胶回收攻略

一、

这个回收小片断,我还比较在行,我以前的片断只有100bp 市售的试剂盒常常有小片断回收效率很低的问题。

PCR产物经过酶切、回收等步骤后，损失太大。进入连接反应的PCR片断量太小常常是试验失败的原因。

我的做法是，简化步骤、减少核酸在处理过程中的损失，让较多量的PCR产物和质粒片断进入酶连反应——以量取胜。我的做法是很粗放型的，但是成功率很高。如果愿意，你可以试试。

大致的做法是：制作100微升PCR产物；酒精沉淀回收PCR产物；PCR产物及载体酶切；跑回收胶；将回收胶上的PCR产物和载体片断切下，回收到一个试管中；冰冻、碎胶，酚、氯仿抽提，酒精沉淀；加入8微升水、1微升连接酶和1微升连接buffer，4度过夜；转化涂板。

具体的操作： PCR产物回收

1. 制备100μL PCR产物。

2. 将100μL PCR产物加入一1.5mL离心管中，再加入400μL双蒸水，颠倒混匀。加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。颠倒数次混匀。（提示 本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。） 3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。

4. 12000rpm 4℃ 离心15分钟，沉淀核酸。 5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）

酶切

直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系：

PCR产物酶切－制作插入片断 10×Buffer 6μL Sal I 5μL PCR产物 —— 双蒸水 49μL 合计 60μL

要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒（小提的质粒即可）3μL进行酶切。

A质粒酶切－制作载体片断 10×Buffer 3μL Sal I 1μL 质粒 3μL 双蒸水 23μL 合计 30μL

混匀。37℃，酶切3小时。

1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）

1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。

2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。） 3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。

4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。

5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的足够粗壮，不要用100μL的，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶。胶碎裂不够细密可再次冰冻后碎胶。） 6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。

7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。

8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。 9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。） 10. 弃上清，将离心管导致于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风）

连接

向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。）

目前我用的最好的是TAKARA的D301试剂盒我后面把说明书发来.

CLONTECH的NucleoTrap Gel Extraction Kit

用3M 的NaCl或NaAc将回收胶浸泡过夜，然后用乙醇沉淀，就可以了。 0mega

我刚做了100bp的回收，回收率能达到40％。以下几点建议： 1 尽量用新配制的TAE，（有人说TBE效果不好），但我用的是TBE

2 Qiagen说100bp片段在溶胶后要加入异丙醇，但我发现容易产生沉淀，堵柱子。但我不知Omega用的是什么溶胶液，你可以试一下：溶胶后加入与胶等体积的异丙醇，如用0.1g胶，加100ul异丙醇，再进行一下操作 3 回收的样品尽量上样多一点，我一般是用4ug/100ul

其实我没有用Qiagen的盒子，只是看了他的说明书。一般说来，各个公司的溶胶液中用的都是NaClO4，这种溶胶液加入异丙醇产生絮状沉淀，堵柱子。你试一下Omega的看看行不行？

其实最早的凝胶回收文献是在PNAS 1979的文章，用的是NaI，现在一般不用了，有毒。

古老的方法不好，如果Omega的盒子加入异丙醇沉淀的话，用尽量多的产物上样，总能得到一点纯化的带，够用就行了。 我做100bp，上样量4ug/100ul，最后用50ul水洗脱，回收率达10％，0.2ug/50ul，足够用了。

片段太小，很难操作，是不是可以试试如下策略：引入外源基因扩大PCR产物长度进行克隆，外源基因可以选取克隆载体上的片断，在其多克隆位点之外（复制子下游非必需区）的一个酶切位点之间的序列（再设计一条引物），用60bp的PCR产物和质粒做模板再进行PCR，获得包含60bp和部分载体序列连接的序列，然后再酶切克隆。当然中间的引物要合成一个5‘与载体序列一致的。 没做过，只是想法，供参考！

Qiagen gel kit can facilitate your job. 荐华舜的胶回收试剂盒回收效果好，经常回收完了只跑1微升电泳就能看到很浓的条带

说说我的吧,我是将胶割下来,然后放到用21-规格的针头戳个孔的0.5ml管,将其至于1.5ml的管中,最大速度离心将胶断裂成小的,然后加TE溶液在 65度作用2小时,或4度过夜,然后吸取溶液用乙醇,0.5倍体积的7.5M NH4Ac 沉淀,最好能加点肝糖原,效果停好的，我回收130和34bp的都这样,不烦试试!

