分子诊断与治疗杂志２０１０年３月第２卷第２期Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ，Ｍａｒｃｈ ２０１０，Ｖｏ１．２ Ｎｏ．２ 论实时荧光定量ＰＣＲ检测大鼠ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ方法的建 立及初步应用 李茜’韩曼丽 杨学文 高峰 詹臻 【摘要】 目的建立大鼠血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）实时荧光定 量ＰＣＲ检测方法，对健康大鼠不同组织中ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ水平进行检测分析。 方法跨内含子设计引物和 ＴａｑＭａｎ探针，扩增片段ＴＡ克隆入ｐＧＥＭ—Ｔ载体，制成标准品，分析其特异性、灵敏性和重复性；提取健康大 鼠不同部位组织（肺、心、肝脏、肾脏、脑、胃、肠和颌下腺）总ＲＮＡ，分析其ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表达水平。结果 测序及电泳条带证实ＰＣＲ反应的特异性，批内ＣＶ为２．０％～６．７％，批间ＣＶ值为３．５％～１０．６％，ｒ＞０．９９；肺组织 中ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达最高，与其他任意组相比差异均具有统计学意义（Ｊ凸＜０．０５），其它各组织间差异无统计 学意义。 结论 本研究成功建立了检测大鼠ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ的实时荧光定量ＰＣＲ方法，具有高灵敏、高特 异、高重复性的特点；健康大鼠不同部位组织中ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ的表达水平分析为以后研究疾病大鼠模型表 达水平奠定了基础。 【关键词】 实时荧光定量ＰＣＲ；血管内皮生长因子；大鼠 Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ ｉｎ ｒａｔ ＬＩ Ｑｉａｎ ，ＨＡＮ Ｍａｎｌｉ ，ＹＡＮＧ Ｘｕｅｗｅｎ。 ，，ＧＡＯ Ｆｅｎｇ ，ＺＨＡＮ Ｚｈｅｎ’ （１．Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００４６，Ｃｈｉｎａ；２．Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００２９，Ｃｈｉｎａ） 【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｕｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ Ｏｆ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ ｆｒｏｍ ｖａｒｉｏｕｓ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ ａｄｕｉｔ ｒａｔｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｗｈｉｃｈ ｓｐａｎｎｅｄ ｔｗｏ ｅｘｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｔｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＥＭ—Ｔ ｂｙ ＴＡ ｌｉｇｅｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｔ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｔｈｅｎ，ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｙｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｙｔ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｙｔ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｏｔａｌ ＲＮＡｓ ｆｒｏｍ ｎｏｒｍａｌ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｉｓｓｕｅｓ（１ｕｎｇ，ｈｅａｒｔ， ｌｉｖｅｒ，ｋｉｄｎｅｙ，ｂｒａｉｎ，ｓｔｏｍａｃｈ，ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ａｎｄ ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ ｇｌａｎｄ）ｏｆ １ ０ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ｑｕａｎｔｉｉｆｅｄ ｕｆｒ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆＶＥＧＦ ｇｅｎｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ．ＣＶ ｗｉｔｈｉｎ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ２．０％～６．７％ａｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ３．５％～１０．６％．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｉｆｃｉｅｎｔ（ｒ）ｗａｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ０．９９．ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｌｕｎｇ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ（Ｐ＜０．ｏ５）．