郭映辉;何宝花;王颖童;贾肇一;王茜;李贵霞;张文超;孙印旗;陈素良
【摘 要】Objective To type Streptococcus pneumoniae(S.pneumoniae) isolated from children, and provide scientific basis for the correct selection of S.pneumoniae vaccine.Methods 182 strains of S.pneumoniae were collected from Children's Hospital of Hebei Province in 2014, species of strains were identified by polymerase chain reaction (PCR), types of strains were analyzed with multiplex PCR.Results PCR detection showed that cpsA gene amplification of 182 strains were all positive;multiplex PCR detection revealed that except 8 strains were not typed, the main types of the remaining 174 strains were 19 F (n=68, 37.36%), 19A(n=33, 18.13%), and 6A/6B (n=26,14.28%), the other types were 35B, 14, 6C/6D, 23F, 15B/15C, and so on.Conclusion The main types of 182 strains of S.pneumoniae are 19 F, 19A, and 6A/6B, which provide scientific basis for the correct selection of S.pneumoniae vaccine for this province.%目的 对来自患儿的肺炎链球菌进行分型,为肺炎链球菌疫苗的正确选择提供科学依据.方法 收集2014年来自河北省儿童医院的182株肺炎链球菌,普通PCR对肺炎链球菌进行种属鉴定,应用多重PCR方法对菌株进行菌型分析.结果 经PCR检测182株菌的cpsA基因扩增均为阳性;经多重PCR检测,除8株未分型菌株外,其余174株肺炎链球菌中,以19F、19A和6A/6B型数量最多,分别为68株(37.36%)、33株(18.13%)和26株(14.28%),其余型别有35B型、14型、6C/6D型、23F型、15B/15C型等.结论 182株肺炎链球菌的菌型主要为19F、19A和6A/6B,为该省肺炎链球菌疫苗的正确选择和制订使用策略提供了科学依据.
【期刊名称】《中国感染控制杂志》 【年(卷),期】2017(016)004 【总页数】4页(P326-329)
【关键词】肺炎链球菌;多重PCR;菌型鉴定;种属鉴定;cps基因
【作 者】郭映辉;何宝花;王颖童;贾肇一;王茜;李贵霞;张文超;孙印旗;陈素良 【作者单位】河北省儿童医院,河北石家庄 050031;河北省疾病预防控制中心,河北石家庄 050021;河北省疾病预防控制中心,河北石家庄 050021;河北省疾病预防控制中心,河北石家庄 050021;河北省疾病预防控制中心,河北石家庄 050021;河北省儿童医院,河北石家庄 050031;河北省儿童医院,河北石家庄 050031;河北省疾病预防控制中心,河北石家庄 050021;河北省疾病预防控制中心,河北石家庄 050021 【正文语种】中 文
【中图分类】R181.3+2;R378.1+2
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, Sp)感染是重要的全球性疾病，可引起肺炎、婴幼儿急性化脓性中耳炎和细菌性脑膜炎，每年全球至少有100万左右5岁以下的儿童死于肺炎链球菌相关疾病，2岁以下儿童受到的危害更严重[1]。由于肺炎链球菌的高发病率和致死率，其疫苗推广十分重要，但目前疫苗的保护范围有限，无法覆盖所有菌型。因此，为正确和有效地免疫儿童，迫切需要了解肺炎链球菌菌型种类及其分布情况。
荚膜是肺炎链球菌最主要的致病因子，其生成主要由荚膜合成基因簇(cps)调控，该基因几乎存在于所有肺炎链球菌中，且高度保守，本研究中用于鉴定肺炎链球菌的cpsA引物以及用于分型的引物大多来自cps基因簇，且大多经Southen印迹
实验的检验[2]。基于PCR技术的分子鉴定及分型方法敏感性高，操作简便，成本较低，已经成为肺炎链球菌血清分型的首选方法。世界卫生组织(WHO)手册在关于流行性脑膜炎、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌引起的脑膜炎诊断方法一节介绍了肺炎链球菌的PCR分型方法[3]。本研究利用分子生物学方法对2014年河北省儿童医院分离的182株来自儿童患者的肺炎链球菌进行分型，初步了解该省儿童患者致病性肺炎链球菌菌型特点，科学评价该省现行的肺炎链球菌疫苗使用策略，为肺炎链球菌疫苗的正确选择提供科学依据。 1.1 材料
1.1.1 菌株来源 2014年河北省儿童医院对临床诊断为大叶性肺炎、气管炎、中耳炎、胸膜炎、心内膜炎及败血症等病例进行相关标本采集，标本经初步生化鉴定共分离182株肺炎链球菌，全部纳入研究。菌株分离自痰、血、脑脊液、肺泡灌洗液、臀部脓肿穿刺液、胸腔积液、气管内分泌物、眼分泌物和关节腔脓液等标本，所有菌株均分离自8岁以下儿童，其中150株来自2岁以下儿童。
1.1.2 仪器与试剂 哥伦比亚血琼脂培养基购自广州市迪景微生物科技有限公司，PCR Premix体系、DNA Marker购自大连宝生物工程公司，引物由北京华大基因公司合成。9700型普通PCR仪为美国ABI公司生产，5417型离心机为德国Eppendorf公司生产，1285型生物安全柜为美国Thermo公司生产，MCO-18AIC型CO2培养箱为日本三洋公司生产，164-5050型电泳仪为美国伯乐公司生产，G Box F3型紫外凝胶成像仪为英国Syngene公司生产。 1.2 方法
