微生物学通报ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＪＵＮ＠２００８ｂｙ２０，２００８，３Ｓ（６）：９５９－９６２ｏｆＩｎｓｔｉｔｕｔｅＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ＣＡＳ菌种冷冻干燥保藏的影响因素常金梅１’２蔡芷荷２吴清平２张鲁斌Ｐ（１．南亚热带作物研究所湛江５２４０９１）（２．广东环凯微生物科技有限公司广州５１００７０）摘要：菌种资源保藏是微生物学及相关学科研究的基础。冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一，为进一步提高菌种保藏质量人们进行了大量的研究。本文介绍了菌种冷冻干燥保藏方法的原理和优点，同时详细介绍了菌种冷冻干燥保藏方法的影响因素。关键词：菌种保藏，冷冻干燥，影响因素ＩｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇＦａｃｔｏｒｓｔｏＦｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＣｕｌｔｕｒｅＣＨＡＮＧＪｉｎ—Ｍｅｉｌ，２ＣＡＩＺｈｉ—Ｈｅ２ＷＵＱｉｎｇ—Ｐｉｎ９２ＺＨＡＮＧＬｕ．Ｂｉｎｌ＋（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｏｕｔｈｅｒｎＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ５２４０９１）（２．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＨｕａｎｋａｉＭｉｃｒｏｂｉａｌＳｃｉ＆ＴｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００７０）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｉｓｔｈｅｂａｓｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅＦｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇｉｓｏｎｅｓｐｅｃｉａｌｔｙ．ｏｆｔｈｅｍｏｓｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍａｎｙｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｈａｖｅｂｅｅｎｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｐａｐｅｒｍａｉｎｌｙｄｅｓｃｒｉｂｅｓｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅａｎｄａｄｖａｎｔａｇｅｏｆｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｐａｐｅｒｉｎｔｒｏｄｕｃｅｓｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓｔｏｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ，Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ菌种保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏，其目的是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究和应用。至今保藏方法有２０多种，从总体上可分为４大类：传代法、干燥法、冷冻法及冷冻干燥法【ｌＪ，其原理主要是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，降低微生物菌株新陈代谢的速度，使细菌的生命活动处于半永久性休眠状态，从而达到保藏的目的。现在简易的保藏方法主要有定期移植法、液体石蜡法、无菌蒸馏水法、硅胶干燥法、玻璃或瓷珠干燥法、滤纸法、麸皮法、沙土管法等。而目前公认冷冻法和冷冻干燥法是长期保存微生物菌种的最安全、可靠的方法。其中制备和保存生物材料的极佳方法是冷冻干燥法，此法适用于大多数微生物菌种的保藏。１冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏方法作为一种最安全、可靠的方法之一，其适用范围广，除少数不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用此方法保藏外，其它各大类微生物如细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及病毒均可采用此方法保藏。