分子生物学教案

第一章 绪论

重点：1. 分子生物学的基本含义

2. DNA的发现

3. 分子生物学与其他学科的关系

难点：DNA的发现

课时分配：1.5学时

分子生物学的基本含义

分子生物学是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。

所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、 生殖、生长和发育等生命基本特

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征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。

1.1 引言

现代分子生物学研究的目标是要在分子水平上掌握细胞的功能并揭示生命是本质。

1.1.1 创世说与进化论

多少年来，人们常常会反复提出下面3个与生命和一切生物学现象有关的问题：

（1）生命是怎样起源的？

（2）为什么“有其父必有其子”？

（3）动、植物是怎样从一个受精卵发育而来的？

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对这些问题的回答：

创世说：

西方：上帝先创造了世间万物，后来又创造了男人亚当，再从亚当身上抽一根肋骨，这就成了女人夏娃，亚当和夏娃繁衍了人类。

中国：女娲团土造人

进化论：

1859年，伟大的英国生物学家达尔文（Charles Darwin）发表了著名的《物种起源》一书，确立了进化论的观点。正是达尔文的生物进化学说，打破了上帝造人的传统观念，改变了社会对人类在整个世界中的地位的看法，极大地推动了人类思想的发展。

达尔文用大量事实证明“物竟天择，适者生存”的进化论思想，他认为世界上的一切生物都是可变的，并预言从低级到高级的变化中必定有过渡物种存在。他指出物种的变异是由于大自然的环境和生物群体的生存竞争造成的，彻底否定了上帝创造万物的旧思想，推翻了物种不变的神话，使生物学真正迈入实证自然科学的行列。

1.1.2 细胞学说

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早期生物科学家的另一大贡献是提出细胞理论（Cell Theory）。17世纪末，荷兰籍显微镜专家Leeuwenhoek成功制作了世界上第一架显微镜。大约与Leeuwenhoek同时代的Hooke，第一次用“细胞”这个概念来形容组成软木的最基本单元。

动、植物的基本单元是细胞，这是19世纪三大发现之一的细胞学说的核心。建立这一学说的是德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann。

1.1.3 经典的生物化学和遗传学

现代生物学的两大支柱：生物化学和遗传学

进化论和细胞学说相结合，产生了作为实验科学之一的现代生物学，而以研究动、植物的遗传变异规律为目标的遗传学和以分离纯化、鉴定细胞内含物质为目标的生物化学则是这一学科的两大支柱。

生物化学家Buchner第一个实现了用酵母无细胞液和葡萄糖进行氧化反应，生成乙醇，证明化学物质的转换并不需要完整的细胞而仅仅需要细胞中的某些成分。蛋白质是生活细胞中所有化学反应的执行者和催化剂。

生物化学从一开始就执行着双重使命，首先，分析细胞的组成成分；其次，弄清楚这些物质与细胞内生命现象的联系。

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孟德尔通过豌豆实验，总结出生物遗传的两条基本规律——基因分离规律和自由组合规律，被公认为经典遗传学的奠基人。

在孟德尔遗传学的基础上，美国著名的遗传学家Morgan又提出了基因学说。

当所研究的两个基因位于同一染色体上而距离又较近时，Morgan的连锁遗传规律起主导作用；而当所研究的两个基因位于不同染色体上时，孟德尔的自由组合规律起主导作用。

1.1.4 DNA的发现

直到1953年Watson 和Crick提出DNA双螺旋模型之前，人们对于基因的理解仍然是抽象的、概念化的，缺乏准确的物质内容。

首次证明DNA是遗传物质的是Avery的细菌转化实验。

图1-1 DNA是转化源

早在1928年，英国科学家Griffith等人就发现，肺炎链球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。细菌的毒性是由细胞表面荚膜中的多糖决定的。具有光滑外表的S型肺炎链球菌因为带有荚膜而能使小鼠发病，具有粗糙外表的R型肺炎链球菌因为没有荚膜而失去致病

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力，（荚膜多糖使细菌免受动物白细胞的攻击）。

首次用实验证明基因就是DNA分子的是美国著名的微生物学家Avery。他和同事首先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀灭活性以后在侵染小鼠，发现这些死细菌自然丧失了致病力。再用活的粗糙型细菌（R型）来侵染小鼠，也不能使之发病，因为粗糙型细菌无致病力。然而，当他们将烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，小鼠死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌（而不是R型）。他们推测，死细菌中的某一成分——转化源将无致病力的细菌转化成致病菌。10多年后，实验证明，DNA就是转化源。死细菌DNA指导了这一可遗传的转化，从而导致了小鼠死亡。

再次证明DNA是遗传物质的噬菌体侵染细菌的实验。

图1-2

噬菌体专门寄生在细菌体内，它的头、尾外部都是由蛋白质组成的外壳，头内主要是DNA。噬菌体侵染细菌的过程可以分为以下5个步骤：

1. 噬菌体用尾部的末端（基片、尾丝）吸附在细菌表面，

2. 噬菌体通过尾轴把DNA全部注入细菌细胞内，蛋白质外壳则留在细胞外。

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3. 噬菌体的DNA一旦进入细菌体内，它就能利用细菌的生命过程合成自身的DNA和蛋白质。

4. 新合成的DNA和蛋白质能组装成许许多多与亲代完全相同的子代噬菌体。

5. 子代噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵染其他细菌。

1.2 分子生物学简史

分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。

1.3 分子生物学研究的内容

现代生物学研究发现，所有生物体中的有机大分子都是以碳原子为核心，并以共价键的形式与氢、氧、氮及磷以不同的方式构成的。不仅如此，一切生物体中的各类有机大分子都是由完全相同的单体，如蛋白质分子中的20种氨基酸及DNA和RNA中的5种碱基组合而成，由此产生了分子生物学的3条基本原理：

1. 构成生物体各类有机大分子的单体在不同生物中都是相同的。

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2. 生物体内一切有机大分子的建成都遵循共同的规则。

3. 某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。

从表面上看，分子生物学涉猎范围极为广泛，研究内容似乎包罗万象。事实上，它所研究的不外乎以下四个方面：

1. DNA重组技术

2. 基因表达调控

3. 生物大分子的结构和功能

4. 基因组、功能基因组与生物信息学

分子生物学与其他学科的关系

分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的，凝聚了不同学科专长的科学家的共同努力。它虽产生于上述各个学科，但已形成它独特的理论体系和研究手段，成为一个独立的学科。

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生物化学与分子生物学关系最为密切。两者同在我国教委和科委颁布的一个二级学科中，称为“生物化学与分子生物学”，但两者还是有区别的。生物化学是从化学角度研究生命现象的科学，它着重研究生物体内各种生物分子的结构、转变与新陈代谢。传统生物化学的中心内容是代谢，包括糖、脂类、氨基酸、核苷酸、以及能量代谢等与生理功能的联系。分子生物学则着重阐明生命的本质----主要研究生物大分子核酸与蛋白质的结构与功能、生命信息的传递和调控。《国际生物化学学会》和 《中国生物化学学会》现均已改名为《国际生物化学与分子生物学学会》和《中国生物化学与分子生物学学会》。

细胞生物学与分子生物学关系也十分密切。传统的细胞生物学主要研究细胞和亚细胞器的形态、结构与功能。细胞作为生物体基本的构成单位是由许多分子组成的复杂体系，光学显微镜和电子显微镜下所见到的规则结构是各种分子有序结合而形成的。探讨组成细胞的分子结构比单纯观察大体结构能更加深入认识细胞的结构与功能，因此现代细胞生物学的发展越来越多地应用分子生物学的理论和方法。分子生物学则是从研究各个生物大分子的结构入手，但各个分子不能孤立发挥作用，生命绝非组成成分的随意加和或混合，分子生物学还需要进一步研究各生物分子间的高层次组织和相互作用，尤其是细胞整体反应的分子机理，这在某种程度上是向细胞生物学的靠拢。分子细胞学或细胞分子生物学就因此而产生，成为人们认识生命的基础。

由于分子生物学涉及认识生命的本质，它也就自然广泛的渗透到医学各学科领域中，成为现代医学重要的基础。在医学各个学科中，包括生理学、微生物学、免疫学、病理学、

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药理学以及临床各学科分子生物学都正在广泛地形成交叉与渗透，形成了一些交叉学科，如分子免疫学、分子病毒学、分子病理学和分子药理学等，大大促进了医学的发展。

1.4 分子生物学展望（自学内容）

第二章 染色体与DNA

重点：1.原核生物和真核生物DNA的复制特点

2. DNA的修复

难点：1. DNA的修复

2. DNA的转座

课时分配：3.5学时

第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点

一. 原核生物DNA的复制特点

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大肠杆菌基因组以双链环状DNA分子的形式存在，其DNA复制的之间产物可形成一个θ，复制从定点开始双向等速进行。

1. 大肠杆菌DNA复制起始点（oriC）保守序列分布图（图2-21）

2. 由大肠杆菌oriC复制起始点出引发的DNA复制过程

（a）大约有20个DnaA担保在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合；（b）在HU蛋白和ATP 的共同作用下，DnaA复制起始复合物使3X13bp直接重复序列变性，形成开链；（c）DnaB（解链酶）六体分别与单链DNA相结合，（需要DnaC的帮助），进一步解开双链。在一些重要的酶和蛋白质的相互作用下，DNA开始复制。

3. 参与DNA复制的酶和蛋白因子

（1 . ）DNA解链酶 （Helicase）

促使DNA在复制叉处打开双链，与单链DNA结合，与ATP结合，分解成ADP+Pi，产生能量沿DNA链向前运动，促使DNA双链解开。

（2）单链DNA结合蛋白（SSBP）

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与单链DNA结合，防止解开的单链重新配对形成双链或被核酸酶降解;使单链DNA呈伸展状态，无弯曲和结节，利于作为模板；

SSBP可重复使用。

原核生物的SSBP具有协同效应。

SSBP只保持单链的存在，并不能起解链的作用。

（3）拓扑异构酶Topoisomerase ——解开负超螺旋，并与解链酶 共同作用解开双链。

（4）引物酶 Primase

催化引物RNA分子的合成

（5）DNA聚合酶 DNA Polymerase

A.概念：是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶。

B. 特点：

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a. 以dNTP为前体催化合成DNA；

b. 需要模板和引物；

c. 催化dNTP加到DNA链的3’-OH端；

d. 催化合成方向5’→3’ 。

C. 分类：

DNA聚合酶 I（主要保证DNA复制的准确性）

DNA聚合酶II（主要起DNA修复的作用）

DNA聚合酶III（DNA复制的主导酶）

（6）DNA连接酶

将双链DNA上的切口连接起来；

主要用于冈崎片段的连接，DNA修复、重组，两个复制单元间片段的连接。

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连接双链DNA的要求：

切口

3 ’-OH

5 ’-磷酸基团

需要能量

4.冈崎片段与半不连续复制

由于DNA的两条链为反向平行，以复制叉移动的方向为基准，一条链为3′ → 5′ ，其新合成的DNA链沿5 ′ →3 ′ 连续进行——前导链

另一条链为5 ′ →3 ′ ，新生的DNA链先合成短的冈崎片段，不连续合成——滞后链，再由DNA连接酶连接成完整的DNA链。

这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制称为半不连续复制。

5. 复制的引发和终止

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（1）引发

先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物的3 ˊ端开始合成新的DNA链。

滞后链的引发由引发体来完成。引发体由6种蛋白质n、n′ 、n ″ 、DnaB、C和 I共同组成。引发体在滞后链分叉的方向上移动，并在模板上断断续续地引发生成滞后链的RNA引物，，再由DNA聚合酶III作用合成DNA，直到遇到下一个引物或冈崎片段为止。RNase H降解RNA引物， DNA聚合酶I将缺口补齐，DNA连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA。

