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高效制备液相色谱柱技术的研究进展

来源：爱够旅游网

第16卷第2期2004年3月

化　学　进　展

PROGRESSINCHEMISTRY

Vol.16No.2

　Mar.,2004

高效制备液相色谱柱技术的研究进展

李瑞萍　黄骏雄

(中国科学院生态环境研究中心　北京100085)

摘　要　本文概述了高效制备液相色谱柱的柱型结构、填料以及柱填充方法等研究的最新进展,讨论了

制备柱与分析柱的不同特征,对目前普遍使用的压缩型制备柱的类型、结构及填充方法作了较为全面的评述,总结比较了工业化制备色谱填料不同于分析色谱填料的特点,探讨了高效制备液相色谱柱技术的应用和发展前景。

关键词　高效制备液相色谱　制备柱　装柱技术　固定相中图分类号:O657.7　文献标识码:A　文章编号:10052281X(2004)0220273211

RecentProgressofColumnTechnologyinPreparative

HighPerformanceLiquidChromatography

LiRuiping　HuangJunxiong

(ResearchCenterforEco2EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China)Abstract　Recentprogressofthecolumntypes,packingmaterialsandpackingtechnologyinpreparativehighper2formanceliquidchromatographyinindustrialscalewasdescribed.Thedifferencesofcharacteristicsbetweenpreparativecolumnandanalyticalcolumnwerealsopresented.Varioustypes,structuresandpackingmethodsofcompressioncol2umnscommonlyusedinPHPLCinrecentyearswerecomprehensivelyreviewed.Thecriteriaofpackingmaterialsusedinindustrialpreparativechromatographywascomparedwithanalyticalchromatography.Perspectiveintheapplicationsanddevelopmentsofcolumntechnologywasalsodiscussed.

Keywords　preparativehighperformanceliquidchromatography;preparativecolumn;packingtechnology;packingmaterials

一、引　言

早在20世纪初出现的色谱分离技术目前已成为有机化学和生物化学中一项十分重要的分离与纯化技术。随着生物技术的迅猛发展,特别是重组DNA和杂交瘤技术的广泛应用,对于某些以生物活性大分子为主的重要生物制品和药剂(如标准蛋白质、干扰素、生长激素等),采用传统的分离技术如超离心、沉淀、萃取、超滤等往往达不到所需的纯度要求。人们在对高效的分离与纯化技术的探索中,将研究的重点转向了色谱法,进而促进了色谱分离技术的迅速发展,使得色谱分离在理论上从线性色谱

　　收稿:2003年3月,收修改稿:2003年6月3

通讯联系人　e2mail:junxionghuang@yahoo.com

发展到非线性色谱,在实践中从分析规模发展到制

[1]

备规模和生产规模。近十几年来,高效制备色谱(highperformancepreparativechromatography,HPPC)已成为当代高效分离与纯化技术的研究前沿。

制备色谱绝不是分析色谱的简单放大,它与分析色谱有许多不同之处,如表1所示。分析色谱需要全面反映样品组成的信息,不需要收集特定的馏分,洗脱液通常废弃;而制备色谱中,目标产物的纯度、产量、生产周期、运行成本等成为主要的考虑因素,因此制备色谱与分析色谱在操作参数的优化上有很大不同。制备色谱同分析色谱一样,色谱柱是其核心部件。传统的制备色谱采用简单的管状

[1,2,4]

[2,3]

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柱,填充大颗粒的无定形填料,因而柱效低、不稳定、

重现性差,而且应用洗脱展开(elutiondevelopment)技术又需要大量的流动相溶剂,导致收集馏分中产物浓度低、后处理工作量大等弊病,因此在很长一段时间里备受冷遇,发展缓慢。在近代制备色谱中,高效液相色谱(HPLC)发展最快,应用最广,由于篇幅,本文就高效制备液相色谱(preparativehighperfor2manceliquidchromatography,PHPLC)尤其是大型工业色谱柱的柱技术(columntechnology)在近年来的研究进展(不包括中低压制备LC)作一概述。

表1　分析型液相色谱与制备型液相色谱的比较

Table1　AcomparisonofanalyticalLCandpreparativeLC

basisofcomparisonpurpose

practicalobjective

analyticalLC

toobtainqualitativeorquantitativeinformationaboutsample

maximumpeakcapacity(#ofcomponentsseparatedormeasured

preparativeLC

toisolate,enrichorpurifysamplecomponents

maximumthroughput(amountofmaterialpurifiedPunittime)

Punittime)

samplesizeinjectionmodecolumnloadingflowrate

demandofseparation

<0.5mgbatchoperation

aslightaspossible;typicalrange:10-10—10-3gramofsample

semipreparative≤100mg　preparative0.1—100g　productive

≥0.1kg

batchoperation　continuousoperation

asheavyaspossible;typicalrange:0.001—0.1gramofsample

Pgramofpacking1.0mlPmin

Pgramofpacking

>10mlPmin

moderateresolutionissufficientcolumndiameter10—1600mm;largesphericalorirregularparti2

matchedtosophisticationofdetectiontechnique;baselinesepara2matchedtorequirementsforlevelofpurity&recovery;often,

tionistypical

μtypicalcolumncharac2columndiameter<5mm;smallsphericalparticles(3—10m);teristicsdetector