因为它适合于微生物细胞结构特点、生存环境及其生理状态，能满足微生物细胞结构和功能的统一性。其原理是微生物在冷冻保护剂又称抗冻剂的环境中处于冷冻状态，然后＋通讯作者：因：邝ｂｉｎｚｈａｎｇ＠ｃｈｉｎａ．ｃｏｒｎ．ｃａ收稿日期：２００７—１０—２３；接受日期：２００８．０３—１０万方数据９６０微生物学通报２００８，Ｖ０１．３５，Ｎｏ．６在真空减压情况下利用升华现象除去水分，使微生物在非剧烈的尽量避免细胞直接受到损伤的条件下处于干燥、缺氧状态，生理活动受到抑制。使用此法，不同菌种可选择不同的抗冻剂，目前人们所用的抗冻剂有数十种，有的是单一的，有的是按一定配方混合使用的，根据微生物不同类别不同种群加以选择使用【２】。２影响菌种冷冻干燥保藏的因素２．１菌种悬液的浓度在冻干技术中，为了保证在长期保藏后有足够数量的活细胞，通常采用浓度较大的菌悬液，细菌和放线菌浓度一般要大于１０８ＣＦＵ／ｍＬ，酵母菌细胞和霉菌孢子的浓度大于１０ＣＦＵ／ｍＬ，这样在菌种复活时只要能保证有０．１％的细胞仍然有活力就可以完成菌种传代过程。但是Ｃｏｓｔａ等也有报道冻于培养物的最佳浓度与保护性培养基相关，例如当保护培养基中加入蔗糖时，冻干培养物浓度以１０１０ＣＦＵ／ｍＬ最佳，而保护性培养基中加入脱脂乳时，培养物最佳浓度为１０８ＣＦＵ／ｍＬｌ３１０Ｐａｌｍｆｅｌｄｔ等也报道了当在保护培养基中增加蔗糖浓度时，可以降低菌悬液的浓度，以达到最高的细胞存活率Ｈ】。２．２冻干菌种材料的菌龄冻干菌种材料的菌龄对其在长期真空冷冻干燥保藏后的细胞存活率有重要影响，例如鼠李糖乳杆菌在生长稳定期进行冷冻干燥，其菌株细胞存活率最高为３１％～５０％，而在对数生长期为１４％，在延滞期仅有２％１５１０相反对Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ和Ｂｒａｄｙｒ．ｈｉｚｏｂｉｕｍ在延滞期进行冻干，其存活率较高。研究表明：处于稳定期的细胞或成熟的孢子对不良环境具有较强的抗性，因而，保藏非芽孢细菌、酵母菌，应采用对数末期或稳定初期的细胞；而保藏芽孢细菌、放线菌和霉菌，要用成熟的孢子。２．３培养基的影响实践证明，由于各类食品微生物菌种之间生物学特性存在较大差异，要对其进行冻干保藏，往往需根据菌种的特性对冻干培养基进行优化，提高微生物细胞的存活率，延长菌种保藏期；如Ｈｕａｎｇ等在对Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ进行冻干保藏时，在保护培养基中加入山梨醇、脱脂乳等抗冻剂，细胞存活率提高到了８６．５３％【６】。Ｃａｒｖａｌｈｏ等的研究表明，选择不同ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ／ｗｓｗｘｔｂｃｎ万方数据的生长培养基对保藏菌种的存活率也有重要的影响，如Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ菌株的生长培养基中加入甘露糖时，其经冻干后细胞存活率比加入果糖、乳糖以及葡萄糖要高，同时也显示了在培养基中添加４种碳水化合物，均可以提高对冻干菌株的保护作用【＿７】。但同～菌种在相同成分的培养基中培养，其为液体或同体培养对微生物的存活率影响不大。２．４抗逆能力通常认为，菌株在培养过程中，若处于某种逆境下，则会发生诱导抗逆反应，提高菌株的抗逆性。Ｐａｌｍｆｅｌｄｔ和Ｈａｈｎ．Ｈａｇｅｒｄａｌ报道，在Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ菌株的培养过程中，如果将ｐＨ从６降至５，则有助于菌株细胞在冻干过程中更好地被保护，细胞存活率将由６５％上升至９０％，其机理可能是环境ｐＨ的变化诱导细胞产生了抗性物质，从而提高了它在冻干过程中的免疫力【４】。Ｍａｕｓ和Ｉｎｇｈａｍ也报道了相似的结果，即Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ培养在６℃条件下或使其培养基的ｐＨ由６．２降至５．２，菌株将会增强抗寒和抗冻能力１８Ｊ。一般认为，细胞处在逆境中６０ｍｉｎ，就会诱导抗性基因表达产生抗逆蛋白，如当降低培养基的ｐＨ时，微生物的细胞膜脂肪酸成分发生变化，并同时产生酸性休克蛋白。另外，也有研究报道菌株的保藏期和存活率还依赖材料的干燥程度和真空的密闭性【９Ｊ。２．５保护剂保护剂对于微生物菌株冷冻干燥保藏的存活率有较大的影响，选择得当的保护剂是提高微生物冷冻干燥保藏存活率、延长菌种保藏期的关键因素。保护剂可分为小分子保护剂（如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类）和大分子保护剂（如蛋白质、多肽类和多糖类）。