（ 2.）终止

（图2-23）

当复制叉前移，遇到20bp重复性终止序列（Ter）时， Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后，在拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。

二.真核生物DNA的复制特点

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1. 与原核生物相似

（1）半保留、半不连续复制

（2）复制过程：引发—延伸—终止三个阶段

（3）需要酶和蛋白因子

2.与原核生物不同

（1） 原核生物是单复制子，真核生物是多复制子（每条染色体上有多个复制起点）；

（2） DNA全部复制完毕才进行第二轮复制，原核生物在第一轮复制未完成就进行第二轮复制。

（3）有5种DNA聚合酶，即聚合酶α、β、γ、δ、ε。

3.真核细胞DNA的复制调控（3个水平）

真核细胞的生活周期可以分为4个时期：G1、S、G2和M期。G1是复制预备期，S期是复制期，G2是有丝分裂准备期，M期为有丝分裂期。DNA复制只发生在S期。

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（1） 细胞生活周期水平调控（决定细胞停留在G1期 还是进入S期 ）

许多外部因素和细胞因子参与限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂等都可以诱发细胞由G1期进入S期。一些细胞质因子如四磷酸二腺苷和聚ADP-核糖也可诱导DNA复制。

（2）染色体水平调控（决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制。这种有序复制的机理还不清楚。

（3）复制子水平调控（决定复制的起始与否）

这种调控从单细胞到多细胞生物是高度保守的。

第五节 DNA的修复

1. 错配修复

该系统识别母链的依据来自Dam甲基化酶，它能使位于5 ′ GATC序列中腺苷酸的N6位甲基化。一旦复制叉通过复制起使点，母链就会在几秒至几分钟内被甲基化。此后，只要两条DNA链上出现碱基配对错误，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5 ˊ位置切开子链，再根据错误碱基相对于DNA切口的方向启动修复，合成新的子链片段。

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（图2-25）（a）发现碱基错配； （b）在水解ATP的作用下，MutS，MutL与碱基错配位点的DNA双链相结合；（c）MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链。

（图2-26）当错配碱基位于切口3′下游端时，在MutS-MutL、解链酶II、DNA外切酶Ⅶ或RecJ核酸没的作用下，从错配碱基3′下游端开始切除单链DNA直到原切口，并在pol III和SSB的作用下合成新的子链片段。若错配碱基位于切口5′端上游时，则在DNA外切酶I或X的作用下，从错配碱基位5′上游端开始切除单链DNA直到原切口，再合成新的子链片段。

2.碱基切除修复

AP位点：由糖苷水解酶切除受损核苷酸上的N-β -糖苷键，在DNA链上形成的去嘌呤或去嘧啶位点。

DNA分子中一旦产生了AP位点， AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷磷酸键打开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链。

3.核苷酸切除修复

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当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。

损伤发生后，首先由DNA切割酶在已损伤的核苷酸5 ′ 和3 ′分别切开磷酸糖苷键，产生一个由12∽13（原）或27∽29（真）个核苷酸的小片段，移去小片段后由DNA聚合酶I(原核)或ε（真核）合成新的片段，并由DNA连接酶完成最后修复。

（图2-28）在原核生物中，DNA切割酶从受损核苷酸3 ′端的第5位和5 ′端的第8位切开磷酸糖苷键。在人类细胞中，DNA切割酶从受损核苷酸3 ′端的第6位和5 ′端的第22位切开磷酸糖苷键。

4. DNA的直接修复

是在DNA光解酶的作用下把在光下或紫外光照射形成的胸腺嘧啶二聚体等还原成单体的过程。

第六节 DNA的转座

DNA的转座,或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。与DNA的同源重组相比，频率较低，但有重要的生物学意义，可以解释基因缺失或倒转现象，可被用于构建新的突变体。

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1. 转座子（Transposon ，Tn）

能够进行复制并将一个拷贝插入新位点的DNA序列。（能在基因组中移动的DNA序列叫转位因子 ）由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置,甚至在不同的染色体之间跃迁所以又称跳跃基因（jump-gene）。最简单的转座子不含任何宿主基因而常被称为插入序列（insertional sequence，IS）。转座子常常被定位特定的基因中，造成该基因突变。

存在：

原核生物、植物中广泛存在，少数存在于动物中。

2. 转位因子的结构特点：（图2-31）

（1）两端存在末端重复序列（TIR），是转位过程中至关重要的结构；

（2）绝大多数的转位因子含有开放阅读框，（ORF），编码一个转位酶，促进转位因子的转位；

（3）受体DNA在接受插入DNA后，在插入序列的两侧形成同向重复序列；

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（4）受体（靶序列）没有确定的特异性，但趋向于一个“热点”区域——即所谓“区域性优先”。 取决于DNA双螺旋状态，或DNA-PRO结合状态。

IS序列都是一些小的DNA片段，末端具有倒置重复序列，转座时往往复制宿主靶位点一小段（4-15bp）DNA，形成位于IS序列两端的正向重复。

3. 转位机制:

转座子的复制

靶序列的断裂及倍生——同向重复序列

转位是一种复制过程。

4. 转座作用的遗传学效应

（1） 转座引起插入突变

各种IS、Tn转座子都可以引起插入突变。如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活。

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（2） 转座产生新的基因

如果转座子上带有抗药性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突变，同时也使这个位点产生抗药性。

（3） 转座产生染色体畸变（2-35）

当复制性转座发生在宿主DNA原有位点附近时，往往导致转座子两个拷贝之间的同源重组，引起DNA的缺失或倒位。若同源重组发生在两个正向重复之间，就导致宿主染色体DNA缺失；若重组发生在两个反向重复转座区之间，则引起染色体DNA倒位。

（4）转座引起生物进化

由于转座作用，使一些原来在染色体上相距甚远的基因整合到一起，构建成一一操纵子或表达单元，也可能产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子。

5. 真核生物中的转座子

（1）玉米中的转位因子

分两类：

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自主转位因子——本身可以转位；

非自主转位因子——本身不能转位，但在自主 因子存在下可以转位。

最早于20世纪40年代由美国冷泉港实验室B.Mc Clintock发现玉米的颜色变化与某些基因的关启有关，而这些基因的关启可能与某些因子的控制有关，而这些因子在基因组中是可以移动的——控制因子。当时这一发现并没有引起人们的注意；

直到70年

代Shapiro发现大肠杆菌的乳糖操纵子的突变是由于插入了一段序列，后来又发现了其它转位因子后，McClintock的发现才被重视；

1983年Clintock荣获诺贝尔生物学医学奖。

第五章 分子生物学技术

重点：1. DNA操作技术

2. 基因克隆的主要载体系统

难点：1. DNA操作技术

2. 基因克隆的主要载体系统

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课时分配：5学时

第一节 重组DNA技术发展史上的重大事件

1. 基因操作 gene manipulation

主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。

2. 基因工程 genetic engineering

将外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。是核酸操作技术 的一部分。

3. 二十世纪分子生物学的三大成就

（1）20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；

（2）50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了自我复

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制和世代交替问题；

（3） 50年代至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。

4. DNA 重组技术 recombinant DNA technique

其核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。5. 重组DNA技术史上的主要事件•1973 Cohen第一例成功的克隆实验

•1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物

•1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用

•1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼

•1993 基因工程西红柿在美国上市

•1997 英国爱丁堡罗斯林研究所 多莉羊

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•1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%

•2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图

•2001.2.11 公布人类基因组基本信息

6. 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程

第二节 DNA操作技术

一. DNA的分离，提取

1. 材料的选择：物种、组织的选择

2. 组织匀浆：细胞分散、破碎

3. 破碎细胞： SDS表面活性剂

4. 除蛋白： 蛋白酶K、酚、氯仿抽提

5. 除RNA： RNA酶

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6. DNA回收： 乙醇、异丙醇沉淀7. 纯度鉴定： （1） 电泳：常用琼脂糖凝胶电泳，也用聚丙烯酰胺凝胶电泳，用溴化乙锭（EB）染色，紫外灯下检测。

检测量可达ug，ng级

检测信息：DNA的有无

DNA的大小

构象

纯度

（2）纯度检测：

紫外吸收法（260nm）

OD260 ---- 决定DNA的量

OD280 ---- 决定Protein的量

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1.8 ≤ OD260/280 < 2.0 纯样品

< 1.8 不纯

≥ 2.0 RNA（纯）

二. 限制性内切酶图谱

（1）限制性内切酶的发现

阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖。

•1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成 •原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 •识别和切割序列：中心对称的回文结构。 •限制性酶：HindⅡ •Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。

（2）限制性内切酶的定义：特异性的识别某些核酸序列，并将切断的酶（双链）。

（3）DNA物理图谱：

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定义:指DNA链的限制性酶切片段的排列顺序,即酶切片段在DNA链上的定位。

（4）意义:

基因定位

基因重组

剪接

DNA测序

三. DNA突变分析

1. DNA → RNA → Protein → 性状 碱基改变后，或会影响蛋白质的形成，→ 关键部位，或无改变 ——非关键部位。

2. DNA结构变化：点突变、缺失、扩增

3. RFLP—限制性内切酶多态性分析（ Restriction Fragment Length Polymorphisms ）

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制作方法：酶切—电泳—（转膜—杂交）—分析

4. AFLP—扩增片段长度多态性分析 （Amplified Fragment Length Polymorphism）

制作方法：酶切—加接头—PCR—电泳—分析。

RFLP、AFLP用于突变分析的局限性： 突变必须发生于酶切位点区域，否则检测不到。

5. SSCP—单链构象多态性分析 （Single strand conformation polymorphism）

（1）基本原理：

单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率不同。

（2）基本过程是:

①PCR扩增靶DNA;

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②PCR扩增 产物变性；

③ 聚丙烯酰胺凝胶电泳;

④显 色分析结果.

若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构 象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.