expensivepacking;excessseparationpowerrelativetoneed

μcles(10—20m);withanarrowparticlesizedistribution,eco2

nomicalpacking;separationpowermatchedtorequirements

required,oftenwithhighsensitivityandwidelineardynamicrangedesirable,toassayfractionson2oroff2line;extrarangeatlow

sensitivityandsuitabletolargefluxofmobilephase

dispositionofsampleusuallysampleisdiscardedalongwithmobilephasesamplefractionsarecollected;mobilephasemayberecyclednonlinearchromatography

fundamentalsoftheorylinearchromatography

作为合成、半合成工作的原料及标准品等,大规模工

二、高效制备色谱柱

现代高效制备液相色谱柱具有以下特征:(1)柱

长短、内径大、呈圆饼状(pancake)。目前高效制备柱的柱长与常规分析柱相仿,一般为20—50cm,远短于传统柱长1m甚至1m以上的制备柱,而内径为10—1000mm,因此可以在较大的流速下不致产生很

业化色谱分离与纯化条件优化的前期研发工作也属于此类色谱。这类色谱中经济效益并不是首要考虑

的因素(除了大规模分离条件优化的前期研发工作外),对仪器装置要求不高,任何达到预期分离目标的仪器均可使用;而后者经济效益是其整个纯化过程考虑的核心因素,纯化样品量为千克至吨级。这两类制备色谱的区别反映在其柱设计上有很大不同,实验规模制备分离所用色谱柱的设计、填充及操作与常用分析柱基本相同,其内径一般为10—50mm,但大规模生产所用制备柱的内径通常大于50mm,为了得到高效柱,其柱型及结构与前者不同,

高的柱压降,从而获得高的产率。(2)填料颗粒小,

μ分布窄。采用直径为10—20m的细颗粒,孔径及粒度分布均很窄的多孔球形或非球形填料替代传统大

μ颗粒(40—200m)、宽分布的无定形填料填充制备柱,因而具有高得多的柱效,通常每米的塔板数在20000以上,有的甚至可达到与分析柱相仿的柱效。(3)流速高。流动相的线速一般在5—10cmPmin,以

对填料及其填充技术要求也更高。

1.柱型及结构

便提高产率,降低生产成本。

制备液相色谱根据待分离样品的负载量分为两类,一类为研究开发型,另一类为工业生产型。前者属于实验室规模的制备分离,样品量为微克级至克级,分离的样品一般供结构鉴定、生物活性测试以及

制备高效色谱柱目前可分为空管和压缩型两大类。

(1)空管柱

空管柱与分析柱相同,为中空的不锈钢管。常用空管柱内径为10—100mm,采用匀浆填充技术填

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μ装10—20m多孔固定相。随空管柱直径的增大,用

匀浆法填充高效色谱柱的难度也越来越大,内径100mm的空管是目前用匀浆法填充所能得到的高效的最大管状柱,内径大于100mm的制备柱目前均采用压缩柱。

(2)压缩柱压缩柱又可分为径向、轴向及环形膨胀三大类,如图1所示。

压机相连。色谱柱在使用过程中,活塞始终产生一定的压力压缩填料,随时消除产生的死空间。活塞与顶端法兰均配有多孔不锈钢滤板及能使样品及洗

[5]

脱液在柱截面上均匀分布的分散器。DAC柱稳定

μ且柱效高,可填装10—16m细颗粒填料,该类柱广泛用于制药工业中,是目前工业化HPLC中的主流

柱。2002年4月法国NovaSep公司成功地安装了目前工业生产中最大的制备色谱柱,内径已达到1600mm,柱长4m,其中填料用量4000kg,流动相用量

[8]

6000L,整个柱的重量为36000kg,如图2所示。静态轴向压缩(staticaxialcompression,SAC)柱内也有活塞,依靠液压操纵活塞压缩柱填料,消除固定相填料填充后可能产生的各种死体积,但它的压缩靠人工操纵,是间歇性的,比DAC柱连续加压效果差,当然价格比DAC柱便宜是其最大优点。

图1　制备色谱柱中各种压缩技术示意图(箭头指示压力

的方向和大小)

a.轴向压缩;b.径向压缩;c.环形膨胀

Fig.1　Illustrationofthevariouscompressiontechniquesused

forpreparativecolumn(Thearrowsindicatethesizeanddirectionofcompressionforces):a.axialcompression;b.radialcompression;c.annularexpansion

①径向压缩(radialcompression)柱。该技术由Little等于20世纪70年代中期发明,填料装在管壁可压缩的高聚物柱管内制成柱芯,再将装有填料的柱芯放入不锈钢外套中,利用气体或液体施压于柱芯外壁和不锈钢外套之间,压紧柱芯内的填料,以消

[1,5]

除颗粒间及颗粒与管壁间的空隙。径向压缩柱的主要缺点是柱芯长度固定,不如轴向压缩柱可以任意调节。此外直径较大的色谱柱中径向经常出现粒度梯度,造成流动相径向流速分布不均匀。由于径向扩散太慢,不能抵消柱截面积流速差异所产生的浓度梯度,所以径向流速是峰展宽的一个重要来[5]

源。有关制备型径向压缩柱的操作条件、操作性

[6,7]

能及柱效率等的研究也有报道。径向压缩柱主要是由Waters公司生产,现已有内装Nova2Pak、Bondapak及Delta2Pak等填料的预制柱出售。

②轴向压缩(axialcompression)柱。该技术最初是Godbille和Devaux于1974年设计的,内径一般从实验室制备柱(Φ50mm)到工业应用的大直径柱(Φ1000mm),它分为动态与静态两种。20世纪90年代初Colin等开发了动态轴向压缩(dynamicaxialcompression,DAC)柱技术,这种柱内有一个活塞,活塞上装有特殊设计的密封垫,在活塞自由移动时它能保证活塞与柱壁之间的密封性,活塞的下端与液