1.2.1 DNA模板的制备 将收集的菌株接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，置CO2培养箱中，在5% CO2、35 ℃条件下培养18～20 h。挑取一定量的新鲜培养物，悬浮于200 μL超纯水中，涡旋振荡，沸水浴20 min后，12 000 r/min离心5 min，吸取上清液制备菌株DNA模板，-20 ℃保存备用。
1.2.2 菌株种属鉴定 对菌株进行种属特异性基因cpsA的普通PCR鉴定，引物序列cpsA-F：GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC，cpsA-R：GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC，反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环后72 ℃再延伸5 min。PCR扩增结束后，在浓度为1.0%琼脂糖中进行电泳，电压为5 V/cm，电泳1 h，紫外凝胶成像仪观察并采集图像。
1.2.3 多重PCR分型 分9个反应依次对待测样品进行PCR分型，每个反应均包括多对不同的血清型引物及作为内对照的cpsA引物，引物序列参照文献[3]报道，扩增条件：95 ℃预变性15 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，35个循环后72 ℃再延伸10 min，PCR扩增结束后，在浓度为1.0%琼脂糖中进行电泳，电压为5 V/cm，电泳1 h，紫外凝胶成像仪观察并采集图像。根据扩增片段长度，确定样品所属型别。引物分组见表1。
2.1 菌株种属鉴定结果 182株菌经PCR鉴定，cpsA基因均为阳性。
2.2 多重PCR分型检测结果 经多重PCR分型检测，19F、19A和6A/6B三种菌型所占比率最多，分别为37.36%、18.13%和14.28%。图1为部分菌株第3组多重PCR电泳图，菌株均在160 bp处有一条带，此条带为内参基因cpsA条带。菌株1和9在677 bp 处有一电泳条带，菌型为35B；菌株2～7和10在304 bp 处有一条带，菌型为19F；菌株8和11为阴性。图2为部分菌株第1组多重PCR电泳图，菌株均在160 bp处有一条带，菌株1在566 bp 处有一电泳条带，菌型为19A，菌株3在250 bp 处有一条带，菌型为6。其余菌株的型别为：35B型(9株)、14型(7株)、6C/6D型(6株)、23F型(6株)、15B/15C型(5株)、1型(4株)、24型(24A/24B/24F)(2株)、3型(2株)、7C/7B/40型(2株)、5型(1株)、12F/12A/44/46型(1株)、35A/35C/42型(1株)、15A/15F型(1株)；有8株菌不能分型。见表2。
肺炎链球菌是严重危害儿童和老年人身体健康的病原菌之一。目前已知的肺炎链球菌有90多个血清型/群，只有少部分血清型/群能够导致人群发病[4]，但能引起所有年龄组的高发病率和病死率，在世界范围内是一个严重的公共卫生问题[5]。 随着分子生物学的发展，各种分子生物学手段应用到病原微生物学的研究中，其中PCR方法是一种灵敏性高、操作简便、成本较低的方法，可广泛应用于肺炎链球菌的日常监测工作。荚膜是肺炎链球菌最主要的致病因子，而荚膜的产生主要是由荚膜合成基因簇(cps)调控的，它几乎存在于所有肺炎链球菌基因组中，用cpsA引物鉴定肺炎链球菌方便准确。目前，肺炎链球菌的血清学分布监测工作主要是对收集菌株进行培养及血清学鉴定，所用血清比较昂贵，结果解释对操作人员的经验要求较高，是血清学分群/型的主要缺点。世界卫生组织推荐的建立在PCR技术基础上的血清分型技术可以克服传统血清分群/型技术的不足，用于临床上一些不能直接用血清鉴定菌株的分型，以及对传统血清学分型方法不敏感菌株的检测[3, 6]，且无主观偏差，实验结果更可靠，操作便捷、省时，成本较低，该分型方法是以cpsA基因为靶基因，设计一系列引物，建立起来的检测血清型的多重PCR方法[7]。通过比较分析美国、巴西和南非等国家分离的菌株，证实多重PCR分型方法与传统的血清型方法具有良好的相关性[8-9]。但本研究中所采用的分子生物学方法鉴定肺炎链球菌种属及型别也存在一定的局限性，虽cpsA基因序列高度保守，但也有文献报道由于基因的缺失或突变导致极少数菌株不能扩增出cpsA基因[10]，但本研究中未发现类似情况。
肺炎链球菌的发病率及病死率较高，而疫苗的使用是一种有效的预防手段，目前全球较常见的肺炎链球菌疫苗有7价肺炎链球菌结合疫苗(PCV 7)、13价肺炎链球菌结合疫苗(PCV 13)和23价肺炎链球菌多糖疫苗(PPV 23)，疫苗的使用可以使肺炎链球菌相关疾病的发病率明显降低、呈现较高的保护力[11]。本研究中所用引物可鉴别肺炎链球菌1、3、4、5、6A/B、7A/F、9A/V、14、15A、18A/B/C/F、
19A、19F、23F等血清型/群，研究结果可为正确选择肺炎链球菌疫苗提供科学依据，但疫苗的长期使用会导致血清流行病学方面的变化[12-13]。近年来，非疫苗覆盖血清型/群肺炎链球菌感染病例逐渐增多，针对肺炎链球菌所开展的监测工作已经成为肺炎链球菌相关疾病预防控制工作的重要组成部分。目前全球范围内6C、6D 型肺炎链球菌导致的病例不断增多[14]，有研究发现现有疫苗对6C血清型菌株的侵袭没有保护性，本研究中有6株肺炎链球菌是6C/6D型，占3.30%，需要对此类菌型进行重点监测。以PCR技术为基础的分型方法能鉴定的肺炎链球菌血清型/群有一定局限性，如本试验中有8株肺炎链球菌未能分型，另外，一些分型引物为血清群特异性而非血清型特异性，如6A/6B引物阳性结果的菌株可能是血清型6A或血清型6B，这些需在以后研究中完善。
本研究利用分子生物学方法进行肺炎链球菌种属及菌型鉴定，为临床病原微生物的鉴定提供了一种快速、灵敏、客观和低成本的方法。目前，河北省关于肺炎链球菌菌型情况的相关报道较少，本研究中182株肺炎链球菌主要血清型为19F、19A和6A/6B，该结果丰富了该省儿童致病性肺炎链球菌的菌型资料，与我国其他地区的菌型结果基本一致[15-16]，目前现有的三种疫苗中，PCV13和PPV23均覆盖这三种血清型，为肺炎链球菌疫苗的正确选择和制订肺炎链球菌疫苗的使用策略提供了科学依据。
【相关文献】