（3）局限性：

只有突变位点影响其空间构象才能被检出来。检出率：70%

6. DGGE—变性梯度凝胶电泳 ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

DNA片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝 胶中自上而下所含变性剂浓度呈梯度增加。DNA片段在进入变性剂某一浓度时，此浓 度下DNA片段在最低温度解链区域解链(Tm值)，此时DNA分子成分枝状 结构，它使DNA分子在胶中的移动减慢。如果梯度条件选择恰当，因单个碱基变化使不同的DNA片段在凝胶中的不同位置分叉，随后DNA片段移动减慢，从而使DNA片段 最终分离开来。

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变性梯度胶凝电泳能够将具有单个碱基差别的DNA分子分离开来。点突变检出率可达100%，但操作复杂，技术要求较高。

四. 核酸的凝胶电泳

自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制性内切酶作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。

1. 基本原理

带有电荷的分子在电场作用下的迁移速度，叫电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，在无反应活性的稳定的支持介质中，与分子的摩擦系数成反比。也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数越多，分子越小，其迁移的速度越快，反之越慢。因此，根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所携带的净电荷数的多寡，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分分离开来。核酸带负电荷，放置在电场中，会向正极方向迁移。相同碱基数量的双链DNA分子几乎带有等量的净电荷，能以同样的速度向正极方向迁移。在一定电场强度下，电泳的迁移率取决于核酸分子大小和构型，可以通过电泳将核酸分子混合物中大小不同的片段分离开来。

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2. 琼脂糖凝胶电泳

（1.） 凝胶的分辨能力同凝胶的浓度和类型有关。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海澡产物琼脂中提取出来。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度由琼脂糖的浓度决定。

凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力就随之减弱。

（2） 琼脂糖凝胶的分辨范围：0.2~50kb

（3） 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围：1~1000bp

（4.） 溴化乙锭染色

在凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭染料对核酸分子进行染色，然后将电泳标本放置在紫外光下观察，可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05ug的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。把含有DNA分子的凝胶浸泡在溴化乙锭的溶液中，或是将溴化乙锭直接

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加到DNA的凝胶介质中，此种染料便会在一切可能的部位与DNA分子结合，然而却不能与琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶相结合，因此，只有DNA分子能吸收溴化乙锭并发出荧光。在适当的染色条件下，荧光强度与DNA片段的大小或数量成正比。

五. 核酸的分子杂交

将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源片段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系，而DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

1. Southern blotting杂交中常用的滤膜：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜、二乙氨基乙基纤维素滤膜

2. 主要步骤：

（1）将核酸样品转移到固体支持物滤膜上

（2）将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。

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杂交的具体步骤是将含有经电泳分离的不同相对分子质量DNA片段的琼脂糖凝胶，通过碱变性等预处理之后平铺在已用电泳缓冲液饱和了的滤纸上，在凝胶上部覆盖一张待用的滤膜。接着加一叠干滤纸，最后再压上一重物。这样，由于干滤纸的吸引力，凝胶中的单链DNA便随着电泳缓冲液一起转移。这些DNA分子一旦与滤膜接触，就会被吸附在上面，而且严格地保留了它们在凝胶中的谱带模式。在80℃下烘烤或用紫外线胶联发，就能将DNA片段永久地固定在滤膜上（图5-6）。然后，将滤膜放到加有放射性同位素标记的探针溶液中进行杂交。这些探针是与被吸印DNA序列互补的RNA或单链DNA，一旦与滤膜上的单链DNA杂交之后，就很难再解链。因此，可以用漂洗法去掉游离的没有杂交上的探针分子，用X底片暴光后得到放射自显影图片。

六. 细菌转化

1. 转化作用 transformation

通过自动获取或人为地供给外源DNA使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型

的过程.

2. 基本过程

所谓细菌转化，是指一中细菌由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特

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征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫供体菌株，接受转化DNA的菌株则被称为受体菌株。

大肠杆菌是细菌转化实验这的常用材料。将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液这，便会造成细胞膨胀，并与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。立即将该体系转移到42℃下作短暂的热处理，复合物并会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化因子。

利用噬菌体颗粒能够有效地将DNA注入寄主细胞中这一特点，科学家又发明了重组体DNA分子的体外包装法。经包装的基因工程噬菌体能够借助细菌表面的噬菌体接受器位点将DNA注入受体细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。

七. 核苷酸序列分析

DNA测序(Sequence)

基本原理: 先进行末端标记，作为长度参考位置，把核苷酸的序列测定。

1.Sanger双脱氧链终止法

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1977年，英国剑桥生化学家Sanger 等人发明。

Sanger首先提出“加减法”，后又对其进行了改进→双脱氧链终止法

原理：利用DNA聚合酶I的聚合反应，在反应混合物中加入模板、放射性标记的引物，DNA聚合酶I和四种dNTP，另外加入一定比例的2’, 3’-ddNTP, 当合成时ddNTP参与后，链将不能再延伸而停止。

注意：样品中加入一定比例的ddNTP。 dNTP / ddNTP = 1：50 或 1：100

该方法又叫引物合成法或酶催引物合成法。它利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催化反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2′，3′-双脱氧核苷酸作为底物，将其掺入到寡核苷酸链的3′-末端，从而终止DNA链的生长。

在DNA测序反应中，加入模板DNA、特意性引物、DNA聚合酶、dNTP和一种ddNTP，当这种2′，3′-ddNTP（图5-9，ddTTP）掺入到寡核苷酸链的生长末端，取代了dTTP之后，由于ddTTP没有3′-末端，寡核苷酸链不再继续延长，在本该由dTTP掺入的位置上发生了链有效终止。如果在同一个反应中，加入一种带

32P

放射性标记的dNTP。那么，

经过适当的温育之后，将会产生不同长度的DNA片段混合物，它们都具有同样的5′-末端，

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并在3′-末端的ddNTP处终止。将这种混合物加到变性凝胶上进行电泳分离，就可以获得一系列全部以3′-末端ddNTP为终止残基的DNA片段的电泳谱带模式。分别加入ddATP、ddGTP和ddCTP，在不同的试管中温育后，点样于同一变性凝胶上进行电泳分离，再通过放射自显影的方法检测单链DNA的放射性带，就利益直接读出DNA的核苷酸序列。

（图5-10） 在每一个凡庸管中，都加入一种互不相同的ddNTP和全部种dNTP，其中一种带有

32P

放射性标记。反应混合物加到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，电泳凝胶

用X底片作放射自显暴光，产生出可见的谱带。从胶的底部开始判读谱带，逐渐读向顶部。所得出的核苷酸序列，是同模板链5′—3′方向的碱基顺序互补。图中*号表示放射性标记的核苷酸

2. Maxam-Gilbert化学修饰法

1977年，由美国哈佛大学Maxam和Gilbert发明。

原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性修饰和切断，产生一组具有各种不同长度的DNA链的混合物，经电泳分离和放射性自显影后，便可读出待测DNA片段的核苷酸序列。

通常用的化学试剂是硫酸二甲酯和肼

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其作用原理是：

（1） 破坏糖环相连的碱基，将碱基从糖环上切除；

（2） 进一步从这一位置将磷酸二酯键断裂。

（图5-11）：（a）用T4多核苷酸激酶标记DNA限制性片段的5′-末端，或用T4DNA聚合酶标记其3′-末端；（b）将32P-末端标记的DNA片段（单链的或双链的）分成4个反应管，进行化学切割反应；（c）将切割反应物加到聚丙烯酰胺序列胶上，进行电泳分离，经放射自显影后在X底片上显现出可判读的谱带。

*号表示32P标记的核苷酸。由于在聚丙烯酰胺凝胶中，相对分子质量小的DNA片段迁移速度快，因此在本例中跑在所有带的最前面，亦即是凝胶底部的带是单核苷酸分子A，第二条带是二核苷酸分子A-C，其余类推。因为硫酸二甲酯特异性地切割G，而甲酸则特异性地切割G和A，因此具G-末端的DNA片段，在G反应和G+A反应序列胶中，都将出现一条G带。同理，由于肼在NaCl条件下专门切割C，而无NaCl时专门切割T和C，所以具有C末端的DNA片段，在C反应和T+T反应序列胶中，都将出现一条C带。

3. DNA序列分析的自动化

传统的测序方法通用、有效，但操作步骤繁琐、效率低、速度慢。

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DNA序列分析的自动化 “分析反应”自动化，“读片过程”自动化

（1） 标记物——四甲基若丹明 tetramethylrhodamine

（2） 读取——在电泳凝胶的侧面，固定一个激光通道小孔，安装荧光信号接收器。

（3） 双脱氧法——ddNTP分别用四种不同颜色的荧光标记。

八. 基因扩增（PCR技术）

1. 定义

又称体外基因扩增法，在体外（试管、反应管中）将要研究的目的基因或DNA片段在短时间内扩增上百万倍，称为DNA聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ，PCR ）

2. 发展简史

1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想： “经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

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1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 发明了聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中进行DNA的体外合成。

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR 。

1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。 ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

3. 基本原理

第一步 “加热变性”：高温下使DNA的双链解开成为两条单链DNA分子；

第二步 “退火” ：引物附着到模板DNA两侧；

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第三步 “延伸”：DNA聚合酶在适当的反应温度下促使核苷酸依次按与模板碱基互补配对原则，在引物3‘端一个个地连接上去，直至形成一个完整的DNA分子。

（图5-16）：（a）起始材料，双链DNA；（b）反应混合物加热后发生链分离，降温使引物结合到待扩增靶DNA区段两端的退火位点上；（c）Taq DNA聚合酶以单链DNA为模板在引物的引导下利用反应混合物中的dNTPs合成互补的新链DNA；（d）将反应混合物再次加热，使旧链和新链分开；（e）重复（b）；（g）重复（c）……

4. PCR反应所需成分：

（1）DNA模板

（2）引物（前、后）

（3） dNTP（dATP、 dTTP 、dCTP 、dGTP ） （4）反应缓冲液

（5）Mg++

（6）DNA聚合酶

反应要求引物的量远远大于模板的量， Why？

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保证引物与模板配对的可能性大于模板与模板配对的可能性。

5. 特点：

（1） 扩增产物的长度及位置由引物确定；

（2）特异性（取决于引物的特异性） （3.）灵敏性（扩增效率）

理论上: 2n （230=109）

实际 : 106 ~ 107

6. 应用：

（1）PCR产物的克隆；

（2）检测（疾病、突变、育种、法医

鉴定、生物进化、分类等）

（3）多态性分析

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7. 常见问题：

污染（试剂、实验室、样品）

酶活性及种类

第三节 基因克隆的主要载体系统

一.名词

1. 克隆（clone）

(1)细胞学定义，即无性繁殖，从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。

(2)分子生物学定义，指将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，是之得以永久保存和复制的过程。

2. 基因克隆 gene cloning 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结

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合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝

3. 载体 vector

（1）概念：能在宿主细胞中进行自我复制和表达外源 DNA 。

（2）分类：克隆载体、表达载体、原核载体、真核载体

（3）载体的基本要求：

①复制单位;

②克隆位点(多个单克隆位点);

③筛选标记;

④分子量尽可能小;

⑤ 外源DNA插入后不影响载体本身的复制.

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没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造.