图2　NovaSep生产的目前世界上最大的色谱柱

Fig.2　Largestpreparativecolumnintheworld

builtbyNovaSep

③环形膨胀柱。径向与轴向复合压缩技术(即环形膨胀,annularexpanison)是由SeparationsTechnol2ogy公司(SepTech)于1987年开发的。利用柱中心的一楔形杆推动活塞向上移动产生挤压柱床的径向和

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横向压缩力,这类型柱存在楔形杆端的密封及流动

[1,5]

相和样品均匀分布等困难,仍处于实验阶段,很少用于生产中。

随着柱直径及上样量增大,如何使大体积原料液快速均匀分布在柱截面上是制备柱柱头结构设计的关键,因此在柱头结构上制备柱与分析柱完全不同。一般动态轴向压缩柱的活塞及顶端法兰上装有专利设计的液流分散器,保证了大量样品尽可能地瞬时分散在柱截面上,进而快速均匀进入柱床,克服了柱中心样品局部过浓的现象,保证了色谱柱的高效。

21高效制备填料

一般来说,分析HPLC中的填料可考虑用于制备HPLC中,但制备色谱由于填料使用量大,故对填料尤其是用于大规模工业化色谱中的填料有其特殊的要求。

(1)高的机械强度

填料在填充及用于目标产物的分离纯化中,始终承受很大的机械压力,而且在工业生产特别是制药业中,一根DAC色谱柱装置常用于分离与纯化多种药物,然而一种填料往往专用于一种产品。因此,对不同药物采用不同的纯化流程时,柱中原有的填料必须压出,填充其他合适的填料,而压出后的填料仍需保留备用。所以对填料的机械强度要求通常比分析用的填料更高,以便反复使用。机械性能差的填料经受不住反复填充,它们易破碎,产生细颗粒,

[9]

降低柱渗透性,甚至堵塞滤片,造成流速分布不均匀,影响分离产物的纯度,最终在系统中产生极高的柱压,无法继续使用。因此填料的机械强度是一项极重要的质量指标,关系到填料的寿命和生产的无故障运行。

(2)高负载量

在制备和工业流程规模的色谱中,填料的负载量是另一项极重要的因素,负载量越大,则单位重量填料可处理的原料量就可增加,因而提高了产率。负载量与比表面积、孔径大小、孔径大小的分布及表面官能团的密度等参数有关。在填料的设计与制备过程中将这些参数优化后,就可使单位重量固定相

[9]

中的有效表面积最大。表2列出了溶菌酶(MW约10kD)在C8反相填料上的吸附容量与填料孔径(DP)的关系[10]。随着孔径增大,单位重量填料的比表面(SSA)减小,故单位重量填料的样品吸附量AC(mgPg)也随之减小,但孔径100!的却比70!的AC(mgPg)要大,这说明孔径70!的填料中,有相当一部

分小孔溶菌酶分子无法进入,因而它们的比表面是无效的;而在100!的填料中,溶菌酶分子能扩散进入的小孔要比70!的填料中多得多,故有效比表面比70!的大,所以AC(mgPg)也随之增大,这也说明

了为什么单位面积的吸附量AC(mgPm)随孔径增大而增大。因为大孔填料中的表面积多数为目标产物的有效表面积,所以应该说影响负载量的不是填料的比表面,而是填料对目标产物分子的有效表面积。因此对不同的目标产物,随着其分子大小及物化性质的不同,选择合适孔径及孔径分布的填料是获得高负载量的一个关键因素。

表2　溶菌酶在反相C8填料上的吸附容量与孔径的关系

Table2　Adsorptioncapacityandporesizefor

lysozymeonC8silica

DP(!)

701001203005001000

SSA(m2Pg)

30016098503020

AC(mgPg)

396239281914

AC(mgPm2)0.130.390.390.550.630.69

　　(3)易于放大

理想的PHPLC固定相应无制备用与分析用之分,其性能须容易从分析柱到制备柱的放大。换句话说,在分析柱上获得的优化条件同样能在制备柱上重现。因为优化分离与纯化工艺通常是在实验室规模的分析柱上采用非线性色谱的原理进行探索与

[4]

研究,以减少投入,加快进度。但是有些填料分为分析用与制备用两种,其性质往往差别很大,无法实现分析柱到制备柱的直接放大。因此填料最好是大批量生产后再分级成很窄的颗粒范围,这样使不同颗粒范围的填料具有完全相同的理化性质与色谱行为,从而保证了从分析到制备的良好重现性。

(4)可大量供应,批间的重现性好

制备色谱中最佳化色谱条件和纯化工艺的开发与研究都是从小规模制备开始,开发一种小规模方法可选择不同品牌的同种填料,若工艺过程要扩大,必须有可靠的供货源提供大量填料,否则无法实现工业化。填料各批量之间的化学和机械稳定性、孔结构及可重复的比表面积等必须具有高度的重现性,否则难以保证长期、持续、稳定的分离与纯化生产工艺。

