液相色谱使用注意及保养

（一）峰型异常问题

峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。

1、色谱图中未出峰。解决方法：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。

2、一个峰或几个峰是负峰。解决方法：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。

3、所有峰均为负峰。解决方法：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。

4、所有峰均为宽峰。解决方法：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。 、

5、所出峰比预想的小。解决方法：样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确．定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。

6、出现双峰或肩峰。解决方法：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。

7、前伸峰。解决方法：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。

8、 。解决方法：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。

9、出现平头峰。解决方法：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。

10、出现鬼峰。解决方法：进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。

（二）液相色谱柱的使用注意事项及再生

1、色谱柱的使用说明：

（1）色谱柱使用前注意事项：

色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓

度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

（2）流动相：

流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。

以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。

（3）样品：

样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。

2、色谱柱的保存

（1）反相色谱柱每天实验后的保养：

使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的

甲醇，防止将填料冲塌陷。

（2）长期保存色谱柱：

如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。

3、色谱柱的再生

因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。

（1）反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。

（2）正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法

色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），以下列举了部分常见原因及解决办法：

（1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。

如果确认色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的，可选择以下方式进行补救：

1. 先在色谱柱前加上保护柱或在线过滤器，然后用甲醇/水＝20/80 1.0ml/min

反向冲洗色谱柱180min。

2. 先在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器，然后反向使用。

（三）防止强保留物质在色谱柱中存留

强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰形变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应，需要一定的时间才会体现出来，但对许多样品特别是复杂样品而言，很难判断其是否含有强保留物质，因此要防止强保留物质的累积，需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙腈清洗色谱柱。

清洗方法：

1. 未使用缓冲盐：每天分析完成后，用纯甲醇或纯乙腈反向冲洗色谱柱60min。

2. 使用过缓冲盐：分析完成后，先用上述方法除去缓冲盐，然后再用纯甲醇或乙腈反向冲洗色谱柱60min。

3. 补救方法：

水 —— 乙腈 —— 氯仿（或异丙醇）—— 乙腈 —— 水

每一步以1.0ml/min流速反向冲洗色谱柱60min。

比如纯水第二天就有长菌的可能，而甲醇：水=10：90则在5天左右可以看到长菌的状况，事实上只要柱子中有机相的比例大于50%，通常半年之内不会长菌，我公司常用的甲醇：水=75：25，一、两年也没有过长菌的现象。

色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

高效液相色谱柱在使用过程最容易碰到的问题就是柱压升高。如果柱压是在长时间使用过程中缓慢地增加，通常这属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：

（1）、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

（2）、色谱柱头的填料被样品污染；

（3）、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；

（4）、流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

解决办法如下：

（1）、当确定是色谱柱头的过滤筛板被污染时，卸下色谱柱头，将其放在30%在右的稀内用超声波超声清洗约10分钟，后再用超纯水超声约10分钟，重新装入色谱柱。

（2）、当断定是色谱柱头的填料被污染时，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

(3)、当断定是盐结晶时，用甲醇含量相对较低的甲醇-水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

（4）、如果因PH值使用不当，很难恢复。

色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。对于在正相条件下评价的色谱柱，如果使用的条件为反相时，请用一个中介流动相（如异丙醇）先置换掉柱内的储存液，然后再应用于反相条件，否则，会对色谱柱造成极大的伤害，将会明显地减少色谱柱的使用寿命。在反相色谱柱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，一定不要把色谱柱直接接上，应先用10%左右的低浓度的有机相洗脱剂过度一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机中很容易析出，而使色谱柱堵塞，无法恢复。

（四）做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?

答：原因可能有：1、泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；2、比例阀失效,更

换比例阀即可。3、泵密封垫损坏，更换密封垫即可。4、溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时

改变脱气方法；5、系统检漏，找出漏点，密封即可。6、梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么?

答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1、拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；

2、把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。

3、将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，(此时不要连接检测器，以防固体

颗粒进入流动性)。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4、更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂

或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂

商联系。一般情况下，

在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

过滤器，一般在液相里面出现的地方有三个。最前面的在溶剂瓶中，接在溶剂管路的头上，一般是不锈钢烧结材料的，也有是高分子材料的。可以过滤掉溶剂中的杂质。溶剂一般应该是很干净的，有机相使用色谱纯溶剂，水是去离子水，都是经过了0.22微米滤膜过滤的。缓冲溶液应该经过滤膜过滤后再使用。夏天，容易长霉菌，应该经常注意清洗，换溶剂的时候可以用手摸一下，如果摸上去滑滑的，肯定是脏了，清水里面超声即可，不行再加点酸。第二个出现过滤器的地方是泵后两相混合的地方，一般是为了防止两相溶剂混合后有析出情况，是和混合器合在一起的，也是一个烧结的不锈钢筛板，也应该定期清洗的。第三个会出现过滤器的地方就是柱前了，通常接的是保护柱，其最主要的作用就是保护后面昂贵的色谱柱。原理一个是会过滤掉流动相中的颗粒物，再就是遇到对色谱柱有伤害的溶剂时，牺牲自己，保护后面的色谱柱，前提是保护柱与后面的色谱柱是同一种颗粒的，其实，个人认为，这种情况几户不会发生，即使发生了，短短的一段保护柱，能否保护后面的色谱柱也很难说。色谱柱最大的敌人，还是流动相中出现的小颗粒物，正式基于这种思路，现在的UPLC，为了最大限度的减少管路死体积，采取了在线过滤器，以烧结不锈钢筛板代替保护柱，同样可以有效的保护后面的色谱柱。