如果你的PCR产物比较纯，可以直接沉淀。推荐一种PEG8000沉淀法，适用于浓度0.1ug/ml，长度26bp以上片段：

加入0.01倍DNA样品体积的1mol/L 氯化镁； 加入0.5倍DNA样品体积的 40% PEG8000,混匀； 室温沉淀10分钟

12000g室温离心10分钟。

70％乙醇洗涤，12000g室温离心5分钟； 同样条件再次洗涤。 重悬

这样，关于核酸回收，建议不用国产的，

当我们拆开用于吸附的柱子看看，一切就都明白了，

国产的就是３０－５０层滤纸，而进口的就是尼龙棉柱，这就是根本区别， 吸附为基础的柱子是因为沉淀的核酸有与尼龙柱特异结合的特性，这是胶回收，PCR回收，和质粒提取盒子的关键。

而国产柱子为了降低成本尤其是小公司自制的柱子，（最近就有一个北京的试剂商在我们科研究核酸回收试剂盒，叫梁平，四川人，不知北京战友有没有人认识），就是用滤纸代替尼龙柱，用超滤拦截沉淀的核酸分子，你想，这不是胡闹么，滤纸哪能截得住分子？这就是造成国产核酸柱子回收率降低的根本原因。

我也拆了几个国内公司的核酸回收试剂盒的柱子，不看不知道，一看吓一跳，全都是滤纸，只是有的层多一些有的层少一些。就没有一个是尼龙柱。尽管Omiga是立陶宛的公司，质量也稍微差劲，但是人家用的就是尼龙柱。

进口核算回收柱我最喜欢Roch的，效率很高。Gibico的也还可以。

也有战友说进口的柱子回收率也不高，原因在哪里呢？ 关键步骤：

１，溶胶要充分

２。温度不能太高，>５０Ｃ后磷酸基团自发脱落，会导致后续步骤的连接困难 ３。结合缓冲液，（含异丙醇，也有的试剂盒异丙醇后加），一定要反应充分，确保核酸彻底沉淀，异丙醇可以加过量，可以将试管在桌面上敲一敲，如果还有气泡产生就是反应不够充分，还应继续反应，直至没有气泡出现为止。

４。洗涤缓冲液中的乙醇一定要过量，使用时间长了乙醇要挥发，一定要酌情添加，否则，洗涤的时候，核酸就溶在洗涤缓冲液中丢了。

５。溶解缓冲液的量和PH值是否足够？有没有在室温下将其充分溶解？ 玻璃奶试剂盒

从低熔点凝胶提取DNA。

纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀）， 12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的 DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。 用低熔点胶电泳后切下含目的带的胶条，置液氮中处理几分钟，捣碎胶块，加入一定量的TE溶解之，再用酚/氯仿抽提取上清沉淀即可。 试剂盒回收若要提高大片段的回收率需要加入异丙醇。

二、乙醇沉淀是经典又经得起考验的方法，我们实验室以前专门买了一个OMEGA的回收小片段的kit，也不是很好用。后来还是试了乙醇沉淀的方法，2.5体积过夜沉淀，我回收过70bp的小带，做连接完全没有问题，楼主可以试试

三、一般的试剂盒对小片段的回收都没有很好的办法，但是会要求加入异丙醇等辅助试剂，你可以查看一下你的试剂盒的说明书。

另外，不知道你回收後用来做什么，如果不是测序的话，给你介绍一种简单的方法：

1. 清洁电泳槽等用具； 2. 用新配制的胶跑样品； 3. 回收，越小越好；

4. -20放置30min，使其结冰；

5. 室温放置一小会，待稍微软化后用头等将胶块捣碎； 6a. 用最高速度离心15min，取上清待用；

6b. 或将胶块转移到纯化柱上，直接离心，收集穿透液就可以了。 做酶切什么的完全没问题。