(5)合适的颗粒大小和窄的粒度分布范围

细颗粒可增加塔板数及分辨率,但同时引起装

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柱困难,需要更高的操作压力,而且形成高的柱压

降。柱压降增大使流动相经过柱时产生更多的摩擦热,而摩擦热是造成柱不稳定的重要因素之一。在大直径柱中热扩散很难,所以摩擦热效应对大直径

[11]

制备色谱柱更重要。目前工业规模制备分离多

μ采用10—20m颗粒,它在大直径柱内既有较高的柱

效,又有较低的柱压降。粒径分布窄的填料不但容易装填结实,而且柱压降比粒径分布宽的要低,因此易得到高效的制备柱。

此外,与分析HPLC填料相同,PHPLC填料应具有良好的化学稳定性及高的选择性,它们是影响制备分离经济效益的重要因素;填料无毒性、易于填充、价格合理等也是制备色谱中所希望的,可降低成本。目前在制备色谱所用固定相中,硅胶及其衍生固定相应用最多。有关制备高效液相色谱填料的发

[12][9]

展趋势及PHPLC、SFC、SMB的硅胶基质填料评述均有报道。近几年来,广大学者和公司为克服硅胶基质色谱材料对极性物质,特别是对碱性溶质产生非特异性吸附导致峰严重拖尾的缺点,开发研制出高纯度或超纯硅胶及其键合固定相,如EkaChem2icalsAB的Kromasil系列、GLSciences的Inertsil系列及DAISO的DAISOGEL系列等。高纯硅胶纯度

-6

高达99199%,把金属杂质的含量降低至1×10级,具有近乎完美的球形表面和分布很窄的粒径。目前国外很多药厂如Chugai、ElyLilly、NovoNordisk、BMS、Avecia、Peptisymtha、UCB等已在使用超纯硅胶及其键合固定相纯化手性药物、胰岛素、生长因子及肽等。最近,DAISO公司推出了适用于亲水和极性化合物(如寡糖、氨基酸、寡肽、核苷酸及有机酸)分离的DAISOGELODS2BP系列填料,与传统的C18固定相具有相似的选择性,但可使用含水量很高的溶液或纯水作流动相,克服了高密度C18固定相在纯水中烷基链的坍塌效应(matting2downeffect),适用于吸附和分配色谱。

目前高效制备液相色谱中所用填料多为球形颗

[13,14]

粒,尽管一些新型固定相如非多孔填料及灌注

[15—18]

色谱填料相继出现,但由于各种原因仍未广泛用于大规模工业化色谱中。其他新型基质材料如氧

[19][20][21,22]

化锆、二氧化钛、羟基磷灰石等PHPLC填料曾被加以研究,在蛋白质及药物分离中也有应用。

[23]

近年来,又发展起来一种新型的色谱填料,称为整体固定相(monolithicstationaryphases),又称为连续色谱柱(continuousbedchromatographiccolumn),它是原料经过原位聚合或固化在色谱柱管内形成的一整

块连续的多孔填料,其特点是传质快,谱带展宽小,其孔隙度及渗透性较传统的颗粒柱更好,在高流速下压力远低于颗粒型填充柱,因此柱效更高。聚合物整体固定相较硅胶基质整体固定相的发展[24—26]早,但由于其机械稳定性、样品均匀分布等方面的要求高使其作为制备柱受到了,而且大直

[27,28]

径均匀的整体化填料难以制得。目前整体固定相在大规模分离纯化中的应用有待于进一步的开发与研究。德国的MerckKGaA公司在这方面作了些

[29,30]

研究工作,但还未见到商品化的整体化填料用于大规模分离纯化的报道。

3.装柱技术

制备柱填充方法是柱技术中最关键的部分,也是决定柱效高低的主要因素之一。在利用制备色谱的生产实践中,一般对投入的设备更换较少,而是根据柱及分离产物选择固定相,因此好的装柱方法至关重要,以保证所得到的柱效率高、重现性好、渗透性好,使分离纯化过程成本达到最低。通常根据所选用填料的种类、粒度大小及柱尺寸,采用不同的装柱方法。一般所用装柱方法有干装法、匀浆填充法和压缩匀浆填充法等。

(1)干装法

μm填料的装干装法适用于颗粒度大于20—30

[5]

填。Dingene借助于一种简单的机械装填装置,由一个马达驱动偏心凸轮以每分钟120次的速度将色谱柱做上下约2cm的垂直抖动,此时可将填料以3—4gPmin的速度连续加入柱中。该法使柱床相对均匀、稳定,最多可填装3kg填料,可以满足分离一定量的产物,而且填充装置简单,投资相对较少。

μ颗粒小于20—25m的填料,用干装法不能得到高效柱。因为随着填料粒径的缩小,颗粒间的静

电作用和表面能增大,彼此倾向于聚集和“成团”,粘附在连接管及柱壁上,有时也会因强烈的静电作用彼此排斥,难以填装出均匀而紧密的柱床,此时必需用湿法即匀浆填充技术。

(2)匀浆填充法匀浆填充法最初用于分析柱的填装,目前已成功地用于填装内径不超过100mm高效液相制备柱,表3列出了目前常用的匀浆溶剂及流动相。

理论上,相同颗粒的填料不管在分析柱还是在制备柱中应有同样的柱效,即柱效与柱径无关。但实际上,随着柱径增大,保持填充后使用过程中的柱床稳定却困难得多,这也是造成制备柱柱效易下降的原因之一。造成柱床不稳定的原因有:①装柱的

[5]

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[5]