二.常用的克隆载体：

1. 质粒 plasmid

2.λ-噬菌体 λ- phage

3.M13

4.柯斯质粒 cosmid

1. 质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 。

（1）理想的质粒

拷贝数多;

两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lac Z) 筛选标志 ；

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多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)

（2）大小 2~10kb；

（3）优点：易于操作、保存；

（4）缺点：转化效率较低，一般10 6-7 clone/1ug

（5）转化方法：化学法、电转

（6）应用：

① 小基因组的克隆

②单一序列的克隆( 目的基因的克隆)

2. λ噬菌体(λphage)

特点：一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型为双链线状DNA分子，长度48.5kb, 分子两端各有一个12bp组成的粘性末端, 感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环, 连接处称COS位点。

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（1） 本身有复制体系;

（2） 中间(J-N间) 是λ生长非必需区, 可被其它外源DNA取代; （3） λDNA在体外可包装成病毒颗粒, 感染效率高;

（4） 载体容量大,可装入大片段外源DNA (20kb);

（5） 可人工加入多克隆位点;

（6） 筛选容易——噬菌斑筛选;

（7） 主要用于DNA文库构建.

3. M13噬菌体

一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb, 感染大肠杆菌后, ssDNA 转变为dsDNA, 可用作克隆载体.

最大优点：产生单链DNA, 可制备单链DNA探针.

4. 粘性质粒(cosmid)

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是一种人工改造的载体,双链环状DNA， λDNA的 cos区+质粒，克隆容量：40 ~ 50kb

（1） λ-DNA的COS位点;

（2） 质粒的复制起点和抗药性标记 (Ampr);

（3） 多种单一的酶切位点.

cosmid较小, 约4 – 6kb, 可容纳40-45kb的外源DNA, 重组体可象噬菌体一样进行外壳装配, 形成噬菌体颗粒, 感染大肠杆菌效率比质粒高得多, 进入宿主细胞后, 只能象质粒一样扩增, 并依赖抗药性被筛选.

优缺点:

（1）克隆效率高;

（2）可利用质粒DNA的方式扩增;

（3）可克隆较大DNA片段;

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主要用于真核基因的克隆, 基因组文库构建

（4）缺点: 产生串联现象。5. pBR系列

来源于Psc101、colE1和RSF2124三个天然质粒改造重组而成， pBR322是应用最多的大肠杆菌质粒载体，用氯霉素扩增法可使质粒DNA占细胞DNA总量的50%，这对制备大量质粒DNA极为有利。

6. pUC系列

pUC系列质粒（ pUC 8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的许多特性，一般2.7kb. 含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。

筛选指示系统—蓝白斑筛选

在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）和底物x-gal，IPTG诱导LacZ表达产生ß-半乳糖苷酶，使x-gal水解，产生兰色化合物，形成兰色菌落；

当插入外源片段，使LacZ基因失活，形成无色菌斑。

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第四节 基因的分离与鉴定

一. 基本步骤

（1）用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA分子的片段化；

（2）外源DAN片段与载体分子的体外连接；

（3）将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞；

（4）重组体分子的转化子克隆的选择或筛选

二. 重组体分子导入受体细胞的途径

1. 原核细胞和低等真核细胞：转化、转导

2. 高等真核细胞：显微注射、 电穿孔

三. 克隆基因的分离

1. 看家基因（house-keeping gene）

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以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动的基因。

2. 发育调控基因（developmental regulated gene）

以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化的基因。

3. 基因的差别表达（differential expression）

不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式。

4. 克隆基因的分离主要方法：mRNA差别显示PCR（DDRT-PCR）

第三章 生物信息的传递（上）——从DNA到RNA

重点：1. 启动子与转录起始

2. 原核生物和真核生物mRNA的特征比较

3. 内含子的剪接、编辑及化学修饰

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难点：1. 启动子与转录起始

2. 终止和抗终止

3. 内含子的剪接、编辑及化学修饰

课时分配：6学时

第二节 启动子与转录起始

大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相互作用主要包括启动子区的识别、酶与启动子的结合及因子的结合与解离等。

1. 启动子的基本结构

（1.）启动子：是一段位于结构基因5 ′端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的相结合并具有转录起始的特异性。

基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效地形成二元复合物，所以，RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之结合是转录起始过程中首先要解决的问题。

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我们知道，转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达水平。

（2）转录单元：是一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。

RNA聚合酶从转录起点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。在细菌中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。

(3)转录起点：是指与新生RNA链地一个核苷酸相对应DNA链上的碱基。

常常把起点前面，即5′末端的序列称为上游，而把其后面即3′末端的序列称为下游。在描述碱基的位置时，一般用数字表示，起点为+1，下游方向依次为+2、+3等，上游方向依次为-1、-2、-3等。

启动子区是RNA聚合酶的结合区，其结构直接影响到转录的效率。那么，启动子区有什么结构特点呢？

（4）绝大部分启动子都存在-10区和-35区

-10区：在-6~-13bp之间，共同序列为TATAAT，又称pribnow框，酶在此处与DNA

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结合成稳定的复合物，在转录方向上解开双链形成开放型起始结构。

-35区：共同序列为TTGACA，是RNA聚合酶起始识别区，这一识别过程与σ因子有关。

研究发现，在原核生物中，绝大部分启动子都有以下共同的结构：在大约位于转录起点上游10bp处，有一段共同的序列，其碱基组成为TATAAT，是RNA聚合酶紧密结合的位点，一般称为-10区。在大约位于转录起点上游35bp处，有一段共同的序列，其碱基组成为TTGACA，是RNA聚合酶起始识别区，一般称为-35区。在大约位于转录起点上游25bp处，有一段共同的序列，其碱基组成为TATAAA，称为TATA区，是RNA聚合酶紧密结合的位点。另外，在大约位于转录起点上游70bp处，有一段共同的序列，其碱基组成为CCAAT，称为CAAT区，它与原核生物的-35区相对应，是RNA聚合酶起始识别区。

2. 启动子的识别

一般认为，RNA聚合酶并不与直接识别碱基对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。在启动子区DNA双螺旋结构中，存在着氢键的供体与受体，它们分别处于DNA分子的大沟或小沟内，因此具有特定的方位。而酶分子中也有处于特定空间构象的氢键供体与受体，当它们与启动子中对应的分子在一定距离内相互补时，就形成氢键，相互结合。

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3. 酶与启动子区的结合

研究表明，在RNA聚合酶与启动子相互作用的过程中，聚合酶首先与启动子区闭合双链DNA相结合，形成二元闭合复合物，然后经过解链得到二元开放复合物。解链区一般在-9~+13之间，而酶与启动子区结合的主要区域在其上游。一旦开链区解链，酶分子就能以正确的取向与解链后的有关单链相互作用，形成开链复合物。因此，RNA聚合酶既是双链DNA结合蛋白，又是单链DNA结合蛋白。DNA开链是按照DNA模板序列正确引入核苷酸底物的必要条件。

4. -10区和-35区的距离

在原核生物中，-10区和-35区相距约20bp，大致是双螺旋绕两周的长度，两个结合区在分子的同一侧面。小于15bp或大于20bp都会降低启动子的活性。保持启动子这二段序列以及它们之间距离是十分重要的，否则就会改变它所控制基因的表达水平。

5. 增强子及其功能

除了启动子以外，近年来还发现另一序列与转录的起始有关。它不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的起始，除去这一序列会大大降低基因的转录水平。把这一序列称为增强子。

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（1）增强子：能使与它连锁的基因转录频率明显增强的DNA序列，是基因表达的重要调节元件。

（2）作用机制：通过改变模板DNA的整体结构（影响DNA-Pro复合物的结构或改变DNA超螺旋密度），从而使RNA聚合酶更容易与模板DNA相结合，起始基因转录。 eg.形成Z-DNA，增强子才有功能。 一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激附近的任一启动子。无论把增强子放在转录起点上游或下游，它都有转录增强作用。

（3）特点：

A. 增强效应明显（10 – 200倍）；

B. 增强效应与其位置和取向无关；

C. 大多为重复序列，一般约为50bp；

D. 增强效应有严密的组织和细胞特异性，只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；

E. 没有基因专一性。

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6. 真核生物启动子对转录的影响

真核基因的启动子在-25~-35区含有TATA序列，称为TATA区（TATA box），在-70~-80区含有CCAAT序列（CAAT box），在-80~-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GC box）。习惯上将TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件（UPE）或上游激活序列（UAS）。

（1.）原核和真核基因转录起始点上游区的结构差异

比较原核和真核基因转录起始点上游区的结构，发现两者之间存在很大差别，主要表现在以下方面：

A. 原核基因启动区范围较小，TATAAT的中心位于-7~-10，上游-30~-70为正调控因子结合序列，+1~-20为负调控因子结合序列；真核基因的调控较大， TATAAT的位于-20~-30，-40~-110区为上游激活区。

B. 原核基因启动子上游只有TTGACA作为RNA聚合酶的主要结合位点，参与转录调控；真核基因除了CAAT外，大多数还有GC区和增强子区。

（2）启动子区对转录的影响

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TATA区和其它两个UPE区的作用有所不同。前者的主要作用是使转录精确地起始，如果除去TATA区或进行碱基突变，转录产物下降的相对值不如CAAT区或GC区突变后明显，但发现所获得的RNA产物起始不固定。研究SV40（猿猴病毒40）晚期基因启动子发现，上游激活区的存在与否，对该启动子的生物活性有着根本性影响。若将该基因5′上游-21~-47核苷酸序列切除，该基因完全不表达。

CAAT区和GC区主要控制转录起始的频率，基本不参与起始位点的确定。CAAT区对转录起始频率的影响最大，该区任一碱基的改变都将极大地影响基因的靶转录强度，而启动区其他序列中一二个碱基的置换则没有太大的影响。此外，在CAAT区和相邻的两个UPE区之间插入核苷酸也会使转录减弱。例如，在人类β-血红蛋白基因启动区的两个UPE区之间插入15个核苷酸，该启动子完全失去功能。所以，启动子区对转录的影响归纳起来有以下几点：

A． TATA区主要是使转录精确的起始。

B． CAAT区和GC区主要控制转录起始的频率，基本不参与起始位点的确定。

C． CAAT区对转录起始频率的影响最大，该区任一碱基的改变都将极大地影响基因的靶转录强度。

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D．在CAAT区和相邻的两个UPE区之间插入核苷酸也会使转录减弱。

第三节 原核生物和真核生物mRNA的特征比较

一. 原核生物mRNA的特征

1. 原核生物mRNA的半衰期短。

细菌基因的转录与翻译是紧密相联的，基因转录一旦开始，核糖体就结合到新生的mRNA链的5′端，启动蛋白质合成，而此时该mRNA的3′端还远远没有转录完。

绝大多数细菌mRNA的半衰期短短得惊人，mRNA的降解紧随着翻译过程发生。现在一般认为，转录开始1分钟之后，降解就开始了。也就是说，当一个mRNA的5′端开始降解时，其3′端部分可能仍在合成或翻译。但mRNA降解的速度比转录或翻译的速度慢，大约只有转录或翻译的速度的一半。

因为基因转录和多肽链延伸的速度基本相同，所以细胞内某一基因产物的多少决定于转录和翻译的起始效率。在细胞中，新生mRNA与成熟mRNA受核酶攻击的概率是相等的。所以，有些mRNA可能被翻译很多次，而同一群体中的另一些mRNA可能根本没有被翻译。虽然mRNA的命运是随机的，但某一mRNA的产物却是大致稳定的。

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2. 许多原核生物mRNA以多顺反子的形式存在

细菌mRNA可以同时编码不同的蛋白质，我们把只编码一个蛋白质的mRNA称为单顺反子，把编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子。多顺反子是一组相邻或相互重叠基因的转录产物。单顺反子：只编码一个蛋白质的mRNA。

