量和类型不同分离蛋白质。常用的疏水层析柱材 离子与蛋白的羧基吸附的同时ＰＯ 与氨基也发生吸附。另 料有Ａｌｋｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ和Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ。ＨＩＣ介质的重要特 外，酸性蛋白采用磷酸盐缓冲液洗脱，碱性蛋白则采用ＮａＣＩ、 点是疏水性弱，与蛋白质的作用比较温和，能更好地保持生物 ＫＣ１或ＣａＣ１ｚ等溶液。ＨＡＴ吸附层析的实验装置简单，操作 大分子的天然结构和生物活性。此外，其“高盐吸附、低盐洗 简便，对分子量较小的物质分离效果较好，可纯化ＩｇＭ类抗 脱”的特点使得ＨＩＣ能直接与其他分离技术如盐析、离子交换 体，保持抗体活性，对单抗的纯化已达到工业规模。 层析联合使用。广泛使用的商品化制备型ＨＩＣ介质配基仍是 ２．８灌注层析灌注层析是美国ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司 烷基和芳基。但ＨＩＣ存在着：操作复杂，没有通用的程序可依 于１９８９年开发的层析分离技术。其关键是以Ｐ０Ｒ０Ｓ命名的 循，柱再生较为困难以及剧烈的洗脱条件影响抗体等不良因 固定相粒子的特殊结构，ＰＯＲＯＳ的基质是聚苯乙烯一二乙烯 素，使得较少采用ＨＩＣ法进行抗体纯化＿１ 。 苯，含有两种大小不同的孔道，层析介质包括离子交换、疏水作 ２．５亲硫层析法（ＴＡＣ） 层析固定相基质含有砜基和硫醚 用、亲和吸附和反相介质等。与传统法相比，灌注层析具有：分 基团的侧臂，能与蛋白质上的色氨酸和（或）苯丙氨酸残基结 离速度快，效率高；可在室温条件下操作；一步浓缩和分离，提 合，钾盐、铵盐等能促进这种结合的分析技术。１９８５年Ｐｏｒａｔｈ 高产品质量和回收率等优势。 首次应用亲硫色谱从血清中分离出抗体。ＴＡＣ主要在疏水作 ２．９其他方法 用的基础上增加了硫元素的相互作用。利用层析介质与含硫 ２．９．１层析聚焦 层析聚焦一般是在其他层析方法如：ＩＥＣ、 蛋白质和非硫蛋白质的亲硫性差异，对蛋白质加以分离。一般 ＧＦＣ、ＨＩＣ没有达到纯化要求时再采用的纯化方法，其原理是 情况，ＴＡＣ在高盐环境下对抗体及其他某些蛋白质产生特异 根据蛋白质分子间等电点的差别而进行的分离纯化。较早即 性吸附，再在低盐条件下洗脱，可获得高纯度及高回收率的蛋 有报道用聚焦层析法分离纯化人巯基蛋白酶抑制肽Ｃ—ｈＣＰＩｃ， 白质产品。刘玄和宋宏新＿１ 详细介绍了近年不同吸附介质的 获得高纯度，高活性的Ｃ—ｈＣＰＩｅ。 亲硫层析法，并比较了疏水层析，ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ亲和层析，离子交 ２．９．２免疫磁珠法 童军等 。 比较了国产免疫磁珠与溴化 换层析等，肯定亲硫层析在抗体纯化方面的巨大潜力。Ａ．Ｌｉ— 氢（ＨＢｒ）活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ两种介质提纯羊抗人ＩｇＧ。结 ｈｍｅ等ｌ＿ 】用二乙烯砜活化琼脂糖和 巯基乙醇反应得到的基 果显示，ＨＢｒ活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ的提纯效率优于免疫磁珠。 质分离人血清蛋白。在高浓度硫酸铵条件下，几乎束缚所有的 但免疫磁珠成本低廉，技术简单。并且在相同蛋白含量条件 血清蛋白，洗脱过程则用逐步降低洗脱缓冲液的盐浓度完成。 下，由免疫磁珠提取的抗体效价与由ＨＢｒ活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 这种亲硫吸附层析一步法具有分辨力强和蛋白质回收率高的 ４Ｂ提取的抗体相当。 优点。 ２．９．３十二烷基肌氨酸钠溶解法 凌媛等 采用十二烷基 ２．６疏水电荷诱导层析法（ＨＣＩＣ） Ｂｕｒｔｏｎ和Ｈａｒｄｉｎｇｌ＿１ 于 肌氨酸钠溶解包涵体，对目的蛋白（抗ＴＮＦ－ａ的单链抗体）进 １９９８年提出的不同于ＨＩＣ法的ＨＣＩＣ是近几年来发展起来的 行可溶性纯化，蛋白纯度达到９０ ，纯化后的蛋白经酶联免疫 一类新技术。ＨＣＩＣ与蛋白质的作用除了疏水作用，还有电荷 吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和蛋白印迹法证明该单链抗体维持了亲本 间的相互作用。ＨＣＩＣ的原理是其具有ｐＨ依赖行为的双模 抗体与ＴＮＦ－ 特异性结合的能力，且具有细胞毒中和活性。 式、可离子化的配基（例如吡啶）所决定的。在ｐＨ６—９范围内， ２．９．４组合法 在能达到纯度要求的情况下，应尽可能减少 配基不带电，表现疏水特性，从而与疏水性蛋白结合。当流动 纯化步骤，避免操作导致回收率的下降。但实际过程中，往往 相的ｐＨ下降到某一值，配基和蛋白都带正电荷，发生相同电 需要多种层析技术联合使用，才能达到对产品的纯度要求。王 荷的排斥作用，导致蛋白被洗脱下来。ＨＣＩＣ与ＨＩＣ及ＴＡＣ 明永等 在研究甘露聚糖结合凝集素（ＭＢＩ ）时，联合应用甘 不同在于ｐＨ对ＨＣＩＣ的影响要大于离子强度的影响，ＨＣＩＣ 露聚糖Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ层析柱和抗人ＭＢＩ ～ＣＲＤ单克隆抗体一 法对初始料液的离子强度（或电导）没有特别要求，即在离子强 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ层析柱，３次上柱亲和层析分离，分别用ＥＤＴＡ、 度很低的情况下，蛋白仍然有较高的吸附量。