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表3　匀浆法填充色谱柱时常用的匀浆溶剂及流动相　　　

Table3　Packingmaterial2slurrysolventcombinations

packingmaterial

slurrysolvent

toluene222propanol(90P10)(vPv)

acetone222propanol(50P50)(vPv)CCl42methanol(95P5)(vPv)

driversolvent

n2hexane

μKromasil60(5—10m)

(EkaChemicals)

KromasilC8,C18(5—CHCl2222propanol(50P50)(vPv)μ10m)(EkaChemicals)CHCl3222butanol(50P50)(vPv)

methanol

μHypersilBDS(8m)(Shandon)

acetone2CCl4(50P50)(vPv)methanol

Amino2propylsilica(5—CCl42methanol(95P5)(vPv)μ10m)Kromasil(EkaChemicals)

n2hexane

高压泵流速及压力范围有限。因为在填充过程中要求匀浆及流动相的线速至少为1cmPs,所以对大直径的制备柱要求高压泵系统有很大的流量及压力,但在目前的产品中符合这种要求的不多,而且价格极昂贵,不实用。②大直径柱填充时产生大量的摩擦热。由于大流量流动相经过柱床时与颗粒间产生大量热量,这种热与流动相粘度、填料粒度、粒度分布及柱压降等因素有关。在正相柱中,由于流动相粘度小,柱压降低,所以摩擦热相对较小;而反相柱中由于流动相粘度大,柱压降高,摩擦热也大。柱径越大,摩擦热影响也越大

[5]

有压缩技术中最简单的一种,自从Colin等开发了动

态轴向压缩技术后,DAC柱在制备色谱中的应用与日俱增。Sanchez对Prochrom、DanProcess、MODcol及CEDI公司的轴向压缩系统及柱填充方法做了详尽

[9]

的描述。近年又出现了一种新的动态轴向压缩系

[31]

统(MultiPacker;MODcol,St.Lowis,MO,USA)。

[32]

该系统用一弹簧装置保持柱床压力,Orihuela等通过填装细颗粒填料于内径为5.08cm的柱中对其进行了检验,柱填充后即可取下,系统用来填装另一根色谱柱。关于DAC柱性能和重现性等的研究较多,最近研究者们研究了影响柱床稳定性及重现性

[33—37]

的有关参数,结果表明填料颗粒的性质、匀浆溶剂的性质、压缩力的强度、加压速度、流动相的性质影响填充密度及柱效。Sarker和Guiochon填装了内径为5cm的轴向压缩柱,系统地研究了制备型轴向压缩柱的操作条件及柱效,发现其柱效与具相同填料分析柱的柱效相同,但整体孔隙度及渗透率比

[38]

分析柱低。另外他们还考察了填充溶剂(packing

[39][40]

solvent)性质及填料机械强度对动态轴向压缩

[41]

柱中填料的固化过程及柱效的影响。Farkas等研究了轴向压缩柱中流速、柱效及浓度的径向分布,结果发现宽直径柱中心区域与外围区域的流速、柱效及溶质浓度的分布皆不均匀。Cherrak等研究了动态轴向压缩柱固化过程的动力学,轴向压缩力强度对柱长及柱渗透性和柱效的影响,柱壁摩擦剪切应

[37,42]

力(wall2frictionshear2stress)对柱长的影响。

(4)真空填充法[5]

该技术是由MerckKGaA制备色谱小组在环形膨胀柱及简单匀浆填充玻璃柱的基础上开发的一种新的“PackingStand”柱装柱技术,其原理是用普通喷水泵抽真空过滤匀浆,然后用水压压缩填充床压紧色谱填料。这种方法可精确地调节所需填充体积或凝胶床高度,因此很容易直接从分析规模到生产规模的放大。每一个“PackingStand”系统由完整的柱、架、填充管等组成,用户可根据自己的需要快速、高效地填装高质量制备分离柱,现有内径为25—450mm的柱填充装置,覆盖了从半制备到工业生产

。这是因为柱中心的热量

比边缘难以消散,形成从中心到柱壁的热梯度效应。其影响是中心与管壁温度不同,流动相粘度不同,流速不同,使谱带变形。另外色谱柱的不锈钢外壳与填料热膨胀系数不同,在多次热胀冷缩后,柱床会发生变化,在填料中产生死空间及空隙,尤其在柱顶及柱壁部分。③大直径柱在填充时,颗粒间会架空,形成不稳定结构,但这种不稳定结构在分析柱中由于受柱壁的支持变得较为稳定,随着柱直径与柱床比的增加,柱壁的支持作用逐渐减小至消失,所以柱中心在填充时形成的架空结构在制备柱使用过程中会逐渐消失,产生死体积及空隙

[5]

。解决不稳定性的

办法就是连续改变填充柱的体积,也即采用轴向压缩技术,将死体积及空隙排除到色谱柱外。当然色谱柱使用过程中流动相压缩填料也会使柱床压缩,但不能改变柱体积。正是由于上述原因,在直径大于50mm以上的制备柱出现了压缩柱及相应的压缩填充技术。

　　(3)压缩填充技术

用高压匀浆法较难填充直径大于100mm的制备柱,为将细颗粒填料均匀装入更大直径的制备色谱柱中,目前均采用柱床压缩技术。轴向压缩是所

μ规模所用柱的范围,可填装如12m的Lichrospher硅

胶和“软”聚合物凝胶如FractogelEMD等。

4.制备柱的再生技术

在PHPLC大规模分离纯化的实际应用中,由于受成本及产量等因素的,制备柱一般均反复使用,以降低生产成本,提高产率,创造高的经济效益。但在实际的操作过程中,即使通过优化分离条件达