多顺反子：编码多个蛋白质的mRNA。是一组相邻或相互重叠基因的转录产物。

所有mRNA都包括：编码区、位于AUG之前的5′端上游非编码区、位于终止密码子后不翻译的3′端下游非编码区。编码区从起始密码子AUG开始，经一连串编码氨基酸的密码子直到终止密码子。对于第一个密码子来说，一旦mRNA的5′端被合成，翻译起始点即可与核糖体相结合，而后面几个顺反子翻译的起始就会受其上游顺反子结构的调控。

多顺反子翻译存在两种情况：一种情况是，当两个顺反子之间距离较远时，第一个蛋白质合成终止以后，核糖体分解成大、小亚基，脱离mRNA模板。第二个蛋白的翻译必须等到新的小亚基和大亚基与该蛋白起始密码子相结合后才可能开始（图3-12a）。另一中情况是，当两个顺反子之间距离较近时，前一个多肽翻译完成以后，核糖体大、小亚基分离，但小亚基不离开mRNA模板，而是迅速与游离的大亚基结合，启动第二个多肽的合成（图3-12b）。

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在多顺反子中，后面几个顺反子翻译的起始受其上游顺反子的调控。

在噬菌体RNA中，一个顺反子的翻译有时完全取决于它前面顺反子的翻译，因为噬菌体RNA往往形成复杂的二级结构，只要第一个翻译起始位点是暴露的，在这个顺反子翻译产生多肽的过程中，核糖体的运动破坏了后续顺反子的二级结构，使起始位点较容易与核糖体相结合形成起始复合物。（图3-12）。

3. 原核生物mRNA的5′端无帽子结构，3′端没有或只有较短的poly（A）

原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一个被称为SD序列的保守区。3′端既非常保守，又高度自我互补，能形成“发卡”结构。

二. 真核生物mRNA的特征

凡是编码功能蛋白的真核基因都通过RNA聚合酶II进行转录，真核基因几乎都是单顺反子，只包含一个蛋白质的信息，其长度在几百到几千个核苷酸之间。一个完整的基因，不但包括编码区，还包括5′和3′端长度不等的特异性序列，它们虽然不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要作用。真核生物mRNA在结构上的最大特征是5′端的帽子和3′端的poly（A）结构。

1.真核生物mRNA的5′端存在帽子结构

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真核生物mRNA的转录一般从嘌呤（A或G）起始。但成熟的mRNA的5′端是以5′—5′三磷酸基团相连的二核苷酸，5′端是一个在mRNA转录后加上去的甲基化的鸟嘌呤。（图3-15）

（1） mRNA5′端加“G”的反应是由腺苷酸转移酶完成的。

在新生的mRNA链达到50个核苷酸之前，甚至可能在RNA聚合酶II离开转录起始位点之前，帽子结构就已经加到mRNA的第一个核苷酸上了。或者说，mRNA几乎一诞生就是戴上帽子的。一般认为，帽子结构是GTP和原mRNA 5′三磷酸腺苷缩合反应的产物，新加上的G与mRNA连上所有其他核苷酸方向正好相反，像一顶帽子倒扣在mRNA链上。

（2） mRNA的帽子结构常常被甲基化。

第一个甲基出现在所有真核细胞的mRNA中，有鸟苷酸-7-甲基转移酶催化，称为0号帽子。帽子结构的第二步是在第二个核苷酸（原mRNA5′的第一位）的2′-OH上加一个甲基，这步反应由2′-O-甲基转移酶催化。称为1号帽子。真核生物中以这类帽子为主。当mRNA原第二位核苷酸是腺嘌呤时，其N6位有时也被甲基化，这个反应只以带有1号帽子的mRNA为底物，称为2号帽子。有2号帽子的mRNA只占有帽mRNA总量的10-15%以下。

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（3）帽子结构可能使mRNA免遭核酸酶的破坏。

例如，去除珠蛋白mRNA 5′端的7-甲基鸟嘌呤后，该mRNA分子的翻译活性和稳定性都明显下降。而且，有帽子结构的mRNA更容易被蛋白质合成的起始因子所识别，从而促进蛋白质的合成。用化学方法除去5′端的甲基后，mRNA作为蛋白质合成模板的活性消失，说明mRNA5′端甲基化的帽子是翻译所必须的。（4）5′端帽子结构的功能

保护mRNA免受5’-核酸外切酶降解； 使mRNA进入细胞质； 对翻译起

识别作用（m7G5’ppp5’Np优先与核糖体结合）。

2. 绝大多数真核生物mRNA具有poly（A）尾巴

（1）真核生物mRNA的加尾反应.

真核基因的3′端转录终止位点上游15-30bp处的保守序列AAUAAA对于初级转录产物的准确切割及加poly（A）是必需的。尽管poly（A）和AAUAAA的存在对于基因的转录和成熟意义重大，但RNA聚合酶II却不在poly（A）位点终止，而是继续转录0.5-2kb核苷酸序列。加poly（A）时需要内切酶切割mRNA的特定部位（CA——GU）序列中的A下游，然后由poly（A）合成酶催化多聚腺苷酸的反应。如果将保守序列AAUAAA切除，该基因组合的转录活性消失。点突变使AAUAAA变AAGAAA，虽然维持了该基因的

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转录活性，却发现mRNA的剪接加工受阻，因而没有功能性mRNA产生。

（2）poly（A）尾巴的功能

poly（A）是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的形式，它大大提高了mRNA的稳定性。当mRNA刚从细胞核进入细胞质时，其poly（A）尾巴一般比较长，随着mRNA在细胞质内逗留的时间延长，poly（A）逐渐缩短消失，mRNA进入降解过程。

第四节 终止和抗终止

RNA聚合酶起始基因转录后，它就会沿着模板5′—3′方向不停地移动，直到碰到终止信号时才与摸板脱离并释放新的RNA链。终止发生时，所有参与形成RNA-DNA杂合体的氢键都必须被破坏，摸板DNA链才能与有意义链重新组合成DNA双链。

1.不需要ρ因子的转录终止——强终止子

特点：DNA序列有双重对称，形成末端发夹结构，模板DNA上有一串A， RNA3’

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端有UUUU，使新合成的RNA脱落。

摸板DNA链上存在终止转录的特殊信号—终止子，每个基因或操纵子都有一个启动子和终止子。终止位点上游一般存在一个富含GC序列的二重对称区，由这一段转录产生的RNA容易形成发卡结构。在终止位点前有一段由4-8个A组成的序列，所以转录产物的3′端为寡聚U，这种结构的存在决定了转录的终止。在新生RNA链中出现发卡结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5′端的正常结构。寡聚U的存在使的存在的3′端部分出现不稳定的rU.rA区域。两者共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，随着发卡结构和寡聚U序列长度的增加，终止效率逐步提高。

2. 需要ρ因子的转录终止

特点：终止子后无连续的A， 在ρ因子作用下，ATP酶水解，释放能量，使新生RNA与模板脱落。

RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5′—3′方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA 3′—OH端取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，使之从摸板DNA链上释放mRNA，完成转录过程。

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（图3-18）1. RNA聚合酶沿摸板移动 2.ρ因子依附在RNA链的5′端 3.ρ因子沿RNA链运动，跟踪RNA聚合酶 4. ρ因子赶上在终止位点暂停的RNA聚合酶 5. 终止

3. 抗终止

由于不同的生理要求，在转录过程中有时遇到终止信号，仍然需要继续转录，于是就出现了抗转录终止现象。

抗转录终止主要有两种方式：

（1）破坏终止位点RNA的茎-环结构

在一些控制氨基酸合成的操纵子结构基因前面有一段前导序列，具有终止信号，中间有串联的编码某一氨基酸的密码子，由于转录与翻译是偶联的，转录产物mRNA形成后立即通过核糖体指导蛋白质合成，当介质中该氨基酸浓度较高时，与此相对应的氨酰tRNA的含量也高，因此，核糖体能顺利通过串联密码子。在这种情况下，mRNA形成正常的二级结构，其中包括末端的茎-环结构，RNA聚合酶终止转录。当介质中该氨基酸浓度较低时，缺乏相应的氨酰tRNA，致使核糖体滞留在串联密码子上，mRNA不能形成正常的二级结构，末端的茎-环结构被破坏，因此转录仍能进行下去，出现转录的抗终止现象。

（2.）依赖于蛋白质因子的转录抗终止

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λ噬菌体中由N基因编码产生的N蛋白具有抗终止的作用，其功能的发挥依赖于寄主所产生的NusA、NusB、S10等蛋白质。NusA以而聚体的形式存在，其一个亚基与RNA聚合酶结合，另一个亚基与N蛋白结合，当其它蛋白都结合到Nut位点时，便形成一个蛋白复合物，并通过NusA改变聚合酶的构象，使之对终止信号不敏感，继续催化RNA链的合成。

第五节 内含子的剪接、编辑及化学修饰

一. RNA中的内含子

真核基因大多是断裂基因，一个基因可由多个内含子和外显子间隔排列而成。因而真核基因的表达往往伴随着RNA的剪接过程。

1. 外显子extron：（在DNA或成熟mRNA中都存在的序列）

2. 内含子intron：在DNA上存在，而在mRNA（或cDNA）中不存在的序列，初级转录产物加工成成熟mRNA时被切除的间隔序列。

3. RNA中的内含子的证据

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4. 基因内含子的特点： （1）内含子是真核生物独有的，但并不是所有真核基因一定有内含子；（组蛋白基因家族） （2）内含子的数量和长度对不同的基因不同，一般基因越长，内含子越多； （3） 在同一基因家族中，编码序列在进化过程中一直比较保守，而内含子变化迅速，差异较大； （内含子变异较外显子大）

（4）内含子与外显子间的连接处有特殊的序列（序列GT——AG）。高度保守序列 不连续基因剪接成mRNA可能遵照一种通用机制。

（5） 一个基因的内含子可以是另一个基因的外显子。 （阅读框和剪切方式不同）

5. 内含子可能的功能:

（1）调控转录速度；

通过与启动子、起始位点的精确碱基配对，阻止或增强RNA聚合酶的活性，从而调控转录。

（2） 内含子具有各种剪接信号，使用不同的剪接方式形成不同的成熟mRNA ；

二. RNA的剪接

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1. 参与剪接的小分子物质

核内RNA（如U1，U2，U4，U5和U6）

以及与这些RNA相结合的核蛋白（snRNPs）。

2.剪接过程

3. 真核生物内含子5’剪接位点和3’剪接位点的保守顺序

在RNA的剪接过程中，如何进行正确的剪接呢？内含子5′端和3′端有特殊的保守序列，多数情况下，其5′端是GU，3′是AG，少数是AU—AC，这在进化上是相当保守的。

三. RNA的编辑和化学修饰

1. RNA编辑(RNA editing)：DNA上不存在，在RNA产物中插入或删除几个碱基的现象。

类型：

(1)U的插入和删除；

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(2)G/C/A的插入（改变其阅读框）；

(3)C—U互变 改变密码子，构建终止密码

2. 大多数mRNA中缺少适当的、完整的起始密码，不能正确起始翻译，经编辑后可生成成熟mRNA.