[1] World Health Organization. Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization WHO position paper[J]．Wkly Epidemiol Rec, 2007, 82 (12): 93-104. [2] O’Halloran DM，Cafferkey MT．Multiplex PCR for identification of seven
Streptococcus pneumoniae serotypes targeted by a 7-valent conjugate vaccine[J]．J Clin Microbiol, 2005, 43(7): 3487-3490．
[3] World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus
influenzae[M]. 2nd, WHO Manual, 2011.
[4] Kyaw MH, Rose CE Jr, Fry AM, et al. The influence of chronic illnesses on the incidence of invasive pneumococcal disease in adults[J]. J Infect Dis, 2005, 192(3): 377-386. [5] O’Brien KL, Wolfson LJ, Watt JP, et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates[J]. Lancet, 2009, 374(9693): 893-902.
[6] Pai R, Gertz R, Beall B. Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(1): 124-131. [7] Iraurgui P, Torres MJ, Gandia A, et al. Modified sequential multiplex PCR for determining capsular serotypes of invasive pneumococci recovered from Seville[J]. Clin Microbiol Infect, 2010, 16(9): 1504-1507.
[8] Njanpop Lafourcade BM, Sanou O, van der Linden M, et al. Serotyping pneumococcal meningitis cases in the African meningitis belt by use of multiplex PCR with cerebrospinal fluid[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(2): 612-614.
[9] Dias CA, Teixeira LM, Carvalho Mda G, et al. Sequential multiplex PCR for determining capsular serotypes of pneumococci recovered from Brazilian children[J]. J Med Microbiol, 2007, 56(Pt 9): 1185-1188.
[10] Brito DA, Ramirez M, de Lencastre H, et al. Serotyping Streptococcus pneumoniae by multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6): 2378-2384．
[11] Camargo DR, Pais FS, Volpini C, et al. Revisiting molecular serotyping of Streptococcus pneumoniae[J]. BMC Genomics, 2015, 16(Suppl 5): S1.
[12] Pichon B, Ladhani SN, Slack MP, et al. Changes in molecular epidemiology of Streptococcus pneumoniae causing meningitis following introduction of pneumococcal conjugate vaccination in England and Wales[J]. J Clin Microbiol, 2013, 51(3): 820-827. [13] Rudolph K, Bruce MG, Bulkow L, et al. Molecular epidemiology of serotype 19A Streptococcus pneumoniae among invasive isolates from Alaska, 1986-2010[J]. Int J Circumpolar Health, 2013, 72: 20854.
[14] Nahm MH，Lin J，Finkelstein JA，et al．Increase in the prevalence of the newly discovered pneumococcal serotype 6C in the nasopharynx after introduction of pneumococcal conjugate vaccine[J]. J Infect Dis, 2009, 199(3): 320-325.
[15] 陈驰, 肖磊, 石继春, 等. 277株肺炎链球菌生物学鉴定及血清学分型结果分析[J].中国医药导刊, 2011, 13(10): 1774-1775.
[16] 钱婧, 薛莲, 谢贵林, 等. 171株儿童侵袭性肺炎链球菌血清分型和多位点序列分型研究[J].临床儿科杂志, 2012, 30(2):187-191.
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