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到了最佳柱效,色谱柱在使用一段时间后,柱效仍然

会降低,而柱效直接影响色谱分离的结果即产品的质量、纯度及回收率等。所以毫无疑问,在进行大规模的分离纯化时,要减少纯化和生产的成本,必须对柱效降低的制备柱进行再生,尤其是使用价格极为昂贵的优质填料,其再生尤为重要,它是影响纯化成本的重要因素之一。制备柱的再生方法多种多样,与纯化用的原料组成及纯化的工艺条件密切相关。图3表示纯化胰岛素用的制备柱在再生前后的变化。新的C8柱第一次纯化猪胰岛素时杂质与胰岛

素峰分离明显,柱压降仅为315×10Pa(图3a),进样50次后(每次样品负载量为12gPL),胰岛素峰将杂

三、高效制备液相色谱柱的生产厂家

近年来,为了适应科学的进步和工业技术的发

展,制备色谱柱技术也取得了显著进步,成为许多公司进行商业竞争的热点,生产和供应制备柱的厂家和公司很多,制备柱的类型和规格也在不断发展,表4列出了一些主要的厂家(公司)及其供应的进行实验室制备分离的部分色谱柱,仅供参考,更多的信息可上网直接查询。工业制备分离色谱柱一般为DAC柱,目前生产DAC柱的厂商主要有法国的No2vaSep(由以前的Prochrom和Novasep合并)、丹麦的DanProcessAPS、美国的MODcol、英国的JonesChrom2atography和德国的MerckKGaA等公司。

四、展　望

目前制备色谱虽然已用于药物及生物产品的纯

化,而且发展很快,但是为了各公司的自身利益,这些技术通常严加保密,很少公开发表,因此与分析色谱相比至今仍处于研究发展阶段。高效制备色谱柱是使色谱分离纯化过程达到低投入高产出的关键因素,因此色谱柱的设计极为重要。当前所用制备柱大部分采用压缩技术填充,但研究表明,压缩柱的柱

[42,45,46]

床并不均匀,如何将固定相颗粒紧密而均匀地填充到色谱柱中仍是一个有待解决的关键技术。高效的固定相填料价格仍十分昂贵,尤其是手性填料更甚,如何开发优质价廉批间重现性好的高效填料,也是PHPLC发展中的挑战性课题。目前能供应完整的工业化制备色谱装置的厂家不是很多,而且价格十分昂贵,这也是为什么PHPLC当前仅限于制药业等产品价值极高的部门能使用的主要原因。随着医药及生物技术研究领域的日益扩大,制备柱及其应用技术与对象的研究和开发将会快速发展,各种连续与非连续的色谱自动化生产流程会相继出现。在我国PHPLC的研究与应用近年来虽有所发展,但与国际水平相比差距甚远。作为一种高效的分离与纯化技术,PHPLC在我国的工业现代化进程中无疑具有广阔的发展与应用前景,加速研究与积极推广使用无疑是对我们研究工作者的一大挑战,也是我们面临的艰巨任务。

图3　Kromasil色谱柱受胰岛素聚合体污染后的再生结果

a.新柱第一次进样,负载12g猪胰岛素PL,反压:315×10Pa;b.进50次样后,反压615×10Pa;c.用5倍柱体积

的0.1MNaOH∶EtOH(4∶6)pH=13.0溶液再生后,反压

315×10Pa

Fig.3　RegenerationofaKromasilcolumncontaminatedwith

polymersofinsulin

a.newbedwithfirstinjection,loading:12gporcineinsulinPL,backpressure315×10Pa;b.after50injections,backpressure615×10Pa;c.afterregenerationwith5columnvolumeof0.1M

6NaOH∶EtOH(4∶6)atpH=13.0,backpressure315×10Pa

质峰掩盖,无法分离完全(图3b),柱压降明显升高,柱效下降。其原因主要是由于胰岛素分子在色谱柱内与杂质分离的过程中形成了二聚体、三聚体及多聚体沉积在填料颗粒的表面,此时用含011molPLNaOH与乙醇(4∶6)混合液(pH13)冲洗色谱柱后即可恢复柱效,柱压降也减至原始值(图3c)。再生时需注意再生液的用量必须控制在5倍柱体积,而且清洗后立即用0.2molPL的醋酸溶液中和柱内残留的碱液,直至流出液呈酸性为止。工业制备柱的再生技术涉及商业机密,很少公开报道,但文献上的相

[43,44]

应报道仍可提供不少启示。

・280・

化　学　进　展

第16卷

表4　制备型高效液相色谱柱生产厂家及其部分制备柱

Table4　ManufacturersandpartoftheirPHPLCcolumns

manufacturerAKZONobelPEKA

Chemicals

www.kromasil.comAdvancedSeparationTechnologies(Astec)PAdvanced

ChromatographyTechnologies

www.astecusa.com

column

Kromasilcolumnpacking

columndimensions(ID×length,mm)

applications

racemates

μSIL,C4,C8,C18,NH2,5—16m,100!pore,10—100×250

spheres

μCHI2IDMB,CHI2IITBB,10m

10,20,50.8×25022.1×250,50022.1×250,50022.1×250,50022.1×250,500

AstecCLC2D,CLC2LChirobioticTM

μchiralamine,5msilica,100!pore,spheresμChirobioticTTM,5mμChirobioticVTM,5mμChirobioticRTM,5m

aminoacids

aminoacids,oligopeptides

andacidiccompoundsetcneutralmolecules,amines,acidsandesters

chiralalchhols,bipeptide,ortripeptideα,2hydroxyacidproteinsandpeptides

Ace300!AceAQ(18)