ＨＣＩＣ主要用于 甘露糖、Ｇｌｙ—ＨＣＩ（ｐＨ ２．４）溶液洗脱结合蛋白。所获纯化 抗体的分离纯化，优点如下：价格低（仅为Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ的２５ ）、 ＭＢＬ为Ｍｒ２８０００和Ｍｒ３２０００肽链构成的功能性寡聚体，其纯 效率高（一步纯化纯度达到９５ 以上）、化学稳定性强（可用１． 度较高，可与配体甘露聚糖结合并有效凝集酵母菌，还能与 ０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ清洗）、适用范围广（可用于ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ Ｕ９３７细胞胶凝素受体结合。 和抗体片段的分离）等，是取代传统昂贵的Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ吸附剂的 ２．９．５形成抗体环复合物先用硫酸铵溶液从腹水中沉淀目 选择。１３ｏｓｃｈｅｔｔｉＤ 研究发现以４一巯基乙基吡啶（４一ＭＥＰ）作为 标抗体［大鼠抗２，４一二硝基苯ＩｇＧ（ＩｇＧＤＮＰ）］，再用人工合成 配体的疏水电荷诱导层析是一个从各种原料的分离抗体的有 的含多个二硝基苯（ＤＮＰ）的多价半抗原与ＩｇＧＤＮＰ结合形成 效方法。抗体没有经过预处理（浓缩），在生理条件下即被吸 ＩｇＧＤＮＰ环状复合物，最后选择性沉淀目标抗体的二聚体，三 附。当ｐＨ值降低时，配体和抗体带相同电荷，发生解析。同 聚体及更高级寡聚物，再生游离抗体。这个程序可从混合抗体 时，抗体的捕获与样品的ｐＨ值，电导率，结合能力和表达水平 分离目标抗体，同样可分离在血清或其他生物性液体中的蛋白 是一致的，且抗体的最终纯度是原料依赖性，纯度高达９８ 。 及球蛋白。与传统纯化方法相比，该法的优点在于：选择拥有 目前，４－ＭＥＰ已商品化，在许多实验室和抗体生产商采用 。 两个Ｆａｂ结合位点的抗体，可形成环状复合物；不必进行层析 ２．７羟基磷灰石（ＨＡＴ）吸附层析ＨＡＴ是一种无机盐，具 分离。该法的不足是半抗原必须由二价和（或）三价类似物 ・４６４・ 检验医学与临床２０１３年２月第１Ｏ卷第４期Ｌａｂ Ｍｅｄ Ｃｌｉｎ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１３，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．４ 构成。 ２．９．６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉ 亲和层析法纯化ＩｇＡ可用于肿瘤和抗病毒 治疗的二聚体ＩｇＡ和分泌型ＩｇＡ与现有的ＩｇＧ抗体为基础的 药物相比，其细胞的杀伤性能力更强。然而，共同表达４种不 同的多肽以及不能使用传统的Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ或Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ亲和层 析柱纯化ＩｇＡ这两个因素阻碍了ＩｇＡ治疗应用的发展。 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ是来源于细菌的免疫球蛋白（Ｉｇ）结合蛋白，能与人 Ｉｇ的Ｋ型轻链的ＶＫＩ、ＶＫＩｌｌ和ＶＫＩＶ亚型，小鼠Ｋ型轻链的Ｖ Ｉ亚型结合，是Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ或Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ的一个潜在替代品。 ３基因工程抗体 目前，单克隆抗体广泛应用于疾病的预防、诊断和治疗。 但绝大多数的单抗是鼠源性抗体，在重复给药的情况下，人体 会产生“人抗鼠抗体”，出现人抗鼠抗体反应，导致临床疗效减 弱甚至消失。此外，单抗还有许多不足，如单抗全分子体积过 大，与靶抗原的亲和力不够等 。为了解决这些问题，较好的 办法是研制基因工程抗体，去除或降低抗体的鼠源性成分或减 少抗体的分子大小，保留或增强抗体的特异性、亲和力或生物 学活性，以更好地应用于临床。 基因工程抗体主要包括人源化抗体、小分子抗体、抗体融 合蛋白及某些特殊类型抗体等。另外，构建噬菌体抗体库、核 糖体展示文库等可使不经抗原免疫而获得特异性抗体。 基因工程抗体的分离纯化可根据抗体特性选用上述的 方法。 宋丽敏等［２ 用一段４５个核苷酸的片段连接抗对硫磷抗 体重链和轻链可变区基因片段ＶＨ和ＶＬ，获得了抗对硫磷单 链抗体（ｓｃＦｖ）基因，再构建抗对硫磷ｓｃＦｖ基因原核表达载体， 并采用Ｎｉ ＮＴＡ金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯 化，得到目的蛋白纯度为７４．１８ ，最后用ＥＬＩＳＡ法检测该单 链抗体，抗体特异性符合要求。 综上所述，抗体不仅在生命科学的基础研究中发挥重要作 用，而且在疾病的预防、临床诊断和治疗领域应用愈加广泛，这 必将对抗备和纯化方法的要求更为精细、高效，因此完善 目前常规的分离纯化方法，研制开发新型的分离纯化技术有重 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