1.容易出故障的HPLC配件：

2.（1）吸滤器：由不锈钢粉烧结而成，孔径为10 μm，流动相中的固体杂质（比如粉尘、微生物）、缓冲盐析出以及长时间在水中浸泡均会导致吸滤器上的孔隙堵塞。吸滤器堵塞的现象：高压泵工作时，吸滤器中不断涌出气泡(柱塞杆前本来就是负压环境，而液体

因吸滤器孔隙堵塞难以进入系统，这就形成了真空，涌入的气泡为真空或有机溶剂的蒸气而非空气)；解决办法：将吸滤器卸下，用有机溶剂反冲或用5%的HNO3超声清洗，如果仍不能解决应更换新的吸滤器。

3.（2）在线在过滤器：在线过滤器（一个筛板）位于柱塞泵的后面，流动相中的固体杂质以及柱塞杆与密封圈摩擦掉下的碎屑会使其堵塞。在线过滤器堵塞的现象：不连色谱柱，系统压力大于3 kg/cm2（约为0.3 Mpa）。解决办法：用5%的HNO3超声清洗，如果仍不能解决应更换新的筛板。

4.（3）单向阀：液相中的单向阀由红宝石球和球座构成，由于制作精致小巧，极易被颗粒物堵塞。单向阀的故障主要有两种，其一：红宝石球被杂质卡住无法实现密封，导致压力波动较大，解决办法：用异丙醇冲洗或取下单向阀用异丙醇超声清洗；其二：红宝石球被杂质堵塞，泵无法正常吸入流动相，解决办法：取下单向阀超声清洗或用注射器在排液口抽真空。由于材质较好，单向阀仅仅会发生上面的小故障，几乎不会发生损坏。

5.（4）柱塞杆密封圈：密封圈为橡胶材质，长期使用会因磨损而导致密封不良，使用缓冲盐时，如果冲洗不充分磨损会更快。现象：系统压力波动大或漏夜。措施：更换密封圈

6.（5）六通阀：组成复杂，是故障多发区，最常见的故障是泄漏。A进样时液体从塑料导针口漏出，原因：转子密封的孔径缩小，进样针的针尖未插入转子密封圈上的针密封；或者是虽插入针密封，但针密封不够紧密，解决办法：对于前一种情况，应取出转子密封，用22号针头穿过孔内，以增大孔径；对于后一种情况，用铅笔头上的橡皮挤压塑料导针口，压实针密封。b进样后液体漏出塑料导针口或通风管，原因：通风管出口与塑料导针口不在同一水平面上，虹吸使液体漏出。解决办法：调整通风管出口位置，使其与塑料导

针口处于同一水平面。

7.（6）流通池污染：以纯溶剂为流动相时，基线起伏不平，噪声较高，样品池与参比池能量相差较大，即可怀疑流通池污染。判定方法：波长设定为2 nm，通甲醇或水，查看SMPL EN和REF EN，如两者相差较大，则样品池受污。解决办法：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。

8.（五）应常备的HPLC配件：

9.（1）管路以及接头：不锈钢管路、螺帽和纫环，PEEK管路和PEEK螺帽；

10.（2）用于在线过滤的筛板；

11.（3）柱塞杆密封圈；

12.（4）液相进样针。

HPLC日常维护办法之一：压力异常

操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象，并在右侧的列表中参考相应的解决方法。

A、没有压力显示，没有流动相流动

原因 解决方法

1、电源问题 1、接通电源，开机

2、保险丝被烧坏 2、更换保险丝

3、控制器设定不正确或设定失败 3、a、采取恰当的设定 b、修理或更换控制器

4、柱塞杆折断 4、更换柱塞杆

5、泵头内有空气 5、溶剂脱气、启动泵抽出空气

6、流动相不足 6、a、补充流动相 b、更换入口滤头

7、单向阀损坏 7、更换单向阀

8、漏液 8、拧紧或更换手紧接头

B、流动相流动正常，但没有压力显示

原因 解决方法

1、仪表损坏 1、更换仪表

2、压力传感器损坏 2、更换压力传感器

C、压力持续偏高

原因 解决方法

1、流速设定过高 1、调整流速设定

2、柱前筛板堵塞 2、a、在允许情况下反冲色谱柱 b、更换筛板 c、更换色谱柱

3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀 3、a、使用恰当的流动相 b、冲洗色谱柱

4、色谱柱选择不当 4、选择恰当的色谱柱

5、进样阀损坏 5、清洗或更换进样阀

6、柱温过低 6、提高温度

7、控制器失常 7、修理或更换控制器

8、保护柱阻塞 8、清洗或更换保护柱

9、在线过滤器阻塞 9、清洗或更换在线过滤器