AgilentTechnologies

www.agilent.com

ZorbaxStablebondZorbax300!(SB)ZorbaxRXZorbaxOriginalZorbaxGF

μBasedeactivated,C4,C8,C18,3,5,10m,300!50.8×250

pore

μC18withpolargroup,3,5,10m,100!50×250

SB2C18,SB2C8,SB2CN,SB2C3,SB2Phenyl,80!21.2×250

μpore,7m,spheresC18,CN,C3,5,7μm,300!pore,spheres21.2×250

acidic,basicandneutral

compounds

proteinsandpeptidesacidic,basicandneutralcompoundsatlowpHcarotinoidspoteins

μRX2C18,RX2C8,7m,80!pore,spheresμC18,C8,CN,7m,70!pore,spheres

21.2×25021.2×250

μGF2250,150!pore,4m;GF2450,300!pore,21.2×250

μ6m

μC18,C8,CN,NH2,silica,10m,60!pore,irregu27250×250lar

μC18,C8,NH2,CN,Silica,10m,80!pore,sph210,22×100,250

eres

μC8,C18,CN,silica,3,5m,145!pore

AlltechAssociatesInc.EconosilTM

www.alltechweb.com

Econosphere

BravabasedeactivatedProSphereTM

μC18,C4withpolymericbondingto5mspheres,10,22×250

300!pore

μPS2DVB,5m,140!poreμPS2DVB,10m

21.2×25021.2×250

biomolecules

BioChromeLabsInc.

www.biochroml.com

HydrocellRP5THydrocellRP10D

smallmolecules

biologicalmacromoleculessuchasproteinsandpolynu2cleotidesbiomolecules

μHydrocellRP5S,RPPS2DVB,5,10m,140!pore,spheres

10S

μBischoffChromatogra2ProtoSIL200C18ACE2C18withpolargroup,3,5m,200!pore

phyEPS

www.bischoff2chrom.Protosil120C18SHμC18,5,10m,120!de

Esindustrieswww.esind.comGLScienceswww.gls.co.jp

ChromegabondODS2PI

21×250

20×30020×50

smallproteins,peptidesand

proteindigests

combinatorialchemistry,highspeedresolutiondrugs

μC18withureagroup,3216m,100!manydimensions

InertisilInertisilPREP

ODS23,C823,PH23,CN23,NH2,Silica,100!pore,20—50×250

μ3,5,8m,spheres

μC18,C8,Silica,80!pore,10m,spheres10—50×250

50—100×500

drugs,nucleotides,organic

acids,steroids

μm,spheresInertisilECONOPREPC18,Silica,80!pore,40

第2期续表4

manufacturer

column

李瑞萍等　高效制备液相色谱柱技术的研究进展・281・

columnpacking

columndimensions

(ID×length,mm)21.5,50.8×100225021.5×250

21.5,50.8×100225010×25010,21.5×25010×25021.5×250

applications

smallmolecules,DNApurifi2

cation,vitamins,etc.proteins,peptidesandDNAoligomers

anionssuchasCN-cationsinwaterandsoilsimplealiphaticcarboxylicacidsandalcohols

hydrophobic,acidicandba2siccompounds

HamiltonCo.HamiltonPRPwww.hamltoncompany.com

μPRP21,12—20m,100!poreμPRP23,10,12—20m,300!poreμPRP2X100,10,12—20mμPRP2X200,10mμPRP2X400,12—20mμPRP2X300,7m

HxSilC218μC18,3,5m,100!pore

JordiAssociatesInc.

www.jordiassoc.com

JordiDVBμRPHydroxylatedDVB,500!pore,5m

22×100,250

250,500GelGlucose2DVB,100!,10!,10!,10!pore,22×

μ5m

μ22×100,250,500GelRPDVB,300!,500!,103!pore,5m250,500GelSulfonatedDVB,100!,500!,103—105!pore,22×

μ5m

Macherey2NagelNucleosilwww.macherey2nagel.comNucleosil10023C8HD

Nucleosil10023C18

NautilusNucleogenDEAE

NacalaiTesquewww.nacalai.co.jpNestGroup

www.nestgrp.com

CurosilTMPTAXOLCosmosilTMClipeusC18

22×250,500μDVB,GelDVB,100!,500!,103—105!pore,5m

SIL,C8,C18,CN,NO2,Amino,DMA,5,7,10×250

μ10m,50!,100!poreC8,100!pore

μC18withpolargroup,3m,100!poreμNucleogen6027,50027,400027,7mμ;Curosil2PFP210μCurosil2PFP25μPBBBuckyprep,5

μC18,10m,120!pore

8—24×250basic,polarcompoundsbasicdrugsandpolarcom2

pounds

10×12510,21.2,50×25010,20×25010—25×250

proteins,peptidesandbio2

moleculestaxolfullerenes

polarmolecules,purificationofcombinatorialchemistryproducts

phenylthiohydantoin2aminoacids

acidic,basicandchelatingcompounds

highflowratecombinatorialchemistrybiomolecules

MaccelAQPSC18

NomuraChemicalCoLtd.