3. RNA编辑是基因表达的一种转录后调控机制

第四章 生物信息的传递（下）——从mRNA到蛋白质

重点：1. 蛋白质前体的加工

2. 蛋白质合成抑制剂

3. 蛋白质运转机制

难点：1. 蛋白质前体的加工

2. 蛋白质运转机制

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课时分配：4学时

第四节 蛋白质合成的生物学机制

五. 蛋白质前体的加工

新生的多肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。

1. N端fMet或Met的切除

细菌蛋白质N端的甲酰基能被脱甲酰化酶水解，不管是原核生物还是真核生物N端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕之前就被切除。有些动物病毒如脊髓灰质炎病毒的mRNA可翻译成很长的多肽链，含多种病毒蛋白，经过蛋白酶在特定位置上水解后得到几个有功能的蛋白质分子。

（图4-19）左：新生蛋白质在去掉N端的部分残基后，变成有功能的蛋白质；右：某些病毒或细菌可合成无活性的多聚蛋白质，经蛋白酶切割后成为有功能的成熟蛋白质。

2. 二硫键的形成

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mRNA中没有胱氨酸的密码子，而不少蛋白质都含有二硫键，这是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的。3. 特定氨基酸的修饰

（1）氨基酸侧链的修饰包括磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化。

（2.）生物体内最常见的被修饰的氨基酸残基及其修饰产物。

（3.）蛋白质N-糖基化的主要场所是内质网。

糖蛋白主要是通过蛋白质侧链上的天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基加上糖基形成的，胶原蛋白上的脯氨酸和赖氨酸多数是羟基化的。4. 切除新生肽链这非功能片段

（1.）前胰岛素原蛋白翻译后成熟过程示意图

新合成的胰岛素前体是前胰岛素原，必须先切去信号肽变成胰岛素原，再切去C-肽，才变成有活性的胰岛素。其它多肽类激素或酶原如血纤维蛋白原、胰蛋白原都要经过类似的加工。

（2.）蜂毒蛋白的加工

蜂毒素能溶解动物细胞，也能溶解蜜蜂自身的细胞，所以只能在细胞内合成没有活性

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的前毒素，分泌进入刺吸器后，其N-端的22个氨基酸残基被蛋白酶水解，生成有毒性的功能蛋白质。

六. 蛋白质合成抑制剂

1. 常见的真核生物蛋白质合成抑制剂

（1）抗生素类：嘌呤霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素等。

（2）蛋白类：5-甲基色氨酸、环己亚胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖体灭活蛋白

（3）只对原核细胞发生作用的抗生素：青霉素、四环素、红霉素

（4）能对真核生物和原核生物都发生作用的抗生素：嘌呤霉素、氯霉素

2. 几种蛋白质合成抑制剂的作用机制 （1.）嘌呤霉素——aa-tRNA类似物，提前终止肽链翻译；

嘌呤霉素是aa-tRNA的结构类似物，，能结合在核糖体的A位上，抑制aa-tRNA的进入。它所带的氨基与aa-tRNA上的氨基一样，能与生长中的肽链上的羧基反应生成肽键，这个反应的产物是一条3′羧基端挂上一个残基的小肽，肽酰嘌呤霉素随后从核糖体上解离

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下来，所以嘌呤霉素是通过提前释放肽链来抑制蛋白质合成的。（2）7-甲基鸟苷酸m7Gp——抑制真核细胞翻译起始，与帽子结构竞争CBP

（3.）白喉毒素——催化EF2与ADP—核糖结合，使EF2完全失活，有效抑制细胞蛋白质合成，进而导致细胞死亡。（白喉酰胺—His）(4)链霉素——干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读。 抗菌素对蛋白质合成的作用可能是阻止mRNA与核糖体结合（氯霉素），或阻止AA-tRNA与核糖体结合（四环素），或干扰AA-tRNA与核糖体结合而产生错读（链霉素等），或作为竞争性抑制剂抑制蛋白质的合成。

链霉素是一种碱性三糖，能干扰fMet-tRNA与核糖体结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致mRNA的错读。若以多聚（U）作为摸板，则除苯丙氨酸（UUU）外，异亮氨酸（AUU）也会被参入。

七. RNA分子在生物进化中的地位

（1）RNA比相应DNA序列含有更多的遗传信息，可以通过剪接、改变和校正阅读框等方式表达出多种蛋白质异构体，还可能通过逆转录产生与RNA信息相一致的DNA分子，直接影响后代的基因型。

（2）RNA还是获得性遗传的分子基础。

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获得性遗传：是指有机体在生长发育过程中由于环境的影响而不是基因突变所形成的新的遗传性状。

第五节 蛋白质运转机制.在生物体内，蛋白质的合成位点和功能位点常常被一层或多层细胞膜所隔开，这样就产生了蛋白质运转的问题。核糖体是真核细胞内合成蛋白质的场所，几乎在任何时候，都有数以百计或千计的蛋白质离开核糖体并被运输到细胞质、细胞核、线粒体、内质网和溶酶体、叶绿体等各部分，补充和更新细胞功能。由于细胞各部分都有特定的蛋白质组分，因此合成的蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。

蛋白质是怎样从合成部位运送到功能部位的？它们又是如何跨膜运送的？跨膜之后又是依靠什么信息到达各自岗位的？对于膜蛋白来说，究竟是什么因素决定它是外周蛋白还是内在蛋白，是部分镶嵌还是跨膜分布，在膜的外侧还是在膜的内侧？这些都是十分有趣的问题，也是生物膜研究中非常活跃的领域。

一般说来，蛋白质运转可分为两大类：若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的，则属于翻译运转同步机制；若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转，则属于翻译后运转机制。这两种运转方式都涉及蛋白质分子内特定区域与细胞膜结构的相互关系。分泌蛋白大多是以翻译-运转同步机制运输的。在细胞发育过程中，由细胞质进入细胞器的蛋白质大多是以翻译后运转机制运输的。而参与生物膜形成的蛋白质，则依赖于上述两种不同的运转机制

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镶入膜内。

一. 翻译和运转同步的机制

一般认为，蛋白质定位的信息存在于该蛋白质自身结构中，并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达，这就是信号肽假说的基础。

1. 信号肽 signal peptide

是新合成的蛋白质N端的一段13~36个氨基酸残基的疏水性肽段.蛋白质进入内质网腔内后，被信号肽酶切除。

信号肽在结合核糖体上合成后便与膜上特定受体相互作用，产生通道，允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构。因此，这种方式是边翻译边运转。

2.信号肽的特点

（1）一般带有10~15个疏水性氨基酸；

（2）在靠近该序列N端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸；

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（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链。

3.信号肽假说

同细胞质中其他蛋白质的合成一样，分泌蛋白的生物合成开始于结合核糖体，当翻译进行到大约50~70个氨基酸残基后，信号肽开始从核糖体的大亚基露出，被粗糙内质网膜上的受体识别，并与之结合。信号肽过膜后被内质网腔内的信号肽酶水解，正在合成的新生肽随之通过蛋白孔道穿越疏水的双分子层磷脂。一旦核糖体移到mRNA的终止密码子，蛋白质的合成即告完成，翻译体系解散，膜上的蛋白孔道消失，核糖体重新处于自由状态（图4-29）。

4.信号肽在蛋白质运输过程中的作用

（1）完整的信号肽是保证蛋白质运转的必要条件。

信号肽中疏水性氨基酸变成亲水性氨基酸后，会阻止蛋白质运转而使新生蛋白质以前体形式积累在细胞质中。

（2）仅有信号肽还不足以保证蛋白质运转的发生。

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把麦芽糖运转蛋白中完整的可水解的信号序列加到β-半乳糖酶上，发现杂种蛋白质仍以前体形式留在细胞质内。所以说，要使蛋白质顺利跨膜，还要求运转蛋白质在信号序列以外的部分有相应的结构变化。蛋白质运转的信号可能要长于被蛋白酶降解的信号肽链。

（3）信号序列的切除并不是运转所必需的。

如果把细菌外脂蛋白信号序列中的甘氨酸残基突变成天冬氨酸残基，则能抑制该担保信号序列的水解，但不能抑制其跨膜运转。

（4）并非所有的运转蛋白质都有可降解的信号肽。

5.同步转运的主要过程

新生肽向内质网腔运转过程中，SRP（信号识别蛋白）和DP（停靠蛋白，又称SRP受体）介导了蛋白质的跨膜运转过程。SRP能同时识别正在合成需要通过内质网膜进行运转的新生肽和自由核糖体，它与这类核糖体上新生蛋白的信号肽结合，导致了该多肽合成的暂时终止。SRP-信号肽-多核糖体复合物即被引向内质网膜并与SRP受体—DP相结合。只有当SRP与DP相结合时，多肽合成才恢复进行，信号肽部分通过膜上的核糖体及蛋白质运转幅户物跨膜进入内质网腔，新生肽链重新开始延伸。整个蛋白跨膜以后，信号肽被水解，形成高级结构和成熟型蛋白质，并被运送到新颖细胞器。SRP与DP的结合很可能

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导致受体聚集而形成膜孔道，使信号肽及与其相连的新生肽得以通过。此时，SRP与DP相分离并恢复游离状态。带翻译过程结束后，核糖体的大、小亚基解离，受体解聚，通道消失，内质网也恢复完整的脂双层结构。进入内质网腔后，蛋白质常以运转载体的形式被送入高尔基体或形成运转小泡，分别运送到各自的亚细胞位点。

（图4-30）主要步骤：

（1）核糖体组装、翻译起始；

（2）位于蛋白质N端的信号肽序列首先被翻译；

（3）SRP与核糖体、GTP以及带有信号肽的新生蛋白质相结合，暂时终止肽链延伸；

（4）核糖体-SRP复合物与膜上的受体相结合；

（5）GTP水解，释放SRP进入新一轮循环；

（6）肽链重新开始延伸并不断向腔内运输；

（7）信号肽被切除；

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（8）多肽合成结束，核糖体解离并恢复到翻译起始前的状态。

二. 翻译后运转机制

叶绿体和线粒体中有许多蛋白质和酶是由细胞质提供的，其中绝大多数以翻译后运转机制进入细胞器内。

1. 线粒体蛋白的跨膜运转

线粒体是细胞的动力站，它虽然含有遗传物质（DNA、RNA）以及核糖体等等，但是它的DNA信息含量有限，大部分线粒体蛋白质都是由核DNA编码的，在细胞质自由核糖体上合成，被释放至细胞质，再跨膜运转到线粒体各部分。与分泌蛋白通过内质网膜进行运转不同，通过线粒体膜的蛋白质是在合成以后再运转的。

线粒体蛋白跨膜运转的特征：

（1）通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体的形式存在，它由成熟蛋白质和位于N端的一段前导肽共同组成。

（2）蛋白质通过线粒体膜的运转是一种需能过程。

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（3）蛋白质通过线粒体膜运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与Hsp70或MSF等分子伴侣相结合的待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。

