南京中医药大学学报2012年7月第28卷第4期 374一 j(1取N翘瞪NANJING ̄ITYOFTCMVd.28hb.4hd.2912 龙葵药材的质量评价研究 张彦华,钱大玮,唐于平 ,段金廒 (南京中医药大学江苏省方剂高技术研究重点实验室,江苏南京210046) 摘要:目的 建立龙葵药材的质量标准,并对市售龙葵药材进行质量分析与评价。方法 采用薄层色谱法对澳洲茄碱和澳洲 茄边碱进行定性鉴别;采用HPLC—ELSD法测定龙葵中上述2种生物碱的含量;采用《中华人民共和国药典》附录中相应测定 方法分析考察了水分、总灰分、酸不溶性灰分,浸出物含量。结果 1O批药材中澳洲茄碱和澳洲茄边碱含量范围分别为 0.005 ~0.048 ,0.006 ~0.053 、水分范围为7.25 ~11.2 、总灰分范围为1O.1 ~15.7 、酸不溶性范围为 0.499 ~2.o8 、浸出物范围为14.1 ~23.9 。结论 所建立的龙葵药材中澳洲茄碱、澳洲茄边碱的薄层鉴别及HPLC— ELSD含量测定方法准确、重现性好,可用于该药材的质量控制。 关键词:龙葵药材;澳洲茄碱;澳洲茄边碱;TLC;HPLC;ELSD 中图号:R282.71 文献标志码:A 文章编号:1672—0482(2012)04—0374—04 Quality Evaluation on Herba Solani Nigri ZHANG Yan—hua,QIAN Da—wei,TANG Yu—ping ,DUAN Jin—ao (J iangsu Key Laboratory for High Technology Research of TCM Formulae,Nanjing University of Chinese Medicine NanJing,210046,China) ABSTRACT:OBJECTIVE To establish quality evaluation methods and standardization for Salanum nigrum L.,and to analyze and estimate the quality of Salanum nigrum L.sold in markets.METHODS TLC was used to identify Solasonine and So— lamargine.while HPLC—ELSD method was utilized tO quantify the two alkaloids in Salanum nigrum L..And the contents of its moisture,total ash,acid-insoluble ash and extractive were determined by the method recorded in the appendix of Pharma f copoeia of People's Republic of China.RESULTS In 10 batches of the herbal samples,the content ranges of Solasonine and Solamargine were 0.005 ~O.048 and 0.006%n0.053 respectively.That of moisture in the herb was 7.25 ~11.2 , the total ash 10.1 ~15.7 ,the acid—insoluble ash 0.499 ~2.08 ,and the extractive 14.1 ~23.9 .c0NcLus10N The methods of TLC and HPLC-ELSD are accurate and of good reproduc i1ity,which can be used to establish the quality cri— teria of Salanum nigrum L. KEY W0RDS:Salanum nigrum L.;solasonine;solamargine;TLC;HPLC;ELSD 龙葵为茄科植物龙葵Salanum nigrum L.的干 龙葵中澳洲茄碱和澳洲茄边碱薄层鉴别的报道,曾 燥地上部分。性寒,味苦、微甘,有小毒。分布于全 有文献 采用HPLC—DAD法测定其有效成分澳洲 国各地,具有清解热毒,消肿散结,消炎利尿的功效, 茄碱和澳洲茄边碱的含量,由于澳洲茄碱和澳洲茄 用于疮疖肿痛,尿路感染,小便不利,肿瘤[】]。曾收 边碱只在紫外末端波长处有吸收,且含量较低,该分 载于《中华人民共和国药典))1977年版一部中,该版 析方法存在干扰大、基线不稳等缺点。