作为小分子保护剂，一般具有很强的亲水性，分子结构含有３个以上氢键，在冷冻或干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。而大分子保护剂通过“包裹”形式保护菌体，同时，促进低分子保护剂发挥作用【４】。保护剂类型的选择主要取决于菌株的生物学特性，如海藻糖对乳酸菌的冻干保藏效果显著【ｌ０ｌ。但也有一些保护剂可以用于多种微生物，如脱脂牛乳、血清、甘油、甜菜碱、阿东糖、蔗糖、常金梅等：菌种冷冻干燥保藏的影响因素葡萄糖和乳糖等【１１１。很多研究表明利用海藻糖作为冷冻保护剂可以使微生物的存活率比蔗糖更高，其中一个重要原因是海藻糖的玻璃化温度（即南玻璃态变为高弹态所需温度）较高，而玻璃化温度越高，冻干物在温度升高时更容易保持稳定‘１２，１３］。由于蛋白的玻璃化温度相对更高，所以其稳定性较糖类更好，因此蛋白在菌种保藏中的作用比糖类更重要【１１】。Ａｂａｄｉａｓ等‘１４１实验表明Ｃａｎｄｉｄａｓａｋｅ在利用脱脂牛乳和碳水化合物做保护剂，菌株细胞存活率可达８５．９％。因此，蛋白和糖的混合物作为保护剂更有效。另外，对于经常需要反复冻融的样品，加入甘油有助于保持细胞活力【ｌ副。２．６冻结速度在真空冷冻干燥保藏菌种的过程中，冻结速度是影响微生物存活率的重要因素，不同微生物最佳冷冻速度不同，其主要原因是冻结速度必须与微生物细胞对水分的渗透率相平衡，而细胞对水分的渗透率取决于细胞表面积与体积的比率以及细胞膜的渗透率。当冷冻速度过慢时，细胞严重脱水，细胞体积严重收缩，超过一定程度时细胞将失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度过高，产生溶质损害；当冷冻速度过快时，细胞内的水分来不及外渗，会形成较大冰晶，使细胞膜及细胞器遭到破坏，造成细胞内冰晶机械损伤。另也有研究报道，冷冻速度在５℃／ｍｉｎ一１８０℃／ｍｉｎ之间时，冷冻过程中胞内水分会完全渗出细胞，胞内不会出现结晶，细胞存活率较高；当冷冻速度大于５０００。Ｃ／ｍｉｎ时，胞内水分迅速形成结晶，不发生外渗，细胞存活率也比较高；但是如果冷冻速度在１８０ｏＣ／ｍｉｎ一５０００％／ｍｉｎ之间时，细胞内水分容易在外渗过程中形成结晶对细胞造成机械损伤。但是也有人认为真核微生物菌种适宜慢速冻结；而原核微生物菌种经慢速冻结和快速冻结后，细胞存活率差异并不显著‘１６１。２．７复活处理保藏的菌种在使用时往往需要复活处理。对于液氮冷冻状态的菌种，通常采用３８％～４０％水浴快速升温解冻，因为慢速升温解冻有可能造成胞内冰晶增大而损伤细胞。对于真空干燥和冻干菌种复活培养时，复水介质产生的渗透压和复水条件（温度、万方数据９６１ｐＨ）都有可能对细胞膜以及酶蛋白分子的结构和性质产生影响，造成细胞损伤死亡。因此，一般采用最适该菌株生长的培养液或生理盐水并在适合其培养的温度下进行复水。Ｌｏｕｉｓ（１９９０）等人的研究表明，冻干固定化胚芽乳杆菌在ｐＨ４．５的无菌水中活化后，菌株的存活率接近１００％，游离胚芽乳杆菌菌株的存活率为７５％左右。其原因可能是在复水处理的过程中复水溶液的流速及用量对微生物细胞存在渗透冲击作用，固定化微生物细胞因受固定化材料的保护而几乎不受复水溶液的渗透冲击作用，其存活率明显高于游离微生物细胞。３结束语目前，真空冷冻干燥微生物的技术与设备日益完善，而且已有许多冻干的菌种应用于工业化大生产，如活性于酵母、活性干乳酸菌等。由于固定化微生物易于实现大型化、自动化、连续化的现代化生产，真空冷冻干燥固定化微生物的研究也日益受到人们重视。参考文献…１李雁，郑从义．微生物物种多样性的保护与其资源保藏．氨基酸和生物杂志，２００３，２５（３）：４—６．［２】李华，骆艳娥，刘延林．真空冷却干燥微生物的研究进展．微生物学通报，２００２，２９（３）：７８—８２．［３】ＣｏｓｔａＥ，ＵｓａｌｌＪ，ＴｅｉｘｉｄｏＮ，ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓ，ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｍｅｄｉａａｎｄｉｎｉｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＰａｎｔｏｅａａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓｓｔｒａｉｎＣＰＡ一２ＳＲｂｊｅｃｔｅｄｔｏｆｒｅｅｚｅｄｒｙｉｎｇ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ。２０００。８９（５）：７９３—８００．【４】ＰａｌｍｆｅｌｄｔＪ，ＲａｄｓｔｒｏｍＰ，Ｈａｈｎ·ＨａｇｅｒｄａｌＢ．Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎｏｆｉｎｉｔｉａｌｃｅｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｓｆｒｅｅｚｅ·－ｄｒｙｉｎｇｔｏｌｅｒ·－ｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ．Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，４７（１）：２１—２９．【５】ＣｏｒｃｏｒａｎＢＭ，ＲｏｓｓＲＰ，ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄＧＦ，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｐｒｏｂｉｏｔｉｃｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｓｐｒａｙ·－ｄｒｉｅｄｉｎｔｈｅｐｒｅｓ·－ｏｆｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉ—ｏｌｏｇｙ，２００４，９６（５）：１０２４－１０３９．【６】ＨｕａｎｇＬｉｊｉｎ，ＬｕＺｈａｏｘｉｎ，ＹｕａｎＹｏｎｇｊｕｎ，ｅｌａ１．Ｏｐｔｉｍｉｚａ－ｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｅｎｈａｎｃｉｎｇｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｆｒｅｅｚｅ·ｄｒｉｅｄＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓｂａｓｅｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．ＪｌｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，３３（１）：５５－６１．【７】ＣａｒｖａｉｈｏＡＳ，ＳｉｌｖａＪ，ＨｏＰ，ｅｌａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｓｕｇ—ａｄｄｅｄｔＯｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｒｙｉｎｇｍｅｄｉａｕｐｏｎｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒ—ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｍ．ａｃ．ｃｎ／ｗｓｗｘｔｂｃｎ９６２微生物学通报２００８，Ｖ０１．３５，Ｎｏ．６ａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉｓｔｏｒａｇｅｏｆｆｒｅｅｚｅｄｒｉｅｄＬａｃ－ｓｓｐ．ｂｕｉｇａｒｉｃｕｓｂｙｈｅａｔａｎｄｏｓｍｏｔｉｃｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒｅｓｓ，２００４，２０（１）：２４８—２５４．【１３】ｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，９５（６）：１３１５－１３２０．ＳｔｒｅｅｔｅｒＪＧ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｒｅｈａｌｏｓｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆＢｒａ咖，一ｈｉｚｏｂｉｕｍ【８】ＭａｕｓＪＥ，ＩｎｇｈａｍＳＣ．Ｅｍｐｌｏｙｍｅｎｔｏｆｓｔｒｅｓｓｆｕｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｄｕｒｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏｊａｐｏｎｉｃｕｍｄｕｒｉｎｇｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ１．ｏｆＡｐ—ｅｎｈａｎｃｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｃｏｌｄ—ａｎｄｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，９５（３）：４８４—４９ａｃｉｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉ—【１４】ＡｂａｄｉａｓａｎｄＭ，ＴｅｉｘｉｄｏＮ，ＵｓａｌｌＪ，ｅｔａ１．Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｅｆｆｉｃａｃｙ，ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，９５（１）：１４６－１５４．【９】ＹｕｋｉｅＭｉｙａｍｏｔｏ—Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｊｕｎｊｉｓｔｏｒａｇｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄｕｓｉｎｇＳｕｋｅｎｏｂｅ，ＴａｋａｓｈｉｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｐｅｃｉｅｓＣａｎｄｉｄａｓａｋｅｔｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｈｙｄｒａ—Ｉｍａｉｚｕｍｉ，ｅｔａ１．Ｓｕｒｖｉｖａｌｍｅｄｉａ．ＪｏｕｒｎａＺｏｆＦｏｏｄＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２００１，６４（６）：ｓｔｏｒｅｄｂｙｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ．Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，５２（１）：２７－３２．８５６—８６１．【１０】ＢＤｅＧｉｕｌｉｏ，ＯｒｌａｎｄｏＰ，ＢａｒｂａｌＧ，ｅｔａ１．Ｕｓｅｏｆａｌｇｉｎａｔｅａｎｄｅｒｙｏ·－ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｓｕｇａｒｓｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａＪｏｕｒｎａｌｔｏ【１５１ＡｃｈａＳＪ，ＫｕｈｎｂｉｔｙＩ，ＭｂａｚｉｍａａＧ，ｅｔａ１．Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｖｉａｂｉｌ—ｏｆＭｉｃｒｏｂｉ—ｉｍｐｒｏｖｅａｎｄｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｌａｃ··ａｎｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｆｌｏｒａｉｎｆａｅｃａｌｄｕｒｉｎｇｌｏｎｇｔｉｍｅｓｔｏｒａｇｅ．Ｊｏｕｒｎａｌａｆｔｅｒｆｒｅｅｚｉｎｇｆｒｅｅｚｅ—ｄｒｙｉｎｇ．ＷｏｒｌｄｓａｍｐｌｅｓｏｌｏｇｉｃａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，２１（５）：【１６】Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５，６３（３）：２２９－２３８．Ｄｕｍｏｎｔ，Ｐｉｅｒｒｅ—Ａｎｄｒｅ’Ｍａｒｅｃｈａｌ，ＰａｔｒｉｃｋＧｅｒ—ｗａｔｅｒ７３９－７４６．Ｆｒｅ７ｄｅ’ｒｉｃ【１１】ＨｕｂａｌｅｋＺ．Ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，４６（３）：２０５－２２９．［１２】ＧｏｍｅｚＺＡ，Ｔｙｍｃｚｙｓｚｙｎｈａｌｏｓｅｖａｉｓ，ｅｔａ１．ＣｅｌｌｓｉｚｅａｎｄｆａｃｔｏｒｓｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙａｔｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｆｏｒｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙａｆｔｅｒｆｒｅｅｚｉｎｇａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｏｌｉｎｇＥ，ＤｅＡＧ，ｅｔａ１．Ａｃｔｉｏｎｏｆｔｒｅ·ｒａｔｅｓ．Ａｐｐｌｉｅｄｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，ｔｈｅｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ７０（Ｉ）：２６８－２７２．喈·曾喈嘈·留憎嘈喈咤电嘈电电噌喈喈嘈喈喈喈喈喈咤嘈噌·曾喈嘈喈喈嘈喈电喈喈电喈喈喈喈喈畸喈喈电勺·留—ｒ噌咤喈喈喈心崎喈喈－曾清除蚊子的两种方法蚊子会侵扰民众，尤其是农村更为突出，同时它是传播疾病的“帮凶”。清除蚊子有多条途径，其中有两种方法值得注意：１）微生物方法：包括细菌方法和真菌方法。