ｗｈｉｌｅ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｏｔｈｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＶＥＧＦ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｙｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｙｔ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＶＥＧＦ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｖａｒｉｏｕｓ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ ａｄｕｌｔ ｒａｔｓ ｌａｉｄ ａ ｇｏｏｄ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｕｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｉｎ ｄｅｐｔｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆＶＥＧＦ ｇｅｎｅ ｏｆｕｎｈｅａｌｔｈｙ ｒａｔｓ． 【ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ】Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ；Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；Ｒａｔ 作者单位：１．南京中医药大学，江苏，南京２１００４６ ２．南京市中医院检验科，江苏，南京２１０００１ ３．江苏省中医院检验科，江苏，南京２１００２９ 。通讯作者：杨学文，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｘｗ１９６８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；詹臻．Ｅ—ｍａｄ：ｚｈａｎｚｈａｎ５６０７＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 著 ・１１６・ 分子诊断与治疗杂志２０１０年３月第２卷第２期Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ，Ｍａｒｃｈ２０１０，Ｖｏ１．２ Ｎｏ．２ ＶＥＧＦ是其中功能最强大的促血管生成因子…。本 文采用Ｔａｑｍａｎ技术建立一种检测大鼠组织中ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表达情况的实时定量ＰＣＲ方法，现报告如下。 １材料与方法 逆转录试剂、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ购自大连ＴａＫａＲａ公司，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。引物、探针委托由 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。扩增仪为美国ＡＢＩ ７５００，高速 冷冻离心机为德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１７Ｒ，紫外 可见分光光度计为Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ。 １．３ ＰＣＲ引物、探针的设计 １．１实验动物 健康清洁级成年ＳＤ大鼠，雌雄各５只，由江苏省 中医院动物中心提供（动物许可证号：ＳＣ×Ｋ（苏） ２００２．０１２３） 根据ＧｅｎＢａｎｋ提供Ｒａｔ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ序列 （ＡＹ７０２９７２），采用Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２．０软件进行引物 和探针设计，经Ｂｌａｓｔ验证；ＧＡＰＤＨ参照文献 合成。 １．２主要试剂和仪器 探针５’端标记ＦＡＭ荧光报告基团，３’端标记ＴＡＭＲＡ Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，反转录酶Ｍ．ＭＬＶ等 荧光淬灭基团。序列如表１。 表１目的基因和内参基因的引物、探针序列 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ １．４标准品的构建 补足２５ ｇＬ；反应条件为９４。Ｃ预变性２ ｍｉｎ，９４ ｏＣ ＰＣＲ产物纯化后与ｐＧＥＭ．Ｔ载体连接，构建重组 １５ Ｓ、６４。Ｃ ３５ Ｓ扩增４０个循环，７２。Ｃ ５ ｍｉｎ，６４ ｏＣ ３５ Ｓ 质粒，测序，序列比对正确后提取质粒，纯化并定量， 读取荧光。ＧＡＰＤＨ的扩增参见文献报道。 稀释为６．６ｘ１０ 、６．６ｘ１０ 、６．６ｘ１０ 、６．６ｘ】０ ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬ四 １＿７方法学评价 个梯度作为标准品。 １＿７．１特异性：标本进行ＰＣＲ检测，每次均设阴性和 １．５标本制备 内参对照，扩增产物经电泳和测序鉴定。 取大鼠的肺、心、肝脏、肾脏、脑、胃、肠和颌下腺八 １．７．２线形范围：将质粒按１０倍浓度梯度（６．６×１０ 、 种不同部位组织约５０～１００ｍｇ氮中充分研碎后加入 ６．６Ｘ１０ 、６．６×１０ 、６．６×１０ 、６．６×１０ 、６．６Ｘ１０ 、６．６×１０’、 １ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ，经氯仿萃取、异丙醇沉淀、乙醇洗涤后加入 ６ ６ｘ１０。ｃｏｐｉｅｓ／ｇＬ）稀释，每个浓度作为模板进行ＰＣＲ ３０ ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ，紫外分光光度计检测ＲＮＡ的 检测，分析扩增曲线得到相关曲线。根据ｒ＞Ｏ．９９的原 纯度和浓度。根据公式［总ＲＮＡ（￣ｔｇ／ｍＬ）＝ＯＤ ×稀释 则分析线形范围。 