本文建立了 药典中收载的龙葵标准仅有性状鉴别一项,对于龙 龙葵中2个生物碱的薄层鉴别方法并采用HPLC— 葵的其他指标未进行控制。近年来因其所含生物碱 ELSD方法进行含量测定,通过样品前处理方法的 的抗癌活性l2 ]而日益成为研究的热点,并引起国内 优化,使含量较低的澳洲茄碱和澳洲茄边碱在确定 外学者的广泛关注。研究发现,澳洲茄碱和澳洲茄 的分析条件下,分离良好、基线平稳、待测成分无干 边碱是其主要抗癌活性成分 ]。目前笔者未见关于 扰。同时采用所建立的鉴别、含量测定方法及药典 收稿日期:2011一O5—07:修稿日期:2011-08—25 基金项目:国家药典委员 ̄(YS-135);教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET一09—0163);江苏省高校优秀科技创新团[ ̄(2009);江苏高 校优势学科建设工程资助项目(YSXK一2010) 作者简介:张彦华(1982一),女,河北行唐人,南京中医药大学2007级硕士研究生。*通信作者:yupingtang@njutcm.edu.cn 张彦华,等:龙葵药材的质量评价研究第4期 375一 规定的水分、灰分、浸出物检查方法,对安徽、山东、 部位,再用75 乙醇150 mL洗脱,收集洗脱液,蒸 江西、河南、河北5省1O批龙葵药材进行了综合质 干,残渣加甲醇5 mL使溶解,溶液加于中性氧化铝 量分析与评价,为了解与控制市售龙葵药材的质量 柱(100~120目,5 g,内径i5 mm,用甲醇湿法装 提供了科学依据。 ‘ 柱)上,用甲醇150 mL洗脱,弃去甲醇部位,再用 1 材料 85 甲醇150 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加 Waters 2695高效液相色谱仪,Waters 2424 甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。 ELSD检测器;BT一125D电子分析天平;硅胶G薄 2.1.3鉴别结果 层板(青岛海洋化工厂分厂,080214,规格:200 mm 照薄层色谱法(附录ⅥB)试验,吸取上述3种 ×200 mm;厚度:0.20~0.25 mm,活度:三色分 溶液各3 L,分别点于同一硅胶G板上,以乙酸乙 开);KQ一250E型超声波清洗器(工作频率40 kHz); 酯一甲醇一浓氨试液(2:9:1)为展开剂,展开,取出, EPED超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公 晾干,喷以改良碘化铋钾试液,晾干,日光下检视。 司)。 供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相 澳洲茄碱、澳洲茄边碱对照品由江苏中康药物 同颜色的斑点。采集的10批次样品,按确定的 科技有限公司丁岗博士赠送,纯度大于98 (HPLC TLC方法进行分析,结果见图1。 归一化法分析);乙腈(色谱纯,美国TEDIA公司); 甲醇(色谱纯,江苏汉邦科技有限公司);三乙胺(分 析纯,国药集团化学试剂有限公司);超纯水,实验室 自制。 10批龙葵药材经南京中医药大学中药鉴定教 研室乐巍博士鉴定均为茄科植物龙葵Salanum ni— grum L.的干燥地上部分,见表1。 表1 10批不同产地的龙葵药材样品 Sl_澳洲茄碱;S2.澳洲茄边碱;1~10为10批龙葵药材 图1 10批龙葵药材薄层色谱图 2.2常规项目检查 2.2.1水分测定 照《中华人民共和国药典》2005年版一部水分 测定法(附录ⅨH)测定表1样品,结果见表2。 2.2.2 总灰分及酸不溶性灰分测定 参照《中华人民共和国药典》2005年版一部灰 分测定法(附录Ix K)测定表1样品,结果见表2。 2.2.3浸出物测定 参照《中华人民共和国药典》2005年版一部浸 2方法与结果 出物测定(附录X A)项下的热浸法测定10批样品 2.1薄层鉴别 的浸出物,以稀乙醇作溶剂,结果见表2。 2.1.1对照品溶液制备 2.3澳洲茄碱、澳洲茄边碱的含量测定 分别以甲醇配制1 mL含1 mg澳洲茄碱、澳洲 2.3.1 色谱条件 茄边碱的对照品溶液。 色谱柱:Alhima C18(4.6 1Tim×250 mm,5 2.1.2供试品溶液制备 m);流动相:0.02 三乙胺乙腈一水(38:62);流 取本品粉末15 g,加75 甲醇150 mL,加热回 速:1.0 mL/min;ELSD条件:气体压力30 psi,漂移 流1 h,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加水10 mL使溶 管温度7O℃,喷雾器温度36℃。