早在二十几年前，中科院微生物研究生范云六和徐婉学在研究微生物治蚊方面发现侧芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｓｐｏｒｕｓ）对于消除蚊幼具有良好的效果；中科院病毒研究所袁志明研究小组长期从事细菌灭蚊的基础和应用研究，研制的球形芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）＇灭蚊幼制剂，对库蚊和按蚊有特异性的毒杀作用，对人畜禽和水生物无毒害，不污染环境，是我国灭蚊幼的一种高效安全的“生物灭蚊制剂”，近二十年来，该菌剂应用于１５０万亩的灭蚊实践，取得了显著的社会效益和生态效益。目前该所对自己遴选的ＢａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓＣ３．４１进行了分子生物学的基础研究，该菌的全基因组测序工作已完成。至于真菌治蚊已进入实用化，如我国研制的球孢白僵菌（Ｂｅａｕｖｅｒｉａｂａｓｓｉａｎａ）灭蚊取得了成功，它不仅毒杀马尾松松毛虫（通过酶的作用），而且对蚊幼有较强毒杀力。２）有效的非微生物方法：日本研究人员尝试铜制硬币消灭蚊子幼虫取得了良好的效果，避免了使用化学杀虫剂而产生的抗药性和环境污染，实验结果表明，将铜制硬币放人带有蚊子幼虫的积水中，可防止幼虫转化为成虫。总之，炎热天气，蚊子是传播疾病的重要“帮凶”之一，清除蚊幼是从根本上控制蚊子发展的捷径。（柯为供稿）ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｉｒｎ．ａｃ．ｃｎ／ｗｓｗｘｔｂｃｎ万方数据菌种冷冻干燥保藏的影响因素
作者：作者单位：
常金梅， 蔡芷荷， 吴清平， 张鲁斌， CHANG Jin-Mei， CAI Zhi-He， WU Qing-Ping，ZHANG Lu-Bin
常金梅,CHANG Jin-Mei(南亚热带作物研究所,湛江524091;广东环凯微生物科技有限公司,广州,510070)， 蔡芷荷,吴清平,CAI Zhi-He,WU Qing-Ping(广东环凯微生物科技有限公司,广州,510070)， 张鲁斌,ZHANG Lu-Bin(南亚热带作物研究所,湛江,524091)微生物学通报MICROBIOLOGY2008，35(6)3次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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2.会议论文 黄元桐.崔杰 一机多用——利用超速离心机制备冷冻干燥保存菌种 19943.会议论文 张伦照 冷冻干燥技术 1987
4.期刊论文 李春如.耿德桂.樊美珍.李增智.LI Chun-ru.GENG De-gui.FAN Mei-zhen.LI Zeng-zhi 几种菌种保藏方法对地生枝顶孢活力的影响 -安徽农业大学学报2001,28(2)
用3种不同的保藏方法对地生枝顶孢菌种进行保藏处理，结果表明，灭菌蒸馏水室温保藏在长达30个月后完全保存了活力；冷冻干燥的菌种在25℃破坏性条件下12个月后仍然存活；黄豆粉培养基上4℃冰箱保藏存活6个月；SDAY培养基4℃冰箱保藏效果最差，只有1个月。
5.期刊论文 边藏丽.涂献玉.BIAN Zang-Li.TU Xian-Yu 8种不同方法保藏病原菌效果的对比观察 -微生物学通报2000,27(3)
采用8种不同的菌种保藏方法,对18种常见病原菌的保藏时间及生物学特性的影响进行了对比观察.结果表明:冷冻干燥法保藏菌种时间最长(本实验室已保存15年);肉浸汤琼脂平板法保藏菌种时间最短(2～3月).保藏时间由长到短依次为:冷冻干燥法＞半固体冷冻法≥半固体斜面加液体石蜡覆盖法＞半固体斜面法＞肉浸汤加液体石蜡覆盖法＞血琼脂平板法＞肉浸汤法＞肉浸汤琼脂平板法.且相同方法对不同菌种保藏时间不同.保藏时间在1年以内的菌种,其生物学特性无明显变异;而经冷冻干燥法保藏时间较长的白喉棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型副伤寒沙门氏菌及乙型副伤寒沙门氏菌的生物学特性有不同程度改变.
6.期刊论文 马小来.姚君斐.袁勤生.MA Xiao-lai.YAO Jun-fei.YUAN Qin-sheng 肝素黄杆菌菌种保存方法的研究 -食品与药品A2006,8(4)
目的研究多种糖类对肝素黄杆菌细胞的保护作用及保藏菌种的方法.方法将多种糖类加入黄杆菌悬液,观察冷冻、冷藏、冷冻干燥过程中肝素黄杆菌的存活率,并将海藻糖和甘露醇添加进斜面固体培养基,观察菌种的有效保藏时间.结果糖类的加入明显提高了肝素黄杆菌菌种保存的存活率,其中以海藻糖和甘露醇效果最佳.结论在培养基中添加2%海藻糖或2%甘露醇可使菌株斜面冷藏保存时间延长2周.