倍数ｘ４０￣ｔｅｄｍＬ］计算ＲＮＡ的浓度，取总ＲＮＡ２ ｇｇ进行 １＿７．３重复性：批内重复性是一次实验取６．６×１０’、 逆转录。采用二步法：①模板总ＲＮＡ ２ ｇｇ，５０ ｐｍｏｌ／￣ｔＬ ６．６×１０ 、６．６ｘ１０ 三个梯度重复检测ｌ０次，计算ＣＶ值； Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８ １ ，补ＤＥＰＣ水至１２ ；７０。Ｃ ５ ｍｉｎ，冰 批问重复性是连续十次对６．６×１Ｏ 、６．６×１０５ ６．６ｘ１０ 三 上急冷５ ｍｉｎ。②５×ＲＴ ｂｕｆｆｅｒ ４ ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ 个梯度样本进行检测，计算ＣＶ值。 １ ｇＬ，４００Ｕ／ｇＬＲｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２００Ｕ，２００ Ｕ／ＵＬＭ－ＭＬＶ １．８结果处理及统计学分析 酶２００ Ｕ，补ＤＥＰＣ水至２０ ｕＬ；４２。Ｃ ６０ ｍｉｎ，８５。Ｃ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ拷贝数除以相应的ＧＡＰＤＨ拷贝 ５ ｍｉｎ。ｅＤＮＡ置一２０ ＤＣ保存备用。 数，得到ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ相对表达量。在不同大鼠相同 １．６ ＰＣＲ反应体系及条件 部位组织中表达水平用 表示，以均数最小的组别 ＶＥＧＦ扩增的反应体系为１０ｘＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ ｇＬ， 作为１标准化处理，得出其他组别的相对比值，用 １０ ｍＭ ｄＮＴＰ Ｏ．５ Ｌ，２５ ｍＭ ＭｇＣ１２ １．５ Ｌ，１０ ｍＭ ＳＰＳＳ１３．０软件对数据进行统计学处理，单样本均数比 Ｐｒｉｍｅ各０．２５ ｇＬ，１０ ｍＭ Ｐｒｏｂｅ ０．２５ ｇＬ，５０ｘＲＯｘｄｙｅ ｌ１ 较用ｆ检验，多组间均数比较用方差分析，两两比较用 ０．５ ｐＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶１．２５ Ｕ，ｅＤＮＡ ２ ｇＬ，去离子水 ＳＮＫ分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 分子诊断与治疗杂志２０１０年３月第２卷第２期Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ，Ｍａｒｃｈ ２０１０，Ｖｏ１．２ Ｎｏ．２ ・ｌｌ７・ ２结果 ２．１ ＲＮＡ纯度、完整性和浓度 提取总ＲＮＡ ＯＤ 们 。均在１．８－２．０之间，电泳显示 清晰的２８Ｓ和１８Ｓ条带，且２８Ｓ的量约为１８Ｓ的两倍 （见图１）。 图１ ＲＮＡ电泳图 Ｆｉｇｕｒｅ １ ＲＮＡ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２．２ ＰＣＲ反应特异性 将实时荧光定量ＰＣＲ的扩增产物取５ ｕＬ经 １５ ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳，结果显示ＶＥＧＦ、扩增产物片 段为１１０ ｂｐ，片段分子量大小与理论预期值完全一致 （见图２）。ＶＥＧＦ产物经ＴＡ克隆后测序（见图３），测 序结果与原始序列吻合。 １００ ｂｐ ２５０ ｂｐ ５００ ｂｐ ７５０ ｂｐ １０００ ｂｐ 图２ ＶＥＧＦ ＰＣＲ电泳图 Ｆｉｇｕｒｅ ２ ＶＥＧＦ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ 图３ ＶＥＧＦ测序图 Ｆｉｇｕｒｅ ３ ＶＥＧＦ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔ ２．３ ＶＥＧＦ检测线形范围 当模板浓度在６．６×１０ 至６．６×１０ 之间，线形范围 相关系数ｚ＝０．９９８（见图４），扩增曲线斜率为．３．２７。而 当模板浓度低至６．６ ｃｏｐｉｅｓ／￣ｔＬ时，ＰＣＲ检测结果不稳 定，因此确定该方法检测下限为６．６￣１０ ｃｏｐｉｅｓ／ｇＬ。 －● － １。 ‘ ， ｌ ｌ ｌ图４ ＶＥＧＦ不同浓度梯度反应相关曲线 Ｆｉｇｕｒｅ ４ ＶＥＧＦ ｌｏｇ・ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ２．４ ＰＣＲ反应重复性 根据拷贝数求得批内差异的变异系数（ｃｖ）分别 为２．０％、４．９％、６．７％。扩增曲线见图５。批间变异系 数（ｃＶ）分别为３．５％、７－２％、１０．６％。 图５ ＶＥＧＦ批内重复性检测扩增曲线 Ｆｉｇｕｒｅ ５ ＶＥＧＦ ｉｎｔｅｒ－ａｓｓａｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ２．５大鼠不同组织ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表达水平 各组内差异经ｆ检验无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。组 间差异具有统计学意义，Ｆ－－５６．１５６，Ｐ＜０．０１。两两比 较ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ在肺脏组织中表达最高，与其他任意 组相比差异均具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；在其他任两 组中表达差异均无统计学意义（ ０．０５）。在不同部 位组织中的表达水平依次为肺、心、脑、肝脏、肾脏、颌 下腺、胃和肠（见表２、图６）。 ３讨论 以往对基因表达的研究常采用分子杂交和常规 ＲＴ－ＰＣＲ等半定量的方法，其定量的准确性不足，变异 也比较大，进而对研究结论的可靠性有一定的影响。 近年来随着ＰＣＲ技术的发展，实时荧光定量ＰＣＲ技 术广泛用于基因的定量分析，其定量分析的准确度和 灵敏度均远高于以前的方法。本研究建立的检测大 鼠组织中ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ的实时荧光定量ＰＣＲ方法国 ・１ｌ８－ 分子诊断与治疗杂志２０１０年３月第２卷第２期Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ，Ｍａｒｃｈ２０１０，Ｖｏ１．