蛋白质跨膜运转时的能量来自线粒体Hsp70引发的ATP水解和膜电位差。（图4-31）

2. 前导肽的作用与性质

拥有前导肽的线粒体蛋白质前体能够跨膜运转进入线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白质，失去继续跨膜的能力。因此，前导肽对线粒体蛋白质的识别和跨膜运转起着关键性的作用。

前导肽的特性：

（1）带正电荷的碱性氨基酸含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基撒序列之间；

（2）缺少带负电荷的酸性氨基酸；

（3）羟基氨基酸含量较高；

（4）有形成既亲水又疏水α-螺旋结构的能力。

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带正电荷的碱性氨基酸在前导肽中有重要的作用，如果它们被不带电荷的氨基酸所取代，就不能发挥牵引蛋白质过膜的作用。

3. 叶绿体蛋白的跨膜运转

叶绿体多肽是在细胞质中游离核糖体上合成后脱离核糖体并折叠成具有三级结构的蛋白质分子，多肽上某些特定位点结合于只有叶绿体膜上才有的特异受体位点。叶绿体定位信号肽一般有两部分，第一部分决定蛋白质是否进入叶绿体基质，第二部分决定蛋白质是否进入类囊体。

特点：

（1）活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内。

叶绿体膜能够特异性地与叶绿体蛋白的前体结合。

（3）叶绿体蛋白质前体内可降解序列因植物和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。

三. 核定位蛋白的运转机制

在细胞质中合成的蛋白质一般通过核孔进入细胞核。所以核糖体蛋白都首先在细胞质

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中被合成，运转到细胞核内，在核仁这被装配成40S和60S核糖体亚基，然后运转回细胞质中行使蛋白质合成机器的功能。RNA、DNA聚合酶、组蛋白、拓扑异构酶及大量转录、复制调控因子都必须从细胞质进入细胞核才能正常发挥功能。

在绝大部分多细胞真核生物中，每当细胞发生分裂时，和膜被破坏，等到细胞分裂完成后，核膜被重新建成，分散在细胞内的核蛋白必须被重新运入核内，因此，为了核蛋白的重复定位，这些蛋白质的信号肽——核定位序列（NLS）一般都不被切除，它可位于核蛋白的任何部位。

1. 核定位蛋白跨细胞膜运转的过程

蛋白质向核内运输需要一系列循环于核内和细胞质的蛋白因子，包括核运转因子α、β和GTP酶（Ran）。α和β组成的异源二聚体是核定位蛋白的可溶性受体，与核定位序列相结合的是α亚基。有上述3个蛋白组成的复合体停靠在核孔处，依靠Ran GTP酶水解GTP提供能量进入细胞核，α和β亚基解离，核蛋白与α亚基解离，α和β分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。（图4-34）

2. 细菌中蛋白质的跨膜运转

细菌中新翻译产生的蛋白质与细胞质中的分子伴侣SecB相结合后就能被运送到细胞

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膜运转复合物SecA-SecYEG上，结合有新生肽的SecA在自身ATP酶活性作用下水解ATP并嵌入细胞膜之中，导致与SecA相结合的被运转蛋白N端约20个氨基酸通过膜运转复合物到达胞外。SecA再与另一个ATP相结合，变构嵌入膜内的同时再次把所运转蛋白的第二部分运出胞外，如此反复，直到把所运转蛋白全部送到胞外。

四. 蛋白质的降解

生物体内蛋白质的降解过程是一个有序的过程。在大肠杆菌中，蛋白质的降解是一个依赖于ATP的蛋白酶（Lon）来实现的。当细胞中出现错误的蛋白质或半衰期很短的蛋白质时，该酶就被激活。Lon蛋白酶每切除一个肽键要消耗2个ATP。

在真核生物中，蛋白质的降解依赖于泛素，该蛋白只有76个氨基酸残基，序列高度保守。生物细胞内即将被降解的蛋白首先在ATP的作用下与泛素相连。这个过程需有E1、E2、E3三个降解因子参与。一旦被降解蛋白与泛素相连接，这个复合体接能被运送到相对分子质量高达1X106的蛋白降解体系中直到完全降解。

第六章 基因的表达与调控（上）

——原核基因表达调控模式

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重点：1. 原核基因表达调控总论

2. 色氨酸操纵子与负控诱导系统

3. 乳糖操纵子与负控诱导系统

4. 转录后调控

难点：1. 色氨酸操纵子与负控诱导系统

2. 乳糖操纵子与负控诱导系统

课时分配：8学时

第一节 原核基因表达调控总论原核生物及单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中，食物供应无保障，只有根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。高等真核生物代谢途径和食物来源都比较稳定，但由于它们是多细胞有机体，在个体发育过程中出现细胞分化，形成各种组织和器官，而不同类型的细胞所合成的蛋白质在质和量上都是不同的。因此，不论是真核还是原核细胞，都有一套准确地调节基因表达和蛋白质合成的机制。

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1. 组成型蛋白质（constitutive protein）

在代谢过程中十分必需的酶或蛋白质，其合成速率不受环境变化或代谢状态的影响。

2. 适应型或调节型蛋白质（adaptive or regulated protein ）

这类蛋白质的合成速率明显地受环境的影响而改变。

3. 基因表达（gene expression）

以RNA为模板翻译成蛋白质的过程。4. 基因表达调控（gene regulation or control ）

对基因表达过程的调节。

5. 基因表达调控主要表现在以下两个方面：

（1）转录水平上的调控（transcriptional regulation ）

（2）转录后水平上的调控（post-transcriptional regulation ）

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包括：

①mRNA加工成熟水平上的调控

②翻译水平上的调控

6. 原核生物与真核生物转录及翻译调控的不同

（1）原核生物中，营养状况和环境因素对基因表达起着举足轻重的影响。

（2）在高等真核生物中，激素水平和发育阶段是基因表达调控的主要手段，营养状况和环境因素的影响不大。

（3）原核生物的转录与翻译几乎同时发生，即转录与翻译相偶联。

（4）真核生物中，转录产物只有从核内运到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质。

一.原核生物调控机制的类型与特点1. 原核生物基因表达调控模型——操纵子模型 操纵子（operon）：由几个相关的结构基因及其控制区组成，是基因表达的协同单位。

操纵子的两个类型：

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诱导型

阻遏型

2. 原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为负转录调控和正转录调控。

（1）在负转录调控中，调节基因的产物是组遏蛋白，起着阻止结构基因转录的作用。

①负控诱导

在负控诱导系统中，组遏蛋白不与效应物结合时，结构基因不转录。正常情况下基因不表达或表达水平低，在环境改变或诱导物存在时，才开放转录。（乳糖操纵子、半乳糖操纵子） ②负控组遏

在负控组遏系统中，组遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。正常情况下开放，当阻遏物出现时操纵子关闭。（色氨酸操纵子、组氨酸操纵子）

组遏蛋白作用的部位是操纵区。（2）在正转录调控中，调节基因的产物是激活蛋白。

可根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导系统和正控组遏系统。

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①正控诱导系统

效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态。

②正控组遏系统

效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。

二. 操纵子(operon)的基本组成

1. 结构基因（structural gene, SG ）

操纵子中被调控的编码蛋白质的基因。

2. 启动子(promoter, P)

是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵元至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5‘侧上游，控制整个结构基因群的转录。3. 操纵区（operator，O）

是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重

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叠，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱。

4. 调控基因（regulatory gene）是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。

与操纵子结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白（repressive protein），其介导的调控方式称为负性调控（negative regulation）；与操纵子结合后能增强或起动其调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白（activating protein），所介导的调控方式称为正性调控（positive regulation）。

5. 终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。

在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。

第二节 乳糖操纵子与负控诱导系统

一. 大肠杆菌乳糖操纵子的组成

由三个结构基因和一个调节基因、操纵基因、启动子构成：

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Z基因—— 编码 半乳糖苷酶

Y基因—— 编码 半乳糖苷透性酶

A基因—— 编码 半乳糖苷乙酰化酶

调节基因I —— 编码阻遏蛋白

操纵基因Ｏ

启动子P

启动区结合，通过操纵区向右转录。转录从区中间开始，按、Y、方向进行，每

次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因，转录的调控是在启动区和操纵区进行的。

二. 酶的诱导——lac体系受调控的证据当培养基中无乳糖及其它诱导物时，抑制基因表达产生阻遏蛋白，与操纵基因结合，阻止结合在启动子上的RNA聚合酶向前移动，转录不能进行；

当培养基中有乳糖及其它诱导物时，诱导物与阻遏蛋白结合而不能与操纵基因结合，基因转录。

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主要诱导物是乳糖

三. 影响因子

1. 阻遏物lac I基因产物及功能

（1） lac I转录产生阻遏物单体，结合形成同源四体。

（）lac I同源四体与区D相结合，阻遏基因转录。

诱导物使lac I变成不能与O区相结合的非活性形式。RNA聚合酶与 lac I启动区结合，起始基因转录。 mRNA被转录成3个蛋白质。

2. 葡萄糖对lac操纵子的影响

当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖而不利用乳糖；只有当葡萄糖耗尽后，经一段停滞期，在乳糖诱导下β-半乳糖苷酶开始合成，细菌才能充分利用乳糖的现象。

大肠杆菌生长在含葡萄糖的培养基上时， β-半乳糖苷酶等分解代谢的活性很低，研究发现cAMP能解除葡萄糖的阻遏作用3. cAMP与代谢物激活蛋白

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CRP-环腺苷酸受体蛋白

cAMP-环一腺苷酸

当CRP与cAMP结合后酶被活化，作用于启动子前的CRP结合位点上，使RNA聚合酶容易结合到启动子上，促进转录的进行。

广泛存在于动、植物组织中的cAMP是在腺苷酸环化酶的作用下由ATP转变而来的，在真核生物的激素调节过程中起着重要作用。在大肠杆菌中，cAMP的浓度受葡萄糖代谢的调节。如果将细菌放在缺乏碳源的培养基中培养，细胞内cAMP浓度就高；如果在含葡萄糖的培养基中培养，细胞内cAMP浓度就低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途径的碳源，细胞内cAMP浓度也会很高。

大肠杆菌中的代谢物激活蛋白CRP（由Crp基因编码）能与cAMP结合形成复合物。CRP和cAMP都是合成Lac mRNA所必需的，凡Crp及腺苷酸环化酶基因突变的细菌都不能合成Lac mRNA。当CRP与cAMP结合后酶被活化，作用于启动子前的CRP结合位点上，使RNA聚合酶容易结合到启动子上，促进转录的进行。

四. 半乳糖苷酶基因表达的条件：

CRP结合位点 —— CRP与cAMP结合，使RNA聚合酶识别-35和-10区；

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启动子识别 —— RNA聚合酶识别启动子序列；

操纵基因 —— 阻遏蛋白结合乳糖或类似物

五. 结构基因转录的调控方式：

负调控——没有调节蛋白时操纵子内结构基因表达，加入调节蛋白后操纵子内结构基因的活性被关闭。（阻遏蛋白对乳糖操纵子的负调控）

正调控——没有调节蛋白时结构基因的活性关闭，加入调节调节蛋白后结构基因的活性被开启。（cAMP-CRP是一个正调节因子）

第三节 色氨酸操纵子与负控诱导系统

一. 大肠杆菌trp操纵子的组成

由七个结构基因和一个调节基因、操纵基因、启动子、前导区、 弱化子区构成：

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E和G基因— 编码邻氨基苯甲酸合成酶D基因— 编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶

A和B基因—分别编码色氨酸合成酶的α 、亚基调节基因R — 编码辅阻遏蛋白，距trp基因簇很远

操纵基因Ｏ

启动子P

前导区trpL 弱化子区trpα

二. trp操纵子的阻遏系统

trpR基因突变常引起trp mRNA的组成型合成，该基因产物因

此被称为辅阻遏蛋白。辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并关闭trp mRNA的转录。

2. 当培养基中色氨酸含量较高时，它与游离的辅阻遏蛋白相结合，并使之与操纵区DNA紧密结合，关闭trp mRNA的转录。

3. 当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏物失去色氨酸并从操纵区上解离， trp操纵子去阻遏，trp mRNA开始转录。

三. 弱化子与前导肽

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1. 弱化子

位于trp mRNA5′端trpE基因的起始密码前，调节已启动转录的trp操纵子是否继续下去的特定区域。

（1）粗调开关

阻遏操纵机制，主管转录是否启动

阻遏操纵机制对色氨酸来说只是一个一级开关，主管转录是否启动，相当于trp操纵子的粗调开关。

（）细微调控

决定已启动的转录是否继续下去，色氨酸的浓度起决定作用。

trp操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有另一个系统进行细微调控并决定已启动的转录是否继续下去。细微调控是通过转录达到第一个结构基因之前的过早终止来实现的，细胞中色氨酸的浓度是实现过早终止的根本原因。

2. 前导区

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在trp mRNA5ˊ端trpE基因的起始密码前长162bp的mRNA片段。

参与操纵子的转录弱化机制。

前导区中123-150位碱基序列如果缺失，trp基因表达可提高6-10倍。当mRNA合成起始后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因的转录。

3. mRNA前导区的序列分析

trp前导区的碱基序列中4个分别以1、2、3、4表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对（图6-22），有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3的方式配对。3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，当这个区域发生破坏自我配对的碱基突变时，有利于转录的继续进行。

4. 转录弱化作用

转录的弱化理论认为，mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，前导肽的翻译对tRNATrp的浓度敏感。当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNATrp也就少，这样翻译通过两个相邻的色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻

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的色氨酸密码子出），这时的前导区结构是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到将trp操纵子中的结构基因全部转录。而当培养基中色氨酸的浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样就使2-3不能配对，3-4区可以自由形成茎-环状终止子结构转录停止，trp操纵子中的结构基因被关闭而不再合成色氨酸。弱化子对RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。

第四节 其它操纵子

一. 半乳糖操纵子

1. 半乳糖操纵子的组成

由三个结构基因和一个调节基因、操纵基因、启动子构成：

E基因—— 编码 半乳糖苷异构酶

T基因—— 编码 半乳糖1-磷酸尿嘧啶核苷转移酶

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K基因—— 编码 半乳激酶

调节基因R —— 编码阻遏蛋白

操纵基因Ｏ

启动子P

2. 半乳糖操纵子与乳糖操纵子的不同

（1）二者三个结构基因编码的产物不同。

（2）半乳糖操纵子调节基因R与结构基因E、T、K基因簇距离很远；乳糖操纵子的调节基因I与结构基因Y、Z、A只隔一个操纵区和启

动区。

（3）半乳糖操纵子有两个启动子，mRNA从两个不同的起始点开始转录；乳糖操纵子只有一个启动子， mRNA只能从一个起始点开始转录。

（4）半乳糖操纵子有两个O区，不在P区与结构基因之间，一个在P区上游-67~-53

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的地方，另一个在结构基因E的内部；乳糖操纵子只有一个O区，在P区与结构基因之间

（5）半乳糖操纵子 的主要诱导物是半乳糖；乳糖操纵子 的主要诱导物是乳糖。3. cAMP-CRP 对gal启动子的作用

半乳糖操纵子P—O区的碱基序列中有两个相距仅为5bp的启动子，半乳糖操纵子可以从两个启动子分别起始基因转录，每个启动子拥有各自的RNA聚合酶的结合位点S1和S2。

（1） cAMP-CRP 对从S1和S2起始的转录有不同的作用。

从S1起始的转录只有在培养基中无葡萄糖时才能顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CRP和较高浓度的cAMP；从S2起始的转录则完全依赖于葡萄糖，高水平的cAMP-CRP能抑制从S2起始的转录。

（2）当有cAMP-CRP 时，转录从S1开始，当无cAMP-CRP 时，转录从S2开始。

cAMP-CRP有利于RNA聚合酶-S1复合物形成开链构象，从而起始基因转录。同时，由于S1和S2的核苷酸部分重叠，这一复合物的存在干扰了RNA聚合酶-S2复合物的形成，抑制从S2起始的转录。

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4. 双启动子的生理功能

半乳糖不仅可以作为惟一的碳源供细胞生长，还是大肠杆菌细胞壁组成物质—尿苷二磷酸半乳糖的前体。当培养基中有葡萄糖存在时，不依赖于cAMP-CRP 的启动子S2进行本底水平的组成型合成；当培养基中无葡萄糖时，半乳糖诱导依赖于cAMP-CRP 的启动子S1进行高水平的合成。

二. 阿拉伯糖操纵子

1. 阿拉伯糖操纵子的组成

（1）三个结构基因：araB、araA、araD，简写为araBAD。araB—核酮糖激酶

araA—L-阿拉伯糖异构酶

araD—L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶

（2）与araBAD相邻的是一个复合的启动子区域、两个操纵区（O1，O2）和一个调节基因araC。2. araC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。而在lac和gal操纵子中，阻遏蛋白只能作为负调节因子，cAMP-CRP只能作为正调节因子。

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3. araBAD和araC基因的转录是分别在两条连上以相反的方向进行。 araBAD基因簇从启动子PBAD开始向右进行转录，而araC基因则从Pc向左转录。4. araC蛋白的正、负调节作用

（1）当体系中葡萄糖水平较高，阿拉伯糖葡萄糖水平较低， araC蛋白起负调节作用。

（2）当体系无葡萄糖存在，只有阿拉伯糖时， araC蛋白起正调节作用。

（6-28阿拉伯糖操纵子的表达调控）1.当细胞内没有araC蛋白时，由Pc启动子起始araC基因的转录；2. 当体系中葡萄糖水平较高，阿拉伯糖葡萄糖水平较低时，araC蛋白与操纵区O2以及araI的上半区相结合，形成DNA回转结构，araBAD基因不表达；3. 当体系无葡萄糖存在，只有阿拉伯糖时，araC与阿拉伯糖相结合，改变构象成为激活蛋白，araC同源体分别与ara O1和araI区相结合，DNA回转结构被破坏，RNA聚合酶在araA蛋白和cAMP-CRP的共同作用下起始PBAD所调控的结构基因表达。

三. 多启动子调控的操纵子

1. rRNA操纵子（P1，P2）

大肠杆菌rRNA操纵子上有两个启动子P1和P2，在对数生长期中，P1起始的转录产物比P2起始的产物多3-5倍，所以，P1是强启动子。当细菌处于紧急状态时，如氨基酸

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饥饿条件下，细胞中ppGpp（鸟苷四磷酸）浓度增加，P1的作用被抑制。因为rRNA是细胞中蛋白质合成机器核糖体的重要组成部分，不能完全停止供应，由P2起始的rrnE基因转录就显得越来越重要。在贫瘠的培养基中，细胞增殖缓慢时，P2是合成rRNA的主要启动子。

2. 核糖体蛋白SI操纵子（P1，P2 ，P3，P4）

核糖体蛋白SI操纵子（rpsA），也受应急反应调节。RpsA有4个启动子，P1、P2是强启动子，平时主要依靠它们来启动基因的表达，合成SI蛋白。P3、P4是弱启动子，只有在紧急情况下，由P3、P4起始合成SI蛋白维持生命的最低需要。3. DnaQ蛋白操纵子（P1，P2）

DnaQ蛋白是DNA聚合酶全酶的亚基之一，其重要功能是较正DNA复制中可能出现的错误。这一操纵子受RNA聚合酶活性的调节，并有两个启动子。在RNA聚合酶活性较低时，操纵子的转录有弱启动子P2控制；当RNA聚合酶活性较高时，就开始利用强启动子P1。在细胞染色体复制比较缓慢时，RNA聚合酶活性往往较低，此时DnaQ蛋白的合成靠弱启动子P2来维持。当细胞增殖速度加快，RNA聚合酶活性升高，P1就被激活，DnaQ蛋白的合成就大大增加。

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第五节 固氮基因调控

1. 与固氮有关的基因及其调控

（1）nif AL基因控制了整个固氮酶系统的表达与活性。若突变nif A基因，固氮酶和其他所有已知的nif基因产物都会消失。

（2） nif A和nif L基因产物分别是nif操纵子的正、负调控因子。当细胞没有nif L蛋白质时， nif A基因产物足以激活其他nif 基因的表达。（3） nif操纵子的调节基因位于nif操纵子外，分别称为ntrB、ntrC和ntrA 。 nif A基因产物只有在ntrC和ntrA基因产物的共同作用下才能正常工作，激活nif操纵子。 ntrC基因的活性直接受NH3的影响， NH3浓度较高时， ntrC基因产物没有转录活性。

（4）ntr系统像固氮酶系统的粗调开关， nif AL系统像微调开关，两者共同作用控制nif基因的表达。

第六节 转录后调控基因表达的转录调控是生物最经济的调控方式。但转录生成mRNA以后，再在翻译或翻译后水平进行“微调”，是对转录调控的补充，它使基因表达的调控更加适应生物本身的需要和外界条件的变化。

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1. 翻译起始的调控

（1）RBS中的SD序列与核糖体的结合

遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的核糖体结合位点（RBS）。RBS是起始密码子AUG上游的一段非翻译区。在RBS中有SD序列，该序列与核糖体16SrRNA的3ˊ端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码子之间的距离。

（2）mRNA的二级结构

mRNA的二级结构也是翻译起始调控的的重要因素。因为核糖体的30S亚基必须与mRNA结合，要求mRNA的5ˊ端有一定的空间结构。SD序列的微小变化，往往会导致表达效率上百倍甚至上千倍的差异，这是由于核苷酸的变化改变了形成mRNA 5ˊ端二级结构的自由能，影响了核糖体30S亚基与mRNA的结合，从而造成蛋白质合成效率上的差异。

2. 稀有密码子对翻译的影响

细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用稀有密码子，基因翻译过程容易受阻，影响蛋白质合成的总量，从而调节蛋白质的合成。

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3. 重叠基因对翻译的影响

重叠基因通过翻译偶联来影响基因的表达

4. Poly（A）对翻译的影响

mRNA3端Poly（A）的长短对翻译效率的影响很大。成旺盛，随着Poly（A）变短，蛋白质合成能力逐渐变弱。.

（A）较长时，蛋白质合 Poly