www.develosil.netOraChrom

www.orachrom.com

DevelosilODS2SRDevelosilStyrosEAE2XMStyros

μC18withpolargroup,5m,120!poreμC18,5,20m,80!pore,spheres

21.5×25010,25×250

μCombi2RP[C30],RP2aqueous[C30],5m,140!20×150,28×250

pore,spheres

basematerial:PS2DVB2methacrylate;functional20×100

μgroup:diethylaminoethylquaternaryamine,25m,

gigaporous

HQ2XM

150,250StyrosTMSP2HX,XM,basematerial:PS2DVB2methacrylate;functional10,20×

μgroup:diethylaminoethylsulfopropyl,25m,giga2XP

porous

PhenomenexSnergiTMwww.phenomenex.com

LunaJupiterTMSpherecloneTMKingsorb

biomolecules

μMax2RP,Polar2RP,C12(TypeB),4m,80!10—100×250

pore,spheres

silica(2),C5,C8,C18,phenyl2hexyl,NH2,5,10—100×250

polarornon2polar,acidsand

bases,overabroadpHrangedrugs,naturalproductsandorganicacids

largeproteins,oligmersandmacromolecules

μ10,15m,100!pore,spheres

μC4,C5,C18,10,15m,300!pore,spheres

10—100×250

μC6,C8,Silica,ODS(1),ODS(2),NH2,5,10m,10,21.2×250

80!pore,spheres

μC8,C18,Phenyl,5m,90!pore,spheres

10,21.2×250

PrimesphereTMAQUAμSilica,C8,C182MC,C182HC,5,10,15m,110!,10,21.2,50×250

300!pore,spheres

・282・续表4

manufacturer

column

化　学　进　展

第16卷

columnpacking

columndimensions

(ID×length,mm)

applications

PhenomenexPRODIGYTM

www.phenomenex.com

PolymerLaboratoriesPLRP2S

www.polymerlabs.comPLaquagel2OHRegisTechnologiesInc.Ulmowww.registech.comThermoHypersil

www.thermohypersil.de

HypersilHiperprepμsilica,ODS23,phenyl23,5,10m,100!pore,21.2,50×250

spheres

μODS2PREP,C82PREP,10m21.2,50×250μ10—20m,100!,300!,1000!,4000!poreμ10m,60—1000!pore

μ1,22diphenylethylenediamine,5,10m,100!pore

ODS(C18),MOS(C8),APS2(NH2),CPS(CN),10×250μPhenyl(P),Silica,5,10m,spheresHSsilica,HSBDSC8,HSBDSC18,100!pore,10,22×250

μ8m

25-100×150-30025×300

bases,nucleotides,peptideswater2solublesampleschiralcompounds

HyPURITY

HyPURITYADVANCEFastHypurityC18

VarianInc.

www.varianinc.com

DynamaxBDSOminiSpher

VydacPTheSeparationsVydac259VHPgroup

www.vydac.comWatersCorp.XTerraTMwww.waters.com

SymmetrySymmetryShieldTMSymmetry300

μsilica,C4,C8,C18,Butyl,ODS,8215m120!,10,22×250

300!pore,spheres

μC8,C4,orCNbondedto3or5msilicaspheres21.2×502250μmsilica21×C8graftedtopolargroupbondedto3or5502250

spheres

μC18,3m,spheres21.2×250μbasedeactivatedsilica,5,10mμC18,10m,spheres

μPSPDVBcopolymer,8,15mbeads

10,21.4,41.4×25010,21.4,41.4×25010,22,50,100×250

acidic,basic,orchelating

compounds

acidic,basicandneutralcompoundsdrugs

proteinsandpolypeptides

MSC18,MSC8,RPC18,RPC8,spheres5,7.8,19,30×50—300μ7m,125!pore

μC8,C18,spheres5,7m,100!pore7.8,19,30×50—300

μRP18,RP8,5,7m,100!pore,spheresμC8,C18,5,7m,300!pore,spheresμC8,C18,7m,100!pore,spheresμC18,Silica,6m,60!pore,spheres

7.8,19,30×50—3007.8,19,30×50—3007.8,19×150,3007.8,19,30,50×300

polarandbasiccompoundspeptidesandproteinsorganicsynthesisintermedi2

atesornaturalproducts

SymmetryPrepTM

PrepNova2PakHR

BondapakPPorasilμBondapakC18,phenyl,CN,NH2,10μm,125!7.8,19,30×300

pore,irregular

μBondapakC18,15—20m,125!pore,irregular

7.8,19,30,50×300

7.8,19,30,50×300μPorasil,10μm,125!pore,irregular

300μPorasil,15—20,37—55m,125!pore,irregular7.8,19,30,50×

Delta2PakTMHydrosphereC18

WhatmanInc.

www.whatman.com

PartisilPartisilMagnum9Magnum20

μC18,C4,15m,100,300!pore,spheresμC18,3,5m,120!pore

7.8,19,30,50×30020×250

peptides,proteinsandnatu2

ralproducts

highpolarandbasiccom2pounds

Silica,ODS23,C8,PAC,ODS,ODS22,SAX,SCX,9.4×250,500μ10m,85!pore,irregularODS23,C8,ODS22,ODS,PAC,SILICA,SAX,22×250,500

μSCX,10m,85!pore,irregular　　tographyTechniques:ApplicationsinNaturalProductIsolation

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李瑞萍等　高效制备液相色谱柱技术的研究进展

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