２ Ｎｏ．２ 表２各大鼠组织中ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ相对表达量及相对标准化 Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｄａｔａ ｓｈｏｗｉｎｇ ｌｅｖｅｌ ＶＥＧＦｍＲＮＡ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｇａｎｓ 持都起着关键作用。另外，在心脏、大脑、肝脏、肾脏 中表达低于肺脏，与文献中 ｌ于艮道ＶＥＧＦ在成人肾脏、 肺脏、大脑内有较高和敏感的转录有差异，尚待进一 伽 伽 ¨ ∞ 们 ∞ 步证实。对健康大鼠不同部位组织ＶＥＧＦ表达分析， Ｍ．§ｖＥＧＦ耀对袭选苎Ｉｏａ 与其他组比较，Ｐ＜０．０５ 叠 鞠 肝赣下艨糖 肾 胃 心 分组 图６ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ在大鼠不同组织中的相对表达量 Ｆｉｇｕｒｅ ６ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｏｒｇａｎｓ 内尚未见报道。 实验数据的准确才能保证研究结论的可靠。反 应条件、扩增仪孔间差异、加样误差等均影响ＰＣＲ定 量结果的准确性，为此，我们在实验中采取了以下几 个措施：①优化实验条件 ，特别是Ｍｇ 的浓度；②在 ＰＣＲ反应体系中加人了参比荧光ＲＯ￣ｄｙｅ ＩＩ，我们的 预试验也表明，如不加ＲＯｘｄｙｅ ｌＩ，其结果的变异达 ２０％一５０％（数据未显示）；③引入内参基因，以避免不 同组织标本总ＲＮＡ不一致而影响各组织间目的基因 ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ的比较；④用测得的ｍＲＮＡ绝对量而不 是用以往文献［４，５１采用Ｃｔ值计算，使评价标准更为精 确。实验数据表明，通过采取以上措施，本文所建立 的检测ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ的实时荧光定量ＰＣＲ方法充分 保证了目的基因和内参扩增效率的一致，得到更为真 实的统计学数据和实验结论。 本文对健康大鼠不同部位组织（肺、心、肝脏、。肾 脏、脑、胃、肠和颌下腺）ＶＥＧＦ的表达量进行了检测分 析，实验结果表明ＶＥＧＦ在成年ＳＤ大鼠肺脏组织中 表达水平最高，提示该器官的血液灌注比较丰富，对 氧气浓度感受较敏感。Ｖｏｅｌｋｅｌ ＮＦ等 认为人体肺组 织中富含ＶＥＧＦ蛋白，由许多不同肺细胞产生并对其 产生应答，ＶＥＧＦ在肺脏的发育和成年肺脏功能的维 国内外尚未见报道。 许多病理过程都依赖于血管生成，特别是恶性肿瘤 和慢性炎症性疾病，有关ＶＥＧＦ与这些相关疾病的研究 有大量报道。但目前其具体作用机制尚需进一步阐释， 以其为靶ｔ 的治疗方案还待进一步研究，在走向临床实 验之前大量动物实验是必需的。我们成功建立了检测 大鼠组织中ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ表达的Ｒｅａ１．ｔｉｍｅ荧光定量ＰＣＲ 方法，敏感性高，特异性强，定量范围宽，重复性和稳定 性好。可有助于更好的理解与ＶＥＧＦ相关的血管生成， 帮助有关ＶＥＧＦ的进一步研究，也为以后研究在疾病大 鼠模型中表达水平奠定了基础。 参考文献 ［１】Ｐｅｔｅｒ Ｃ，Ｒａｋｅｓｈ Ｋ Ｊａｉｎ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃｎａｃｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，９（１４）：４０７—４０８． ［２】Ｔａｋａｓｈｉ Ｍ，Ｓｕｂｒｉｎａ Ｊ，Ｓｏｈｅｌ Ｚ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｕａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｎ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ Ｂｃｌ－２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔｓ［Ｊ］． Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００６，２３１：１０３４－１０３９． 【３］Ｃｏｂｂ Ｂ Ｄ，Ｃｌａｒｋｓｏｎ Ｊ Ｍ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｕｓｉｎｇ ｍｏｄｉｉｆｅｄ Ｔａｇｕｃｈｉ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９４，２２：３８０１－３８０５． ［４］李晓丽，邹雄，杨晓静，等．聚合酶链反应方法检测外周血 淋巴细ＨＬＡ—Ａ ｍＲＮＡ方法学的建立及在肾移植中的初步 应用【Ｊ］．中华检验医学杂志，２００６，２９（１２）：１０７４－１０７８． ［５】Ｓｖｅｎ Ｔｉｌｌｍａｎｎ Ｔ，Ｋｒｉｓｚｔｉｎａ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ＰＣＲ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｂｙ ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４７（４）：６５４－６６０． ［６］Ｖｏｅｌｋｅｌ Ｎ Ｖａｎｄｉｖｉｅｒ Ｒ ｗ Ｔｕｄｅｒ Ｒ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｌｔｍｇ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００６，２９０（２）：２０９－２２１。 【７】陈晓红．胎儿各器官和组织中ＶＥＧＦ转录丰度的研究【Ｊ】． 现代预防医学，２００６，３３（２）：２００．２０１． 作者简介 李茜，南京中医药大学２００７级硕士研究生；杨学文，主任 技师，南京中医药大学２００７级博士研究生，硕导；詹臻，女，教 授，博导。
