中国鼠疫耶尔森菌多位点可变数目串联重复序列分析

在真核和原核生物基因组中,广泛存在着一些以一段相同或相似的核苷酸序列为重复单位(也称为核心序列),首尾相连重复的序列,被称为可变数目串联重复序列(Variable-number tandem repeat,VNTR)。它们在不同的个体之间由于重复数的不同,而造成生物的多态性。

目前,串联重复序列分析已经广泛地应用于细菌的分子流行病学调查、菌株鉴别、基因分型等方面。鼠疫耶尔森菌(以下简称为鼠疫菌)染色体基因组序列长度约为4.59～4.66Mb,编码4037～4198个开放读码结构(ORF),GC含量为47.6～50.0%。

除此之外,鼠疫菌还含有6MD(pPCP1)、45MD(pCD1)和65MD(pMT1)3个质粒,其中6MD和65MD质粒为鼠疫菌所特有,编码相关的致病基因和毒力决定因子。鼠疫菌基因组序列分析显示,在鼠疫菌基因组中存在着较大量的串联重复序列,而同一位点的串联重复序列在不同的鼠疫菌株间存在着多样性。

根据鼠疫菌的这一特点,试验选取了16个VNTR位点对我国各类鼠疫自然疫源地及生态型的213株鼠疫菌和1株EV菌进行了串联重复序列分析。通过PCR、琼脂糖凝胶电泳、分子量计算、测序和序列比对获得重复数,最后利用BioNumerics软件进行数据分析。

通过序列比对,发现在16个VNTR位点中,.有的位点的核心序列发生了突变,且突变具有一定的规律性,即突变位置固定,只发生置换或颠换而没有插入和缺失的发生。另外,我国鼠疫菌的重复数存在不连续的情况,并且有的位点某一种重复数的菌株只有1个(所有位点均没有出现重复数为15的情况)。

通过对所得16个VNTR位点多态性指数进行比较分析,将VNTR位点进行了优

化组合,确定了可用于鼠疫分子流行病学溯源调查的10个位点。基于10个VNTR位点的MLVA结果显示,214株鼠疫菌被分为14个群,74个MLVA型,说明我国鼠疫菌在遗传进化过程中的多样性和相对稳定性。

比较我国鼠疫菌的生态型和MLVA型,结果显示二者吻合较好,基本上建立了鼠疫菌生态型和MLVA型的有机联系,MLVA型进一步丰富和补充了鼠疫菌的生态型。同时,最小生成树提示了我国不同鼠疫自然疫源地的进化关系。

首次将MLVA结合现场流行病学调查对云南玉龙的突发鼠疫疫情进行了溯源分析,结果显示云南玉龙菌株16个VNTR位点的重复数完全相同,为同一MLVA型,提示它们来源于同一流行过程。聚类结果显示云南玉龙菌株与青藏高原型菌株的亲缘关系更为接近,为进一步确定当地潜在鼠疫疫源地的性质和感染来源提供了科学依据。