鱼类肠道微生物种群鉴定

材料与试剂

实验材料

每种鱼随机各取5条，均选取正常无病的个体。取样时用抄网迅速将鱼从水体中捞出，剪刀敲击头部致死后，将鱼置于灭菌塑料密封袋内，保存在冰盒中，3h内转移到实验室，12h内处理鱼样。

鱼肠道的处理

(l)在无菌操作台上进行鱼样处理，先用75%酒精擦拭鱼体表，用解剖剪沿肛门向上剪开;

(2)肠道用无菌棉线分别结扎肠段，75%酒精擦拭消化道外壁，用镊子去除附着表面的脂肪;

(3)剖开肠道后轻轻收集每尾鱼的内容物，混匀； -20℃保存待用;用磷酸盐缓冲液(pH7.2)轻柔漂洗

试剂

磷酸盐缓冲液(pH7.2) 琼脂糖 Tris平衡酚

分析纯生化试剂和PCR 反应引物 Taq DNA 聚合酶、dN TP 等分子生物学试剂

DNA分子量标准(DL100和500) 蛋白酶K JM109感受态

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pMD18一T 异丙基硫代半乳糖昔(IPTG) DNA酶 CTAB

方法

1 肠道细菌总DNA的提取 使用无菌的牙签将肠道划开，剥取里面的肠道糜烂物。收集5个个体的肠道糜烂物，混合后作为这种鱼的代表样品。采用QIAamPR DNA stoo I Mini Kit 试剂盒提取样本的总DNA。总DNA溶解于100微升超纯水中。

2 PCR DGGE分析 采用引物P2（5’ATTACGAGGAGCAG3’）扩增16S rRNA基因的V3区。25微升反应体系包括25微升的10*Buffer,2微升的25mmol/LdNTP混合物，1 U TaqDNA聚合酶（TaKaRa,Japan）,每种引物25pmol,1微升总DNA。

PCR反应程序如下：94℃变性 4min进入30个循环，循环为94℃ 45s,55℃ 45s，72℃ 1min。最后是10min延伸。然后进行“Reconditioning PCR”。2次PCR中均采用超纯水作为阴性对照保证PCR过程中没有污染。PCR经过琼脂糖电泳检查后，使用Hoefer DyNA Quant 200 system确定DNA的浓度。

DGGE指纹图谱的构建采用Bio Rad Dcode mutation detection system进行。丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性梯度为25%-55%（100%变性剂为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺），PCR产物的上样量为每个泳道约300ng。在200V、60℃条件下电泳160min。电泳后凝胶使用10 000倍稀释的SYBR Green I进行染色。最后使用UV Iphoto照相系统进行紫外照相。

样品前处理 将采集的 5组样品分别用1. 5 mL PBS (pH 7. 4 ，浓度0. 2 mol / L) 悬浮， 剧烈震荡5 min 后，1 000 r / min离心3次 ，每次5 min，收集上清，然

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后12000r/min离心5min，收集菌体沉淀，用1ml PBS悬浮沉淀，重复离心，直到上清液清澈为止；最后再用1ml PBS悬浮收集到的沉淀，置于2ml Eppendorf管中 -20℃保存备用。

总DNA的提取

(1) 在上述处理的样品中各加入 180 μL TE 缓 冲液，再加入 50 mg / mL 的溶菌酶 20 μL，混匀后置

30℃ 温育最少 15 min。

( 2)12 000 r / min 离心 5min，收集已消化细胞壁 的细菌。

( 3) 加入 200 μL Buffer BTL 重悬细胞，加 25 μL

蛋白酶 K(15 mg / mL) ，加入玻璃珠，涡旋混匀，置于

55℃ 恒温水浴，每 20 ～ 30 min 涡 旋 振 荡 样 品 1 次。 裂解时间随细菌的种类及用量的不同而不同，但一 般在 1 h 之内就能消化完全。

(4) 加入 25 mg / mL 的 RNA 酶 A 5 μL，并在室 温下放置 5 min。

(5) 加 入 220 μL Buffer BDL，涡 旋 混 匀，并 在65℃ 下水浴 10 min。在加入 Buffer BDL 后可能会形 成小团的沉淀，并不会影响 DNA 的提取。

(6) 加入 220 μL 无水乙醇并充分地涡旋振荡。

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(7) 把 Hibind 自 旋 柱 装 在 1 个 2 mL 收 集 管 上，把第 6 步 得 到 的 样 品

( 包括可能形成的所有沉 淀) 全部转移到柱子内，10 000 × g 离心 1min 以结合

DNA，弃去流出液和收集管。

(8) 把柱子装到 1 个新的 2 mL 收集管上，加入

500 μL HB，加入 700μL DNA Wash Buffer( 已用无水 乙醇稀释) 于柱子中，10 000 × g 离 心 1 min 以 洗 涤 柱子，弃去流出液，收集管再继续下一步使用;柱子 重 新 套 回 2 mL 收 集 管，加 入 700 μL DNA Wash Buffer，10 000 × g 离心 1 min 以洗涤柱子，弃去流出 液。

(9) 柱子 重 新 套 回 2 mL 收 集 管，≥10 000 × g 离心空柱 2 min 以 甩 干 柱 子; 这一步对确保下步中 得到最理想的洗脱条件是至关重要的。

(10) 把 柱 子 套 在 1. 5 mL 离 心 管 中，加 入 100 μL 65℃ 预热的 TE( pH 8. 5 ) 至柱子的膜，室温 下放置 5 min。

(11) 室温下，10 000 × g 离心 1 min 从柱子上洗 脱出 DNA。

PCR扩增

凝胶电泳

DGGE电泳凝胶制备

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(1)灌胶玻璃和垫条的处理:用洗洁液仔细清洗玻璃板，横擦竖擦3遍，并用自来水彻底冲洗然后用去离子水漂洗干净。操作时必须带手套，取板时握住板的边缘，以避免手上的油脂印在板的工作面上。

(2)灌胶玻璃板的安装与封闭:将长板平放在桌上，将垫条放置于两侧，放上短玻璃板，对齐。参照Bio一Rad Dcode system说明书操作。

(3)凝胶板的制备:用50×TAE、40%丙稀酞胺/双丙稀酞胺(37.5:l)配制分别加入高浓度变性剂和低浓度变性剂的8%聚丙烯酞胺凝胶，凝胶中TAE终浓度为1倍，以42g尿素和40mL甲酞胺为100%变性剂。将两种变性剂浓度的8%丙稀酞胺凝胶液分别吸入两个注射器，将两个注射器放在梯度形成器的正确位置，缓慢且匀速地转动轮子，以便形成线性梯度。直至灌满至玻璃板顶部。然后立即插入梳子待胶凝固。凝胶大小选用16cm×16cm×0.75mm。

(4)凝胶老化:凝胶室温放置2h，取出梳子，用1×TAE溶液冲洗凝胶孔格，以除去可能存在的未聚合的丙烯酞胺。

电泳

(l)预热缓冲液:配制7L1×TAE缓冲液，上样前将缓冲液加热到60℃。

(2)加样:取9μL PCR纯化产物与1uL10×loading buffer(TaKaRa)混合，注入到加样孔底部。

(3)电泳:电泳温度为60℃，变性剂浓度以0-100%为最大区间，电压从120一200V，

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电泳时间4一8h，经过多次垂直电泳实验来选取最佳实验条件。

(4)变性剂浓度梯度组成:

变性剂浓度10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

甲酞胺(ml) 40

尿素(g) 42

4 8 4.2 8.4 12 16 12.6 16.8 20 24 21 25.2 28 32 29.4 33.6 36 37.8 6