此条件下样品中 解,通过D101型大孔吸附树脂(10 g,500 mm×20 的澳洲茄碱和澳洲茄边碱可以达到良好的分离,结 mm)柱,以3O 乙醇150 mL洗脱,弃去3O 乙醇 果见图2。 南京中医药大学学报2012年7月第28鲞箜 塑 0们 0。8∞10∞12∞¨肿 ∞1e 0o 20 0。≈ o0 20o 4 00 e 0o 。吣 10 0o 12∞哪 1●o0 16 o0 1日0o∞瑚22OO A B A.对照品;B.龙葵药材样品;1.澳洲茄碱;2.澳洲茄边碱 图2龙葵药材澳洲茄碱和澳洲茄边碱含量测定HPLC图谱 2.3.2对照品溶液制备 次,每次5 L,计算其峰面积的RSD值,澳洲茄碱 为4.2 9/6,澳洲茄边碱为4.7 。 2.3.7重复性试验 精密称取澳洲茄碱、澳洲茄边碱对照品,甲醇溶 解,配制成每1 mL含澳洲茄碱0.376 mg、澳洲茄边 碱0.350 mg的对照品溶液。 取5号龙葵药材6份,按“2.3.3”项下确定的方 2.3.3供试品溶液制备 取本品粉末约6 g,精密称定,置具塞锥形瓶中, 精密加入75 甲醇100 mL,称定质量,超声提取1 h,再称定质量,用75 甲醇补足减失的质量,静置, 法制备供试品溶液,依法测定,样品中澳洲茄碱的平 均含量为0.068 9 mg/g,RSD为4.7 9/6,澳洲茄边碱 的平均含量为0.085 6 mg/g,RSD为4.1 。 2.3.8稳定性试验 精密吸取上清液5O mL,水浴蒸干,残渣加5 mL水 溶解,通过D101大孔吸附树脂柱(10 g,500 mm× 2O ram),静置1 h,以水5O mL洗脱,弃去水液,再用 15 乙醇5O mL洗脱,弃去洗脱液,继用75 乙醇 50 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣用甲醇溶解并 转移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取 续滤液,即得。 取同一份供试品溶液,分别在0、2、4、6、8 h进 样,依法测定,澳洲茄碱峰面积的RSD为4.2 ,澳 洲茄边碱峰面积的RSD为2.4 ,说明供试品溶液 中澳洲茄碱和澳洲茄边碱在8 h内稳定。 2.3.9回收率试验 称取5号龙葵药材粉末6份,每份3.0 g,精密 称定,分别精确加入含澳洲茄碱0.212 mg/mL和澳 2.3.4线性关系考察 精密吸取“2.3.2”项下对照品溶液2.0、5.0、 10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 L注入液相色谱仪, 测定峰面积。分别以澳洲茄碱和澳洲茄边碱量的对 数为横坐标,峰面积的对数为纵坐标,绘制标准曲 线,澳洲茄碱回归方程为:Y一1.29X+8.66(r一 0.998 8),澳洲茄边碱回归方程为:Y一1.41X+ 洲茄边碱0.258 mg/mL的对照品溶液1 mL,按“2. 3.3”项下的方法操作,依法测定,澳洲茄碱的平均回 收率为9O.34 ,RSD为4.83 ,澳洲茄边碱的平 均回收率为91.5O ,RSD为4.67 。 2.3.10样品含量测定 采集的10批龙葵药材,按“2.3.3”项下的方法 操作,制备供试品溶液,分别吸取供试品溶液各10 5.63(r一0.999 4),结果表明,澳洲茄碱在0.752~ 11.28 g和澳洲茄边碱在0.700 ̄10.50 g范围内 线性关系良好。 L,注入液相色谱仪,依法测定,测定结果见表2。 3讨论 3.1薄层鉴别用样品制备方法的优化 样品提取后直接点样,2种生物碱斑点不明显, 有明显干扰。单独经过大孔树脂或中性氧化铝处理 2.3.5检测限及定量限的考察 将对照品混合溶液进行稀释并进行分析,当信 噪比为10时,测得澳洲茄碱和澳洲茄边碱的定量 限,分别为381.0 ng和328.8 ng,当信噪比为3时, 测得澳洲茄碱和澳洲茄边碱的检测限,分别为63.5 ng和54.8 ng。 斑点仍有干扰,同时经大孑L树脂与中性氧化铝处理 后所得供试品溶液2种生物碱的斑点清晰、圆整,干 扰少。 3.2含量测定条件的优化 3.2.1 UV检测器与ELSD检测器的选择 澳洲茄碱与澳洲茄边碱为末端吸收(195 nm), 2.3.6精密度试验 取“2.3.2”项下混合对照品溶液,重复进样6 张彦华,等:龙葵药材的质量评价研究第4期 一377一 受流动相影响较大,基线不够理想。比较了UV 当采用ELSD检测器时,基线平稳,干扰峰较少,因 (195 nm)检测器及ELSD检测器对龙葵中澳洲茄 此确定采用ELSD检测器。 