7.会议论文 徐迪诚.张澜.李连洁 厌氧菌菌种的保存 1985
保存厌氧菌在厌氧菌检验和正常菌群的研究工作中是经常需要的。由于厌氧菌的生物学特性决定了保存厌氧菌的特性。该文结合我国的工作实际，概述了国外对厌氧菌菌种保存的研究进展。其中介绍了传代培养保存法、流动石腊重层保存法、冷冻保存法、冷冻干燥保存法和予还原灭菌培养基传代保存法，并在附录中列出了适合冷冻或冷干保存的常见厌氧菌以及厌氧菌种传代用培养基的配方。（周毓瑶摘）
8.学位论文 张燕飞 自养和异养浸矿细菌的选育和浸矿研究 2006
金属硫化矿区酸性矿坑水中广泛存在着多种具有浸矿功能的自养菌和异养菌，Acidithiobacilius ferrooxidans和Acidiphilium spp.分别是其中的典型代表。本文主要从这两种菌的分离、鉴定出发，分别对其生理和浸矿特性展开了研究；同时对浸矿细菌的保藏和硫代谢途径关键酶之一的SQR进行了研究。
本文研究中，从南京栖霞山铅锌银矿矿坑水中分离得到一株具有很强的亚铁氧化能力和硫氧化能力嗜酸氧化亚铁硫杆菌
Acidithiobaciliusferrooxidans QXS-l，考察其亚铁、单质硫底物利用特性时发现：接种前在硫中培养过的细菌在亚铁和硫混合培养基中只利用硫而没有利用亚铁进行生长；接种前在亚铁中培养过的细菌在混合培养基中可以同时利用亚铁和硫。
单蒸水(pH6.8)悬浮方法可以有效地避免频繁传代引起优良菌种的退化，更适合用于嗜酸氧化亚铁硫杆菌的中短期保藏；通过正交试验，获得冷冻保藏和冷冻干燥保藏嗜酸氧化亚铁硫杆菌的保护剂的最优化组合，使存活率分别达到％和94％。
同时，从江西德兴铜矿杨桃坞水库中分离到一株具有广泛底物利用特性的嗜酸兼性异养菌Acidiphilium sp.DXl-l,该菌既可以利用有机物进行异养生长，还可以利用二价铁、硫获得能量进行生长，并具有还原三价铁的能力，可以利用黄钾铁矾和多种硫化矿。此外，Acidiphilium sp.DXl-l可以高效率地在细胞内生成聚-β-羟基丁酸酯(PHB)，PHB作为一种可降解的生物材料，具有广泛的开发应用前景。
对Acidiphilium sp.DXl-l和Acidithiobacillus ferrooxidans QXS-l的浸矿特性研究表明二者均具有高效浸出铁闪锌矿的能力，相比而言，DXl-l浸出铁闪锌矿能力更为显著，浸出等量的锌所用时间比后者缩短一半。在实验的30d内，二者混合浸出铁闪锌矿没有表现出明显的相互促进作用。
尽管考察的六株嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫氧化能力表型差异明显，但是SQR高度保守，仅有的四处突变也并没有明显地表现出与硫氧化能力强弱有直接的联系。
9.期刊论文 胡珊.胡事君.吴清平.罗华建.梁卫驱.罗诗.陈仕丽.HU Shan.HU Shi-jun.WU Qing-ping.LUO Hua-jian.LIANG Wei-qu.LUO Shi.CHEN Shi-li 益生菌制剂加工技术的研究概况 -中国乳品工业2010,38(3)
对目前益生茵制剂的加工技术,包括:喷雾干燥技术、冷冻干燥技术、包埋技术的研究概况进行了综述.喷雾干燥技术中优化工艺参数、热应激蛋白、细胞损伤位置和机理研究,提高益生茵制品的质量;冷冻干燥技术中保护荆、冷应激蛋白对益生茵保护作用研究;包埋技术中重点介绍了微胶囊包埋技术的包囊材料、包埋方法的研究对益生菌制荆的改良.
10.会议论文 郭亚辉.郭坚华 保藏13年水稻条斑病菌致病性检验 2005
菌种保藏是一项重要的微生物基础工作,好的保藏方法可以满足科研和生产所需的优良菌种.细菌保藏方法很多,例如真空冷冻干燥保藏、冷冻甘油保藏、液氮超低温冻结保藏、矿物油保藏和斜面保藏等.真空冷冻干燥保藏菌种是微生物长期保藏的有效方法之一,此方法适用于细菌、真菌、酵母菌等大部分微生物的长期保藏,文献报道可以保藏10年左右.我们将本实验室保藏了13年的86个水稻条斑病菌种进行复壮和常规接种试验,发现95.35﹪的菌种仍然存活并具有致病力,本试验结果为菌种保藏方法的研究积累了一定的经验。
1.苏令鸣.李爽 产精氨酸的黄色短杆菌菌种保藏方法的研究[期刊论文]-工业微生物 2009(1)
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下载时间：2010年10月26日