碱与澳洲茄边碱测定色谱行为的影响。结果显示, 。 。 一量一含一分一水一 趴 & & ∞ ¨ 3.2.2流动相的选择 参考文献: 有文献报道测定澳洲茄碱和澳洲茄边碱含量采 [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部Is].北京:人民卫 用磷酸氢二钠或磷酸氢二钾调节流动相的pH 生出版社,I978:154. 值_7],若采用ELSD检测器,不能采用挥发性较差 Chinese pharmacopoeia commission.Pharmacopoeia of people S republic of China[S].Beijing:People S medical publishing 的酸氢二钠或磷酸氢二钾,故选择挥发性较强的三 house,1978:154. 乙胺。乙腈较甲醇出峰时间早且分离效果好,故选 [2]Son YO,Kim J,Liar jc,et a1.Ripe fruits of Solanum nigrum 择乙腈一三乙胺一水为流动相。 L.inhibit cell growth and induces apoptosis in MCF一7 cell[J]. 3.2.3供试品溶液制备方法的优化 Food Chem Toxicol,2003,41(10):1421—1428. 比较了超声提取与回流提取2种提取方法,以 [3]谢启梅,谢军荣.龙葵在肿瘤治疗中的运用[J].江西中医药, 1996,27(2):52-53. 澳洲茄碱和澳洲茄边碱测定量为指标,超声提取与 Xie QM,Xie JR.Application of Solanum nigrurn in treating 回流提取无显著差异,选择超声提取;比较了25 、 tumor[J].Jiangxi J Tradit Chin Med,1996,27(2):52—53. 50 、75 甲醇3种提取溶媒的提取效果,显示 [4]赵晓琴,曾祥法.龙葵片对原发性肝癌治疗作用的l临床研究[J]. 75 9,6甲醇提取澳洲茄碱和澳洲茄边碱含量最高;比 辽宁中医杂志,2002,11(29):671—672. 较了龙葵药材甲醇提取直接进样和提取后再经 Zhao XQ,Zeng XF.Clinical study on the therapeutical effect of Solanum nigrum on primary liver cancer[J].Liaoning J Tradit D101大孔吸附树脂去杂2种方法,发现不经大孔吸 Chin Med,2002,11(29):671—672. 附树脂去杂,液相色谱图中澳洲茄碱和澳洲茄边碱 [5]潘伟光,刘宗潮,潘启超,等.中药复方龙葵合剂在动物体内外的 峰附近有干扰,且基线不平稳;进而比较了大孔树脂 抗癌药效[J].癌症,1996,15(6):438—440. 上样浸泡时间、洗脱溶剂及用量,最终确定了供试品 Pan WG,Liu ZH,Pan QC,et a1.Study on the anticancer effect 溶液的制备方法。 of Chinese herbal compound—Solanum nigrum Mixture in vitro 3.3结论 and in vivoI-J].Chin J Cancer,1996。15(6):438—440 [6]刘为为,刘延庆,戴小军.龙葵抗肿瘤作用的研究进展[J].中药 研究表明市售各批药材中澳洲茄碱和澳洲茄边 材,2009,32(3):462—465. 碱的含量差异较大,这可能与生物遗传因素和生态 Liu WW,Liu YQ,Dai XJ.The progress study on the antican— 环境影响所致的次生代谢产物的合成和积累不同有 cer effect of Solanum nigrum[J].J Chin Med Mater,2009,32 关,其含量差异与生物效应变化的相关性需要进一 (3):462-465. 步深入研究以阐明。市场流通的龙葵药材亟待要求 [7]李明慧,丁岗,孟兆青,等.龙葵药材中澳洲茄碱、澳洲茄边碱的 含量测定[J].中国天然药物,2007,5(5):360—362. 规范统一,如统一栽培、采收等,需引起相关方面的 Li MH,Ding G,Meng ZQ,et a1.Content determination of So— 重视,以保证龙葵药材的质量及临床疗效,因此建立 lasonine and Solamargine in Solanurn nigrum[J].Chin J Nat 龙葵药材的质量标准具有重要意义。 (编辑:李伟东)